專利名稱：抑制BCL11A表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的Bcl11a siRNA-2292及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SiRNA及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種抑制BCLllA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的Bcllla siRNA-2292及其在制備治療和/或預(yù)防B細(xì)胞腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNAi技術(shù)是一種高效的高特異性抑制基因表達(dá)的新途徑。體內(nèi)外的研究已顯示了 RNAi技術(shù)在癌癥基因治療方面比反義核酸具有更好的應(yīng)用前景。大量的研究表明，體外通過RNAi抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性。Bcllla(B-cell lymphoma/leukemia 11A)基因定位于 2ρ16· 1，是一個 kriippel 樣鋅指基因，屬于BCLll家族(包括BCLllA和BCL11B)。Bcllla基因共有5個外顯子， 主要有4種轉(zhuǎn)錄本可產(chǎn)生相應(yīng)的4種主要蛋白(XL, 5. 9kb/125kD ；L,3. 8kb/100kD ；S, 2. 4kb/35KD ；XS, 1. 5kb/25KD)，外顯子1和2是4種表型所共有的，即BCLllA所有的表型有共同的 N 末端[Liu H, Ippolito GC, Wall JK, et al. Functional studies of BCLllA characterization of the conserved BCLlIA-XLsplice variant and its interaction with BCL6 in nuclear paraspeckles of germinal center B cells. Mol Cancer. 2006 ； 5:18]。無論在正常的淋巴組織還是在淋巴瘤，BCL11A-XL為主要的表達(dá)蛋白。目前研究顯示，BCLllA在人類多種B細(xì)胞腫瘤呈現(xiàn)高表達(dá)[Weniger MA, Pulford K，Gesk S，et al.Gains of the proto-oncogene BCLllA and nuclear accumulation of BCLllA(XL) protein are frequent in primary mediastinal B—cell lymphoma. Leukemia. 2006 ； 20(10) :1880-1882],在人體正常淋巴結(jié)、骨髓、脾臟內(nèi)僅有微弱表達(dá)，并且主要表達(dá)于生發(fā)中心B細(xì)胞，而在大部分人體正常組織中都不表達(dá)，提示BCLllA可能與B細(xì)胞腫瘤的生物學(xué)特性有關(guān)。事實上，已經(jīng)表明BCLllA在人類多種B細(xì)胞腫瘤中可通過基因擴增、染色體易位或基因活化出現(xiàn)異常，充當(dāng)一個原癌基因的作用[Yin B, Delwel R，Valk PJ, et al. A retroviral mutagenesis screen reveals strong cooperation between Bcllla overexpression and loss of the Nfl tumor suppressor gene. Blood. 2009 ； 113(5) 1075-1085]?，F(xiàn)有的研究表明BCLllA可能與B細(xì)胞腫瘤的發(fā)生相關(guān)，但目前還沒有Bcllla siRNA可用于腫瘤，尤其是B細(xì)胞腫瘤治療和/或預(yù)防的證據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種抑制BCLllA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的Bcllla siRNA-2292 ο本發(fā)明的另一目的在于提供所述的抑制BCLllA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的 Bcllla siRNA-2292 的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種抑制BCLl IA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的Bcllla siRNA-2292，序列如下所示正義鏈的序列為5，-CGGGCGAAAGGCCUUAUAAUU-3，；反義鏈的序列為5，-UUAUAAGGCCUUUCGCCC⑶G-3，；
所述抑制BCLllA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的Bcllla siRNA-2292在制備治療和 /或預(yù)防B細(xì)胞腫瘤藥物中的應(yīng)用；所述的B細(xì)胞腫瘤包括B細(xì)胞白血病和B細(xì)胞淋巴瘤。一種治療和/或預(yù)防B細(xì)胞腫瘤藥物，包含所述抑制BCLllA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的 Bcllla siRNA-2292 夕卜，還可包含 Bcl_2siRNA ；所述的Bcl-2 siRNA的序列如下所示正義鏈的序列為5，-GUACAUCCAUUAUAAGCUGUU-3，；反義鏈的序列為5，-CAGCUUAUAAUGGAUGUACUU-3，；本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果(1)本發(fā)明所述的抑制BCLllA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的BclllasiRNA-2292能高效抑制BCLllA表達(dá)。(2)本發(fā)明所述的抑制BCLllA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的BclllasiRNA-2292能有效抑制腫瘤性B細(xì)胞的增殖以及促進(jìn)其凋亡。(3)本發(fā)明所述的抑制BCLllA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的BclllasiRNA-2292對于開發(fā)新的抗B細(xì)胞腫瘤基因藥物和提高B細(xì)胞腫瘤的治療效果有重要意義。人類生存環(huán)境日益惡化，B細(xì)胞腫瘤(包括B細(xì)胞白血病和B細(xì)胞淋巴瘤)發(fā)病率和死亡率越來越高， 已經(jīng)成為影響人們健康和壽命的主要腫瘤性疾病之一。絕大多數(shù)的B細(xì)胞腫瘤均有BCLllA 表達(dá)增加，因而靶向BCLllA的治療將具有比較普遍的意義，適用于絕大多數(shù)B細(xì)胞腫瘤，將具有巨大的市場潛力。(4)本發(fā)明證實所述的抑制BCLlIA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的Bcl 1 lasiRNA-2292 和Bcl-2 siRNA結(jié)合，更有效抑制腫瘤性B細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡。


圖1是轉(zhuǎn)染細(xì)胞6h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(X 100)，其中A為未轉(zhuǎn)染的SUDHL6細(xì)胞；B為轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的陰性siRNA的SUDHL6細(xì)胞；C為未轉(zhuǎn)染的EBl細(xì)胞；D為轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的陰性siRNA的EBl細(xì)胞。圖2是轉(zhuǎn)染BclIla siRNA-2292 4811后5皿^6細(xì)胞中的此111& mRNA表達(dá)量圖。圖 3 是轉(zhuǎn)染 Bcllla siRNA-2292 48h 后 EBl 細(xì)胞中的 Bcllla mRNA 表達(dá)量圖。圖4是Bcllla siRNA-2292對SUDHL6細(xì)胞BCLllA蛋白表達(dá)的影響圖，其中泳道 1為無關(guān)序列組；泳道2為空轉(zhuǎn)組；泳道3為細(xì)胞組；泳道4為BclllasiRNA-2292組。圖5是Bcllla siRNA-2292對EBl細(xì)胞BCLlla蛋白表達(dá)的影響圖，其中泳道1 為Bcllla siRNA-2292組；泳道2為無關(guān)序列組；泳道3為空轉(zhuǎn)組；泳道4為細(xì)胞組。圖6是SUDHL細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)圖(Hoechst，X 200)。圖7是EBl細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)圖(Hoechst，X200)。圖8是轉(zhuǎn)染Bcllla siRNA-2292 72h后SUDHL細(xì)胞凋亡率圖。
圖9是轉(zhuǎn)染Bcllla siRNA-2292 72h后EBl細(xì)胞凋亡率圖。

圖 10 是流式細(xì)胞儀 AnnexinV/PI 法檢測轉(zhuǎn)染 Bcllla siRNA-2292 72h 后 SUDHL6 細(xì)胞凋亡圖，其中A為細(xì)胞組；B為空轉(zhuǎn)組；C為無關(guān)序列組；D為siRNA-2292組。圖11是流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI法檢測轉(zhuǎn)染Bcllla siRNA-2292 72h后EBl細(xì)胞凋亡圖，其中A為細(xì)胞組；B為空轉(zhuǎn)組；C為無關(guān)序列組；D為siRNA-2292組。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1一、實驗材料和方法(I)Bcllla siRNA 的設(shè)計和合成依據(jù)Ambion公司在網(wǎng)上提供的設(shè)計工具軟件(參見www. ambion. com/techlib/ misc/siRNA finder, html)針對Bcllla基因設(shè)計3條siRNA序列，分別命名為Bcllla siRNA-2292、Bcllla siRNA-475 和 Bcllla siRNA-319，同時設(shè)計正義鏈 5，端綠色熒光 FAM 標(biāo)記的陰性siRNA及無關(guān)序列siRNA作為對照，由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。Bcllla siRNA-2292 的序列如下正義鏈的序列為5，-CGGGCGAAAGGCCUUAUAAUU-3，；反義鏈的序列為5，-UUAUAAGGCCUUUCGCCC⑶G-3，；Bcllla siRNA-475 的序列如下正義鏈5，-GCAGGGUAUUUGUAAAGAUUU-3，；反義鏈5，-AUCUUUACAAAUACCCUGCGG-3，；Bcllla siRNA-319 的序列如下正義鏈5，-AGAAGAUGACGAUUGUUUAUU-3，；反義鏈5，-UAAACAAUC⑶CAUCUUCUGG-3，；熒光標(biāo)記的陰性siRNA的序列如下正義鏈5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUUU-3，；反義鏈5，-AC⑶GACACGUUCGGAGAAUU-3，；無關(guān)序列siRNA的序列如下正義鏈5，-GUAUGACAACAGCCUCAA⑶U-3，；反義鏈5，-CUUGAGGCUGUU⑶CAUACUU-3，。(2)細(xì)胞培養(yǎng)將彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞系SUDHL6(美國ATCC細(xì)胞庫)和伯基特淋巴瘤(Burkitt 淋巴瘤)細(xì)胞系EBl (美國ATCC細(xì)胞庫)分別接種于含體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清、100U/mL 青霉素和100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱37°C連續(xù)培養(yǎng)。(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染①轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞密度調(diào)至2X 105/ml，然后重懸在24孔板中，每孔加入 0. 5ml的細(xì)胞懸液，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
② 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將24孔板中每孔的細(xì)胞重懸在100 μ 1含有體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。③用100 μ 1不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋siRNA，siRNA的終濃度為ΙΟΟηΜ。 再加入6 μ 1 Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑，混勻。室溫孵育混合液5 10分鐘。以上混合液為24 孔板每孔的量。④將以上準(zhǔn)備好的混合液分別加入到細(xì)胞懸液中，搖動培養(yǎng)板，輕混勻。37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑤6h后，每孔加入400 μ 1含有體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基， 37°C>5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染效率的檢測轉(zhuǎn)染6h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況，并通過流式細(xì)胞儀定量檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(轉(zhuǎn)染效率是以轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的陰性siRNA進(jìn)行檢測)。(4)熒光定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞Bcllla mRNA表達(dá)水平將空白組、單純轉(zhuǎn)染試劑組即空轉(zhuǎn)組、無關(guān)序列組、Bcllla siRNA-475組、Bcllla siRNA-319組和Bcllla siRNA_2292組細(xì)胞以(4 8) X 105/mL起始濃度接種于6孔板，每孔接種lmL，按HiPerfect轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h，離心收集細(xì)胞。RNA提取應(yīng)用RNAzol試劑盒(Gibco，BRL)并應(yīng)用隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Superscript II Kit, Invitrogen，USA)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。并經(jīng)GAPDH基因的RT-PCR確定所合成 cDNA的質(zhì)量。均按常規(guī)方法進(jìn)行，具體抽提過程如下所述。1)細(xì)胞總RNA的提取和純化①收集離心細(xì)胞，去其上清，用PBS(0. OlM :NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HPO4L 44g、 KH2PO4 0. 24g，pH7. 4)洗兩次后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入1. 5mL離心管中，每管加Trizol試劑lmL，搖勻，室溫下靜置15min后，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞；②將各管內(nèi)消化好的細(xì)胞裂解液吸到DEPC處理過的1.5mL EP管中，加氯仿 0. 2mL (Trizol 氯仿約為5 1)，輕搖15s，并在冰上孵育15min ；③4°C、12，OOOrpm離心15min。然后取上清無色水相到DEPC處理過的EP管，力口 0. 5mL異丙醇，室溫下靜置IOmin ；④4°C、12，OOOrpm離心lOmin。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清；⑤加入用DEPC水新配制的經(jīng)預(yù)冷的體積百分比75%的乙醇溶液1. OmL，輕輕洗滌沉淀，4°C、12，OOOrpm 離心 5min ；⑥去上清，瞬時離心，用小Tip吸干液體；使沉淀自然干燥，DEPC處理水20 30 μ L加入，混勻，55 60°C水浴IOmin溶解總RNA ；⑦用紫外分光光度儀測總RNA純度和濃度，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA是否水解， 鑒定后于_70°C保存?zhèn)溆谩?)細(xì)胞總RNA的鑒定濃度分析和純度鑒定從提取的RNA中吸取1 μ L，以DEPC水稀釋至100 μ L，用紫外分光光度儀分別測總RNA的濃度，光吸收度Α260和Α280的比值(Α260/Α280)。3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取上述RNA樣品，將其稀釋成1 μ g/ μ L，在PCR管中加入下列試劑的混合物RNase Free H2OIOpL
5 xRT Buffer4μΙ
dNTP Mixture(各 1 OmM)2μL
RNase inhibitor(10U/pL)IpL
Random Primer(25pmol/pL:1 pL
RNAIpL(Ipg)
M-MLVIpL在PCR 儀上按照下列條件反應(yīng)30°C 10min,42°C 20min,99°C 5min，4°C 5min，瞬時離心，-20°C保存?zhèn)溆谩?) PCR 擴增實時定量PCR試劑盒購于北京天根生物公司。實時定量PCR反應(yīng)管和反應(yīng)儀器為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。Bcllla引物序列如下上游引物5’-AACCCCAGCACTTAAGCAAA-3’ ； 下游引物5’ -GGAGGTCATGATCCCCTTCT-3’。 以GAPDH為內(nèi)參照，上游引物為 5，-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3，，下游引物為 5，-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3，。利用SYBR Green I染料檢測細(xì)胞Bcllla表達(dá)情況，并將GAPDH作為內(nèi)參照?？偡磻?yīng)體積為20 μ L0反應(yīng)條件95°C IOmin變性后，共進(jìn)行40個循環(huán)擴增，每一循環(huán)包括 950C 15s，60°C 30s和80°C 5s，并在80°C讀板1次。隨后，以0. 17°C /s變化速度從65°C到 95°C，每隔2s記錄1次熒光值，獲得熔解曲線。將所擴增的PCR產(chǎn)物熔解曲線分析，同時隨機進(jìn)行質(zhì)量體積比2%瓊脂糖凝膠電泳，以確定產(chǎn)物是否為所擴增的目的片段。采用相對定量公式2-Δ Ct X 100%, ACt = Ct(Bcllla)-Ct(GAPDH),計算細(xì)胞 BclIla 的相對量。5) Western blot 檢測 BCLllA 蛋白的表達(dá)收集經(jīng)轉(zhuǎn)染48h的細(xì)胞，離心收集細(xì)胞樣品于1. 5ml離心管內(nèi)，采用細(xì)胞質(zhì)和核蛋白提取試劑盒，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行定量。取IOOyg蛋白與加樣緩沖液(1.0M pH6. 8 Tris-Hcl 1. Oml,10% SDS 6.0ml、β -巰基乙醇 0. 2ml，雙蒸水 2. 8ml)混合，100°C 變性5min，質(zhì)量百分比12% SDS-PAGE膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝纖膜，GAPDH 一抗作為內(nèi)對照，膜在一抗中4°C孵育過夜，二抗孵育2h，ECL顯色檢測。具體過程如下①裂解細(xì)胞提取總蛋白A、取IO6個細(xì)胞加入ImL蛋白裂解液RIPA和IOmL苯甲基磺酰氟(PMSF)，冰浴 30min, 4°C，13000g 離心 30min。B、將上清小心轉(zhuǎn)移到干凈無菌的離心管中，-20°C保存。②電泳及雜交A、配制質(zhì)量百分比12% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液，灌注丙烯酰胺溶液，分離膠聚合完全后傾出覆蓋水層，將質(zhì)量百分比5%濃縮膠倒入之后，取干凈的梳子插入到濃縮膠內(nèi)，將凝膠置于室溫。B、取適量樣品加入到等體積2 X SDS凝膠加樣緩沖液中，沸水中煮沸5min使蛋白變性，混勻后上樣。

C、將梳子小心的移出，把凝膠固定在電泳裝置，上樣。接通電源，電壓為60V。
D、電泳結(jié)束后，將分離膠切下，做成濾紙_凝膠-膜-濾紙的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)移時電壓300mA，轉(zhuǎn)移時間lh。Ε、轉(zhuǎn)移結(jié)束后，把PVDF膜放入盛有質(zhì)量百分比5%的脫脂奶粉封閉液中，封閉2h 或過夜。F、封閉完畢后用含 lg/L Tween20 的 pH7. 4、50mmol/L 的 Tris 鹽酸緩沖液(TBST) 洗膜5次，每次5分鐘，加一抗(BCL11A，1 500按質(zhì)量體積比mg/ml稀釋；GAPDH 1 1000 按質(zhì)量體積比mg/ml稀釋)。4°C孵育過夜，洗膜5次，每次5min。
G、加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1 1000按質(zhì)量體積比mg/ml稀釋)，反應(yīng)lh，洗膜5次，每次5min。H、將PVDF膜浸泡ECL熒光底物中，室溫孵育3 5min后，將其置于暗室，取X光底片，曝光Imin后，依次顯影、定影、拍照。6) CCK8法測細(xì)胞生長抑制率將對數(shù)生長期的SUDHL6細(xì)胞和EBl細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，按照上述步驟(步驟(3))進(jìn)行轉(zhuǎn)染，置于37°C、飽和濕度、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)24、48和72h后，向每孔內(nèi)加入30yL CCK8，再置于37°C孵育4h。然后直接在酶聯(lián)檢測儀上450nm波長處測 A450值，以A450間接反映細(xì)胞存活數(shù)量。實驗重復(fù)3次，據(jù)此可推算Bcllla siRNA轉(zhuǎn)染后各時間點對細(xì)胞的抑制率。7) Hoechst染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)收集經(jīng)轉(zhuǎn)染72h的細(xì)胞，離心收集細(xì)胞樣品于1. 5ml離心管內(nèi)，加入0. 5ml固定液，混勻，固定10分鐘。離心去固定液，0.01M、pH 7. 2的PBS洗兩遍。最后一次離心后吸去大部分液體保留約50 μ 1液體，再緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上，晾干，均勻滴上0. 5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘，晾干，PBS洗兩遍。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上一潔凈蓋玻片，避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。8)AnnexinV/PI雙染法和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率離心收集轉(zhuǎn)染后48h的各組細(xì)胞，0. 01M、pH 7. 2的PBS洗滌2次，離心去上清， 195 μ L Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μ L，避光孵育lOmin，離心去上清，190 μ L Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μ L碘化丙啶(PI)染色液，冰浴避光放置，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，用MULTCYCLE軟件分析處理結(jié)果。9)統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13. O軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用完全隨即區(qū)組設(shè)計的單因素方差分析，組間的比較選用可進(jìn)行多個樣本均數(shù)間兩兩均數(shù)比較的S-N-K檢驗。二、實驗結(jié)果(一)Bcl Ila siRNA 抑制 SUDHL6 和 EBl 腫瘤細(xì)胞生長(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率將轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的陰性siRNA 6h的細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察，可見到部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光現(xiàn)象，流式細(xì)胞儀檢測SUDHL6細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為46. 2%, EBl細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為51. 4% (如圖1所示)。后面的實驗均按該轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。(2)熒光定量RT-PCR檢測細(xì)胞Bcllla mRNA表達(dá)水平
提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測其吸光度A260/A280的比值，都在1. 8 2. 0，說明提取的RNA純度較高。首先，在3條BclllasiRNA中篩選出 siRNA-2292轉(zhuǎn)染SUDHL6細(xì)胞48h下調(diào)Bcllla mRNA的表達(dá)，其值顯著低于空白組(即指未經(jīng)任何處理的細(xì)胞組)、空轉(zhuǎn)組(即指單純轉(zhuǎn)染試劑處理組)和無關(guān)序列組(P <0.05)，而其它的2條siRNA (BelIla siRNA—475和Bcllla siRNA-319)、空轉(zhuǎn)組及無關(guān)序列siRNA組分別與空白組細(xì)胞的Bcllla mRNA表達(dá)量間無顯著差異(P >0.05)。同 樣，siRNA-2292轉(zhuǎn)染EBl細(xì)胞48h下調(diào)Bcllla mRNA的表達(dá)，可見， Bcllla siRNA-2292可特異性抑制SUDHL6細(xì)胞和EBl細(xì)胞中Bcllla基因的表達(dá)(結(jié)果如圖2和3所示)。(3)BCLllA蛋白表達(dá)的檢測SUDHL6細(xì)胞和EBl細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染Bcllla siRNA-2292后48h細(xì)胞的BCLllA蛋白表達(dá)量降低，并顯著低于對照組(即空轉(zhuǎn)組、無關(guān)序列組與空白組)，而空轉(zhuǎn)組及無關(guān)序列組分別與空白組間未見明顯差別。顯示，Bcllla siRNA-2292可特異性抑制SUDHL6和EBl細(xì)胞中BCLllA蛋白的表達(dá)(結(jié)果如圖4和5所示)。(4)Bcllla siRNA-2292 對 SUDHL6 和 EBl 細(xì)胞生長的影響CCK8結(jié)果顯示Bcllla siRNA-2292轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖活性較低，并顯著低于其它對照組(即空轉(zhuǎn)組、無關(guān)序列組與空白組)(P < 0. 05)，而空轉(zhuǎn)組及無關(guān)序列組分別與空白組細(xì)胞的增殖能力間差異無顯著性(P > 0. 05)(見表1和2)。可見Bcllla siRNA-2292 可抑制SUDHL6和EBl細(xì)胞的生長。表1轉(zhuǎn)染BCLlla siRNA后各時間點CCK8法檢測SUDHL6細(xì)胞吸光度A值(〒土 ^， η = 6)
_24小時_48小時_72小時
siRNA-2292 組 1.70士0.26 2.34士0.31* 3.41 士0.71* 無關(guān)序歹丨」組 1.87 士 0.14 3.31 士 0.22 5.72 士 0.23 空轉(zhuǎn)組 1.89 士 0.09 3.55 士 0.15 5.36 士 0.08 細(xì)胞組_1.96 士 0.17_3.67 士 0.18_5.91 士 0.28與其他組相比，*P < 0. 05表2轉(zhuǎn)染Bcllla siRNA后各時間點CCK8法檢測EBl細(xì)胞吸光度A值(〒土 s，n =6)
_24小時_48小時_72小時
siRNA-2292 組 1.19士0.87 2.15士0.98* 3.42士0.31* 無關(guān)序列組 1.63 士 0.53 2.97 士 0.20 5.42 士 0.10 空轉(zhuǎn)組 1.62 士 0.13 3.17 士 0.10 5.35 士 0.19 細(xì)胞組_1.69 士 0.11_3.23 士 0.98_5.55 士 0.44與其他組相比，*P < 0. 05(5) Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)圖6和7為轉(zhuǎn)染后72h的Hoechst染色圖。Bcllla siRNA-2292組均可見明顯的凋亡細(xì)胞核膜完整，體積變小，核質(zhì)固縮；而其他組(即空轉(zhuǎn)組、無關(guān)序列組與空白組)未見明顯凋亡細(xì)胞。(6)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀-AnnexinV/PI雙染法顯示轉(zhuǎn)染Bcllla siRNA-2292入SUDHL6細(xì)胞后 72h的總凋亡率增加，與空白對照組和無關(guān)序列組比較差異有顯著性(P <0.05)。而空白對照組和無關(guān)序列組的凋亡率差異無顯著性(P > 0. 05)，見圖8。轉(zhuǎn)染Bcllla siRNA-2292 入EBl細(xì)胞后72h的凋亡率顯著高于空白對照組和無關(guān)序列組(P < 0. 05)， 而空白對照組與無關(guān)序列組間差異無顯著性(P > 0. 05)，見圖9?？梢夿cllla siRNA-2292可誘導(dǎo)提高 SUDHL6和EBl細(xì)胞的凋亡率(圖10，11)。三、Bcllla siRNA-2292和Bcl_2siRNA聯(lián)合增強對B腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用(I)Bcllla siRNA-2292和Bcl_2siRNA聯(lián)合對B腫瘤細(xì)胞生長的影響CCK8法顯示，同時轉(zhuǎn)染Bcllla siRNA-2292和Bcl_2siRNA(Bcllla siRNA-2292和 Bcl-2siRNA之間按摩爾比1 1的比例搭配，終濃度均為50nM)入SUDHL6和EBl細(xì)胞后， 各時間點 Bcllla siRNA-2292 和 Bcl_2siRNA 組較單用 Bcllla siRNA-2292 組(終濃度為 IOOnM)、單用Bcl-2siRNA組(終濃度為IOOnM)明顯抑制了細(xì)胞的生長，結(jié)果表明Bcllla siRNA-2292和Bcl_2siRNA聯(lián)合可增強對細(xì)胞生長的抑制(見表3和4)。表3 Bcllla siRNA聯(lián)合Bcl_2siRNA后CCK8法檢測SUDHL6細(xì)胞吸光度A值 χ 土 s ,η = 6)
權(quán)利要求
1.一種抑制BCLl IA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的Bcl Ila siRNA_2^2，其特征在于序列如下所示正義鏈的序列為5，-CGGGCGAAAGGCCUUAUAAUU-3，； 反義鏈的序列為5，-UUAUAAGGCCUUUCGCCC⑶G-3，。
2.權(quán)利要求1所述抑制BCLllA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的BclllasiRNA_2^2的應(yīng)用，其特征在于所述的Bcllla siRNA-2292用于制備治療和/或預(yù)防B細(xì)胞腫瘤藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所抑制80^1認(rèn)表達(dá)和腫瘤性8細(xì)胞增殖的此111狀11 織-2292的應(yīng)用，其特征在于所述的B細(xì)胞腫瘤藥物為B細(xì)胞白血病和/或B細(xì)胞淋巴瘤。
4.一種治療和/或預(yù)防B細(xì)胞腫瘤藥物，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的抑制 BCLllA表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的Bcllla siRNA-2292
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療和/或預(yù)防B細(xì)胞腫瘤藥物，其特征在于還包含 Bcl-2siRNA ；所述的Bcl-2siRNA的序列如下所示 正義鏈的序列為5，-GUACAUCCAUUAUAAGCUGUU-3，； 反義鏈的序列為5，-CAGCUUAUAAUGGAUGUACUU-3，。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制BCL11A表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的Bcl11asiRNA-2292，其正義鏈的序列為5’-CGGGCGAAAGG CCUUAUAAUU-3’；反義鏈的序列為5’-UUAUAAGGCCUUU CGCCCGUG-3’。該Bcl11a siRNA-2292能高效抑制BCL11A表達(dá)，有效抑制腫瘤性B細(xì)胞的增殖以及促進(jìn)其凋亡。本發(fā)明還證實該Bcl11a siRNA-2292和Bcl-2siRNA結(jié)合更有效抑制腫瘤性B細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡。本發(fā)明所述的抑制BCL11A表達(dá)和腫瘤性B細(xì)胞增殖的Bcl11a siRNA-2292對于開發(fā)新的抗B細(xì)胞腫瘤基因藥物和提高B細(xì)胞腫瘤的治療效果有重要意義。
文檔編號C12N15/113GK102352356SQ20111030131
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者何冬梅, 李揚秋, 高楊軍 申請人:暨南大學(xué)