專利名稱：鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
甜菜是世界第二大糖料作物，是我國北方地區(qū)最主要的經(jīng)濟作物之一，在國民經(jīng)濟中占有重要的地位。甜菜生尾孢菌(Cercospora beticola Sacc.)引起的甜菜褐斑病是生產(chǎn)上最重要的葉部真菌病害，主要危害甜菜的葉、莖及種株的花序，但以葉片為主，破壞甜菜的光合作用器官，降低植株的光合作用，影響甜菜塊根的增大和糖分的積累，同時該病也可為害甜菜的塊根，加重儲藏期間塊根的腐爛。病害爆發(fā)流行時，可造成甜菜減產(chǎn)40%或以上，含糖量下降1-3度。由于抗病的甜菜品種產(chǎn)量、含糖量和經(jīng)濟效益較低，生產(chǎn)上普遍采用高產(chǎn)和含糖量較高的甜菜品種，然而這些品種抗褐斑病的能力普遍較低，因此化學(xué)防治是目前防治甜菜褐斑病、提高經(jīng)濟效益最有效的方法。多菌靈是當(dāng)前生產(chǎn)中防治甜菜褐斑病的主要藥劑之一，由于一些地區(qū)長期大量使用該類藥劑，甜菜褐斑病菌已對該藥劑產(chǎn)生了明顯的抗性。 因此檢測甜菜褐斑病菌對多菌靈的抗性情況，從而根據(jù)檢測結(jié)果指導(dǎo)田間合理用藥，能有效地延緩和治理病原菌對殺菌劑的抗藥性。已有研究發(fā)現(xiàn)，β-微管蛋白基因編碼的第198位或200位氨基酸的密碼子發(fā)生點突變是導(dǎo)致大多數(shù)病原菌對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的主要原因(Koenraadt H， Somerville SCand Jones AL, Characterization of mutations in the beta-tubulin gene of benomyl-resistantfield strains of Venturia inaequalis and other plant pathogenic fungi. Phytopathology 1992,82:1348-1354)。黃大昉等首先報道了我國甜菜褐斑病對多菌靈的抗藥性[黃大昉、王俠、周淑芝，等.甜菜褐斑病對苯并咪唑類等殺菌劑抗藥性研究.植物保護(hù)學(xué)報，1982，9 (2) :131-135]，而Davidson等首次報道了甜菜褐斑病菌菌株中β “微管蛋白基因編碼的第198位氨基酸的密碼子由GAG突變?yōu)镚CG，從而導(dǎo)致其所編碼的氨基酸由Glu(谷氨酸)突變?yōu)锳la(丙氨酸)，該突變降低了病原菌與苯并咪唑類殺菌劑間的親和力，致使菌株對苯并咪唑類殺菌劑表現(xiàn)出高水平的抗性(Davidson R Μ, Hanson L E andFranc G D et al. Analysis of b—tubulin Gene Fragments from Benzimidazole-sensitive and—tolerant Cercospora beticola. J. Phytopathology, 2006，154 :321-328)。發(fā)明人對2009年從田間收集到的64個甜菜褐斑病菌分離物(11個高抗菌株，53個敏感菌株)進(jìn)行了微管蛋白基因分析，高抗菌株的抗性突變與Davidson 等報道的結(jié)果一致。傳統(tǒng)的用于檢測病原菌對殺菌劑抗藥性的生物測定方法費時、費力，不能及時、準(zhǔn)確地為田間病害防治提供科學(xué)可靠地指導(dǎo)，因此，建立一種新的快速、準(zhǔn)確分子檢測方法， 準(zhǔn)確地檢測甜菜褐斑病菌對多菌靈的抗性具有重要的實際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的引物對。
本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的引物對， 由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的引物組合物。本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的引物組合物，由引物對A和引物對B組成；所述引物對A為所述的引物對；所述引物對B由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列3所示的引物組成。本發(fā)明所提供的弓丨物組合物中的引物對A的反向引物3 ‘末端堿基為G，使得其與抗性菌株β -微管蛋白基因的堿基C配對，而不能與敏感菌株β -微管蛋白基因的堿基A配對，引物對A的反向引物3'末端倒數(shù)第二個堿基為G，使得該反向引物與敏感菌株β-微管蛋白基因的兩個堿基產(chǎn)生錯位，在一定的PCR條件下只能擴增到抗性菌株微管蛋白基因的DNA片段；引物對B的反向引物3'末端堿基為Τ，使得其與敏感菌株β-微管蛋白基因的堿基A配對，而不能與抗性菌株β -微管蛋白基因的堿基C配對，引物對B的反向引物的3'末端倒數(shù)第二個堿基為Α，使得該反向引物與抗性菌株β-微管蛋白基因的兩個堿基產(chǎn)生錯位，在一定的PCR條件下只能擴增敏感菌株β-微管蛋白基因的DNA片段；引物對 A和引物對B的正向引物相同，該正向引物位于微管蛋白基因的第四個內(nèi)含子內(nèi)，是甜菜褐斑病菌微管蛋白基因的種特異性序列。本發(fā)明的又一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法，包括以下步驟以待鑒定真菌菌株的基因組DNA為模板，用所述的引物組合物中的引物對A進(jìn)行 PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物I ；同時，用所述的弓I物組合物中的引物對B進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物II ；檢測所述PCR擴增產(chǎn)物I和PCR擴增產(chǎn)物II，若所述PCR擴增產(chǎn)物I為493bp的片段，且所述PCR擴增產(chǎn)物II不為493bp的片段，則確定所述待鑒定真菌菌株為或候選為對多菌靈產(chǎn)生抗性的甜菜褐斑病致病菌；若所述PCR擴增產(chǎn)物I不為493bp的片段，且所述PCR擴增產(chǎn)物II為493bp的片段，則確定所述待鑒定真菌菌株為或候選為對多菌靈敏感的甜菜褐斑病致病菌。所述檢測所述PCR擴增產(chǎn)物I和PCR擴增產(chǎn)物II的方法為如下A)或B)所示A)將所述PCR擴增產(chǎn)物I和PCR擴增產(chǎn)物11進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)檢測結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性；B)將所述PCR擴增產(chǎn)物I和PCR擴增產(chǎn)物11進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性。所述A)中所述根據(jù)檢測結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法為若所述PCR擴增產(chǎn)物I在凝膠上顯示為400bp-500bp的條帶，且所述PCR擴增產(chǎn)物II沒有在凝膠上顯示為400bp-500bp的條帶，則確定所述待鑒定真菌菌株為或候選為對多菌靈產(chǎn)生抗性的甜菜褐斑病致病菌；若所述PCR擴增產(chǎn)物I沒有在凝膠上顯示為 400bp-500bp的條帶，且所述PCR擴增產(chǎn)物II在凝膠上顯示為400bp_500bp的條帶，則確定所述待鑒定真菌菌株為或候選為對多菌靈敏感的甜菜褐斑病致病菌。所述用所述的引物組合物中的引物對A進(jìn)行PCR擴增的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 1分鐘；然后按照下列參數(shù)進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)95°C變性45秒，65. 5°C復(fù)性30秒，72°C延伸45 秒；循環(huán)35次；循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后在72°C保持10分鐘；所述用所述的引物組合物中的引物對B進(jìn)行PCR擴增的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 1分鐘；然后按照下列參數(shù)進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)95°C變性45秒，64°C復(fù)性30秒，72°C延伸45秒； 循環(huán)35次；循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后在72°C保持10分鐘。本發(fā)明的又一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法，包括以下步驟以待鑒定菌株的基因組DNA為模板，用所述的引物對A進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；檢測所述PCR擴增產(chǎn)物，若所述PCR擴增產(chǎn)物為493bp的片段，則確定所述待鑒定菌株為或候選為對多菌靈產(chǎn)生抗性的甜菜褐斑病致病菌。所述檢測所述PCR擴增產(chǎn)物的方法為如下a)或b)所示a)將所述PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)檢測結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性；b)將所述PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性。所述a)中所述根據(jù)檢測結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法為若所述PCR擴增產(chǎn)物在凝膠上顯示為400bp-500bp的條帶，則確定所述待鑒定真菌菌株為或候選為對多菌靈產(chǎn)生抗性的甜菜褐斑病致病菌。所述引物對或所述引物組合物在鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法及其專用引物能有效地檢測出對多菌靈表現(xiàn)為敏感或高抗的甜菜褐斑病菌，檢測方法具有很高的特異性，且整個檢測過程快速，檢測成本較低，可操作性較強。因此，本發(fā)明所設(shè)計的引物和檢測方法可用來快速、準(zhǔn)確的檢測甜菜褐斑病菌對多菌靈的抗性水平。


圖1為本發(fā)明引物的序列圖。圖2為本發(fā)明引物序列在微管蛋白基因序列上的位置圖譜。圖3為本發(fā)明特異性引物檢測甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的凝膠電泳圖；其中，泳道1為Marker，泳道2為健康甜菜(陰性對照)，泳道3為甜菜莖點霉，泳道4為赤霉菌，泳道5甜菜多黏菌，泳道6為立枯絲核菌，泳道7為茄鏈格孢菌，泳道8為尖孢鐮刀菌， 泳道9為甜菜白粉菌，泳道10為玉米蠕孢菌，泳道11為甜菜生尾孢菌(抗)，泳道12為甜菜生尾孢菌(感)。
圖4為PCR-RFLP檢測甜菜褐斑病菌對多菌靈抗性的凝膠電泳圖；其中，泳道1為 Marker,泳道2為NC-DDZ-6菌株，泳道3為HW-QE-10菌株，泳道4為HN-TC-2-7菌株，泳道5為HY-JS-26-2菌株，泳道6為HW-PSC-2-1菌株，泳道7為HW-XW-I菌株，泳道8為 N-HHTA-16菌株，泳道9為LJ-HS-I菌株，泳道10為HY-HQ-I菌株，泳道11為HL-FT-I菌株，泳道12為NC-DDZ-6菌株和LJ-HS-I菌株的混合菌株。圖5為利用本發(fā)明的方法檢測對多菌靈敏感和高抗的菌株的凝膠電泳圖；其中， 泳道1為Marker，泳道2為NC-DDZ-6菌株，泳道3為HW-QE-10菌株，泳道4為HN-TC-2-7 菌株，泳道5為HY-JS-26-2菌株，泳道6為HW-PSC-2-1菌株，泳道7為HW-XW-I菌株，泳道 8為N-HHTA-16菌株，泳道9為LJ-HS-I菌株，泳道10為HY-HQ-I菌株，泳道11為HL-FT-I 菌株，泳道12為NC-DDZ-6菌株和LJ-HS-I菌株的混合菌株。
圖6為利用本發(fā)明的方法檢測從田間分離的甜菜褐斑病菌菌株對多菌靈抗性的凝膠電泳圖；其中，泳道1為Marker，泳道2為NC-TW-2菌株，泳道3為HY-HQ-I菌株，泳道 4為HY-HG-I菌株，泳道5為HY-HQ菌株，泳道6為HY-JS-2菌株，泳道7為HY-WH-I菌株， 泳道8為HN-N0-1菌株，泳道9為NF-LTT菌株，泳道10為SD-TZ菌株，泳道11為BJ-SZ-I 菌株，泳道12為BJ-SZ-6菌株。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性1、用特異性引物檢測甜菜褐斑病菌對多菌靈抗性所選用的菌株(見表1):甜菜莖點霉(Phomabetae)、赤霉菌(Giberallia sp.)、甜菜多黏菌(Polymyxa betae) ,al^^MM (Rhizoctonia solani)、5Gfj||^i包胃(Alternaria alternate) 鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、舌甘菜白粉菌(Erysiphe betae)、玉米螺孢菌(Bipolaris sp.)、甜菜生尾孢菌(抗)(編號為HN-TC-2-6)和甜菜生尾孢菌(感)(編號為 HL-JX(4)-1)(公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過這些菌株的非專利文獻(xiàn)是林杰、劉梅、 吳學(xué)宏等.我國抗感多菌靈甜菜褐斑病菌菌株微管蛋白基因的序列分析.中國植物病理學(xué)會2011年學(xué)術(shù)年會論文集，2011，北京中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，Ρ622-623.)表1本發(fā)明所用真菌列表
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的引物對，由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成。
2.一種用于鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的引物組合物，由引物對 A和引物對B組成；所述引物對A為權(quán)利要求1所述的引物對；所述引物對B由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列3所示的引物組成。
3.一種鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法，包括以下步驟以待鑒定真菌菌株的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求2所述的引物組合物中的引物對A進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物I ；同時，用權(quán)利要求2所述的引物組合物中的引物對B 進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物II ；檢測所述PCR擴增產(chǎn)物I和PCR擴增產(chǎn)物II，若所述 PCR擴增產(chǎn)物I為493bp的片段，且所述PCR擴增產(chǎn)物II不為493bp的片段，則確定所述待鑒定真菌菌株為或候選為對多菌靈產(chǎn)生抗性的甜菜褐斑病致病菌；若所述PCR擴增產(chǎn)物I 不為493bp的片段，且所述PCR擴增產(chǎn)物II為493bp的片段，則確定所述待鑒定真菌菌株為或候選為對多菌靈敏感的甜菜褐斑病致病菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述檢測所述PCR擴增產(chǎn)物I和PCR擴增產(chǎn)物II的方法為如下A)或B)所示A)將所述PCR擴增產(chǎn)物I和PCR擴增產(chǎn)物II進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)檢測結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性；B)將所述PCR擴增產(chǎn)物I和PCR擴增產(chǎn)物II進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述A)中所述根據(jù)檢測結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法為若所述PCR擴增產(chǎn)物I在凝膠上顯示為400bp-500bp的條帶，且所述PCR擴增產(chǎn)物II沒有在凝膠上顯示為400bp-500bp的條帶，則確定所述待鑒定真菌菌株為或候選為對多菌靈產(chǎn)生抗性的甜菜褐斑病致病菌；若所述PCR擴增產(chǎn)物I沒有在凝膠上顯示為400bp-500bp 的條帶，且所述PCR擴增產(chǎn)物II在凝膠上顯示為400bp-500bp的條帶，則確定所述待鑒定真菌菌株為或候選為對多菌靈敏感的甜菜褐斑病致病菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述用權(quán)利要求2所述的引物組合物中的引物對A進(jìn)行PCR擴增的反應(yīng)條件為95°C 預(yù)變性1分鐘；然后按照下列參數(shù)進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)95°C變性45秒，65. 5°C復(fù)性30秒，72°C延伸45秒；循環(huán)35次；循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后在72°C保持10分鐘；所述用權(quán)利要求2所述的引物組合物中的引物對B進(jìn)行PCR擴增的反應(yīng)條件為95°C 預(yù)變性1分鐘；然后按照下列參數(shù)進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)95°C變性45秒，64°C復(fù)性30秒，72°C延伸 45秒；循環(huán)35次；循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后在72°C保持10分鐘。
7.一種鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法，包括以下步驟以待鑒定菌株的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對進(jìn)行PCR擴增，得到 PCR擴增產(chǎn)物；檢測所述PCR擴增產(chǎn)物，若所述PCR擴增產(chǎn)物為493bp的片段，則確定所述待鑒定菌株為或候選為對多菌靈產(chǎn)生抗性的甜菜褐斑病致病菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述檢測所述PCR擴增產(chǎn)物的方法為如下a)或b)所示a)將所述PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)檢測結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性；b)將所述PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述a)中所述根據(jù)檢測結(jié)果鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法為若所述PCR擴增產(chǎn)物在凝膠上顯示為400bp-500bp的條帶，則確定所述待鑒定真菌菌株為或候選為對多菌靈產(chǎn)生抗性的甜菜褐斑病致病菌。
10.權(quán)利要求1所述的引物對或權(quán)利要求2所述的引物組合物在鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法及其專用引物。本發(fā)明提供了一種用于鑒定或輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的引物對，由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成。本發(fā)明所提供的輔助鑒定甜菜褐斑病致病菌對多菌靈抗性的方法及其專用引物能有效地檢測出對多菌靈表現(xiàn)為敏感或高抗的甜菜褐斑病菌，檢測方法具有很高的特異性，且整個檢測過程快速，檢測成本較低，可操作性較強。因此，本發(fā)明所設(shè)計的引物和檢測方法可用來快速、準(zhǔn)確的檢測甜菜褐斑病菌對多菌靈的抗性水平。
文檔編號C12N15/11GK102329872SQ201110301170
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者于嘉林, 劉梅, 吳學(xué)宏, 李大偉, 林杰, 韓成貴 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)