專利名稱：水稻OsASIE1基因在增強(qiáng)植物耐鹽性中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中水稻OsASIEI基因在增強(qiáng)植物耐鹽性中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
各種生物和非生物脅迫是影響水稻生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要因素，發(fā)掘能夠改善水稻抵抗逆境脅迫能力的基因?qū)榛蚬こ谈牧妓拘缕贩N打下基礎(chǔ)。在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，植物在分子、細(xì)胞、生理和生物化學(xué)水平上發(fā)展出多種機(jī)制應(yīng)對(duì)逆境脅迫，轉(zhuǎn)錄因子作為上游調(diào)控基因在植物的脅迫應(yīng)答途徑中扮演重要的角色。植物中參與脅迫應(yīng)答反應(yīng)的主要有AP2/ EREBP、bZIP、NAC、MYB和WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族。其中AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族基因廣泛參與植物的發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病原反應(yīng)與干旱、高鹽及低溫等脅迫應(yīng)答反應(yīng)。該家族轉(zhuǎn)錄因子的共同特點(diǎn)是含有一個(gè)60個(gè)氨基酸左右的AP2結(jié)構(gòu)域，它在與DNA結(jié)合中具有重要的作用。根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族被分為AP2、EREBP, RAV和其他共4 個(gè)亞類。AP2成員含有2個(gè)重復(fù)的AP2結(jié)構(gòu)域，而RAV成員含一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)類似 B3結(jié)構(gòu)域；EREBP亞家族成員含有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，且有ERF和DREB/CBF兩個(gè)分支。研究表明，EREBI^s轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生物和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。 ERFs類轉(zhuǎn)錄因子主要參與植物的生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)，如病原反應(yīng)、傷害反應(yīng)、乙烯信號(hào)途徑。最早發(fā)現(xiàn)的ERF轉(zhuǎn)錄因子是從煙草中分離得到的4個(gè)乙烯誘導(dǎo)病程相關(guān) (pathegenesis-related，PR)蛋白EREBP1-4，它們通過結(jié)合下游基因啟動(dòng)子區(qū)域的乙烯應(yīng)答元件GCC box調(diào)控下游基因的表達(dá)。GCC box廣泛存在于煙草和其他植物冊(cè)蛋白基因的 5' UTR區(qū)域，核心序列是AGCCGCC。1997年，Siou等在番茄中發(fā)現(xiàn)3個(gè)ERF蛋白(Pti_4、 Pti-5和Pti-6)能夠和疾病防御蛋白Pto相互作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了 ERFs轉(zhuǎn)錄因子在植物的病原反應(yīng)中具有重要作用。在植物中超表達(dá)一些ERFs基因亦能夠提高植物的抗病能力，如 ERFl、Pti4、ATERFl基因。最近的研究表明水稻中的ERF轉(zhuǎn)錄因子在乙烯應(yīng)答、淹水脅迫應(yīng)答、干旱脅迫應(yīng)答等多種生物途徑中起著正向調(diào)節(jié)作用。DREBs轉(zhuǎn)錄因子在植物的冷、干旱、高鹽、過氧化物等脅迫應(yīng)答途徑中具有重要的作用，參與不依賴于ABA的脅迫應(yīng)答反應(yīng)。DREBs轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合下游基因啟動(dòng)子區(qū)的干旱應(yīng)答順式作用元件DRE/CRT而調(diào)控下游基因的表達(dá)。干旱應(yīng)答順式作用元件 DRE(dehydration-responsive element)最早在逆境脅迫誘導(dǎo)基因rc^9A的啟動(dòng)子區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，核心序列為A/GCCGAC。與DRE相似的順式作用元件CRT (C-repeat)則是在一個(gè)冷誘導(dǎo)基因corlfe的啟動(dòng)子區(qū)被發(fā)現(xiàn)，其核心序列是TGGCCGA。DRE/CRT被發(fā)現(xiàn)存在于多個(gè)受干旱和低溫誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子區(qū)域。在擬南芥、水稻等植物中超表達(dá)DREB家族的基因大多能提高植株應(yīng)對(duì)非生物脅迫的能力。迄今為止，越來越多的DREBs基因從不同植物中被克隆。在水稻中發(fā)現(xiàn)的DREB基因有0sDREBlA-G、0sDREB2A、0sDREB2B，其中OsDREBIA、 0sDREB1E、0sDREB1G、0sDRE B2A、0sDREB2B能夠特異性地結(jié)合DRE。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中超表達(dá)OsDREBIA能夠提高擬南芥植株耐受低溫、高鹽和干旱的能力(Dubouzet J G, SakumaY, Ito Y, Kasuga M, Dubouzet E G, Miura S, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-ShinozakiK. OsDREB genes in rice, Oryza sativa L. , encode transcription activators that function in drought-, high—salt—and cold-responsive gene expression. Plant J, 2003，33 :751-763)；在水稻中超表達(dá)OsDREBIG和0sDREB2B也能夠明顯地提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性，而超表達(dá)OsDREBlE僅僅能夠輕微地提高水稻抵抗干旱的能力(Chen J Q，Meng X P, Zhang Y, Xia Μ, Wang X P. Over-expression of OsDREB genes lead to enhanced drought tolerance in rice. Biotechnol Lett,2008，30(12) :2191-2198)。[l]ERFs和DREBs轉(zhuǎn)錄因子功能的差異主要體現(xiàn)在它們能夠結(jié)合的順式作用元件和調(diào)節(jié)的下游基因不同。有些EREBI^s轉(zhuǎn)錄因子既能結(jié)合DRE，也能結(jié)合GCCbox，如 TINY、TINY2、BnDREBIII, AtERFU AtERF4、AtEBP 和 CBFl ；而部分只能結(jié)合 DRE,如 CBF2/ DREBlC和CBF3/DREB1A等。ERFs轉(zhuǎn)錄因子傾向于結(jié)合GCC box, DREBs轉(zhuǎn)錄因子則傾向于結(jié)合DRE。為了發(fā)掘影響兩類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，Mkuma等(Sakuma Y， Liu Q, Joseph G. DNA-binding specificity of the ERF/AP2domain of Arabidopsis DREB, transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression. Biochem Biophy Res Commun，2002，四0 :998-1009)通過多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)擬南芥中的DREBs轉(zhuǎn)錄因子的AP2結(jié)構(gòu)域第15和第20個(gè)氨基酸分別是纈氨酸(Val，V) 和谷氨酸(Glu，Ε)，而ERFs轉(zhuǎn)錄因子的ΑΡ2結(jié)構(gòu)域第15和20個(gè)氨基酸是丙氨酸(Ala，A) 和天冬氨酸(Asp，D)，進(jìn)一步研究表明Val-15和Glu_20特別是Val_15對(duì)于結(jié)合DRE有重要的作用，但不影響對(duì)GCC box的結(jié)合，這可能是造成ERFs和DREBs轉(zhuǎn)錄因子功能不同的原因。為了發(fā)掘影響GCC box結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，孫山等(Sun S，Yu J P, Chen F, Zhao T J, Fang X H, Li Y Q, Sui S F. TINY, a dehydration-responsive element(DRE)-binding protein-like transcription factor connecting the DRE-and ethylene-responsive element-mediated signaling pathways in Arabidopsis.Biol Chem,2006,283 6261-6271)比較能夠結(jié)合兩種順式作用元件的蛋白序列和只能結(jié)合DRE的蛋白序列發(fā)現(xiàn)兩類蛋白的AP2保守區(qū)的第16個(gè)氨基酸不同，進(jìn)一步研究表明kr-16對(duì)于擬南芥中的 DREB轉(zhuǎn)錄因子TINY結(jié)合GCC box是必不可少的。TINY既參與生物脅迫反應(yīng)途徑，也參與非生物脅迫途徑，說明DRE介導(dǎo)的調(diào)控途徑和GCC box介導(dǎo)的調(diào)控途徑存在一定的重疊。水稻中有些AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子基因在受到非生物脅迫時(shí)表達(dá)量明顯升高’其中大部分基因?yàn)镈REBs和ERFs，這些基因很有可能與水稻的非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。雖然近年來對(duì)于EREBl5s轉(zhuǎn)錄因子參與非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)制有了較全面的研究，但是水稻中還有很多的EREBI^s基因的功能未知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供序列表中序列2所示的蛋白在增強(qiáng)植物耐鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了序列表中序列2所示的蛋白在增強(qiáng)植物耐鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在增強(qiáng)植物耐鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在增強(qiáng)植物耐鹽性中的應(yīng)用；所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-5)中任一所述的基因
1)序列表中序列1的自5'末端第703位-1083位所示的DNA分子；2)序列表中序列1的自5'末端第505位-1343位所示的DNA分子；3)序列表中序列1所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或幻或幻所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)或4)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在增強(qiáng)植物耐鹽性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體為在pCUbil390的多克隆位點(diǎn)間插入所述序列表中序列2所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與目的植物相比耐鹽性增強(qiáng)。所述序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因是通過含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。所述重組表達(dá)載體為在pCUbil390的多克隆位點(diǎn)間插入所述序列表中序列2所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，使用增強(qiáng)子。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。本發(fā)明通過干旱、高鹽、低溫脅迫下OsASIEI基因在不同水稻品種中的表達(dá)差異， 結(jié)合凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中其對(duì)順式元件GCC box和DRE的結(jié)合情況，以及超表達(dá)水稻植株的表型變化，開展其基因克隆與功能分析，分析候選基因與水稻非生物脅迫應(yīng)答的關(guān)系。結(jié)果表明，OsASIEI基因在受到高鹽和干旱脅迫時(shí)表達(dá)量迅速增加，但受到低溫脅迫時(shí)增加幅度較小；OsASIEI轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合下游基因啟動(dòng)子區(qū)域的GCC box和DRE來調(diào)控下游基因的表達(dá)，參與植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)；在水稻中超表達(dá)OsASIEI基因能夠在一定程度上改善水稻耐鹽脅迫的能力。本發(fā)明為改良、增強(qiáng)水稻抗逆性，加速抗逆分子育種進(jìn)程，具有十分重要的理論和實(shí)際意義。


圖1為以實(shí)時(shí)定量PCR分析OsASIEI在非生物脅迫下的表達(dá)量差異。圖2為以實(shí)時(shí)定量PCR分析OsASIEI在典型抗逆水稻品種中脅迫前后的表達(dá)量差
已圖3為OsASIEI的AP2結(jié)構(gòu)域結(jié)合GCC box和DRE元件的EMSA分析圖譜。圖4為超表達(dá)OsASIEI提高了水稻抵抗鹽脅迫的能力。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、過表達(dá)OsASIEI基因增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性日本晴(Nipponbare，0ryza sativa ssp. japonica)(公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是=Yongqing Jiao, Yonghong Wang5Dawei Xue,Jing Wang,Meixian Yan,Guifu Liu,Guojun Dong, Dali Zeng, Zefu Lu, Xudong Zhu, Qian Qian and Jiayang Li (2010)Regulation of OsSPL 14by 0smiR156defines ideal plant architecture in rice. Nature Genetics,42,541-544)；典型耐旱旱稻品種IRAT109(公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是San-Hong Liu, Bin-Ying Fu, Hua-Xue Xu, Ling-Hua Zhu, Hu-Qu Zhai，Zhi-Kang Li (2007)Cell death in response to osmotic and salt stresses in two rice (Oryza sativa L ) ecotypes，Plant Science，172，897-902)；耐鹽水稻FL478(請(qǐng)說明FL478的來源)(公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Harkamal Walia, Clyde Wilson% Pascal Condamine, Xuan Liu, Abdelbagi Μ. Ismail，Linghe Zeng, Steve I. Wanamaker, Jayati Mandal,Jin XuiXinping Cui,and Timothy J.Close(2005)Comparative Transcriptional Profiling of Two Contrasting Rice Genotypes under Salinity Stress during the Vegetative Growth Stage. Plant Physiology，139，822-835)；耐冷水稻云南地方品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)(公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是凌忠專，雷財(cái)林，王久林O004)稻瘟病菌生理小種研究的回顧與展望，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，37 (12) =1849-1859)。一、不同脅迫處理?xiàng)l件下OsASIEI基因在不同水稻品種中的表達(dá)差異1、水稻品種日本晴的低溫、高鹽和干旱脅迫水稻日本晴種子經(jīng)消毒處理，37°C催芽3d，萌發(fā)后選發(fā)芽一致的種子播于塑料盒泡沫架上，每孔2粒，二葉前水培，二葉后用Yoshida營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。于五葉期開始低溫 (40C )、高鹽(150mmol [1NaCl)和滲透脅迫(20% PEG)處理，并于脅迫處理Oh,0. 5h、3h、 他、1池、24h后取葉片，液氮速凍，-70°C低溫保存。2、抗逆水稻品種的低溫、高鹽和干旱脅迫典型耐旱旱稻品種IRAT109、耐鹽水稻品種FL478和耐冷水稻云南地方品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)種子經(jīng)消毒處理和催芽(37°C催芽3d)后，將耐旱旱稻品種IRAT109移入裝土的盆中種植，將耐冷水稻云南地方品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)和耐鹽水稻品種FL478播種于塑料盒泡沫架上。五葉期分別進(jìn)行干旱(斷水至葉片全卷)、高鹽(150mmOl Γ1 NaCl, 48h)和低溫處理G°C，4 !)處理，并分別于處理前和處理后取葉片和根，液氮速凍，-700C 低溫保存。3、實(shí)時(shí)定量PCR分析采用TRIZOL試劑提取實(shí)驗(yàn)樣品總RNA。具體方法如下1)取水稻組織200mg在液氮中研磨至細(xì)粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1. 5ml EP管中。2)加入Iml TRIzol提取液震蕩均勻，置室溫5min。
3)每管中加入0. 2ml氯仿(RNA專用)，搖震15s,置室溫3min。4)4°C下 1200g/min 離心 15min。5)仔細(xì)吸取上清水相，移至另一 EP管。6)加入0. 5ml異丙醇(RNA專用)，輕柔搖勻后，置室溫IOmin。7)4°C下 1200g/min 離心 IOmin08)去掉上清液，用75%乙醇(DEPC水配制)充分洗滌沉淀。9)4°C下 1200g/min 離心 5min。10)去掉上清液，室溫干燥5-lOmin，注意不要太干燥，最后加入DEPC水溶解。RNA純度的分析用瓊脂糖凝膠電泳快速檢測(cè)提取的總RNA的完整性，電泳緩沖液和1 %的瓊脂糖凝膠需新鮮配制。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提總RNA在波長(zhǎng)230nm、 ^K)nm、280nm處測(cè)光吸收值。結(jié)果提取的總RNA用1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明RNA樣品電泳條帶清晰，沒有基因組DNA和蛋白質(zhì)的污染，28S比ISSrRNA條帶亮度大約為2 1，提取的RNA完整性較好。為進(jìn)一步確定RNA質(zhì)量，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提總RNA在波長(zhǎng)230nm、260nm、280nm處測(cè)光吸收值，結(jié)果表明提取的RNA的A260/A230大于 2. 00^沈0/^觀0在1. 8-2. 0之間，說明RNA純度高，不存在酚類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖的明顯污染。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，RNA質(zhì)量符合Real Time-PCR的實(shí)驗(yàn)要求。 DNase I消化RNA中的基因組DNA 為了確保反轉(zhuǎn)錄所用模板中沒有基因組DNA的污染，在反轉(zhuǎn)錄前用DNase I (Takara Code No. 2270A)處理模板RNA，具體方法和步驟參照說明書。反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA的合成用反轉(zhuǎn)錄用試劑盒(Promega公司，Code no :A3500)，具體方法和步驟如下1)取1 μ g RNA于0. 2ml的EP管中，于70°C溫育十分鐘，短暫離心后置于冰上。2)依照所列順序加入以下試劑以建立一個(gè)20 μ 1的反應(yīng)體系
試劑使用量MgCl2, 25 mM*4 μL反轉(zhuǎn)錄10 χ緩沖液2 μLdNTP混合物，IOmM2 μLRNasin核糖核酸酶抑制劑0.5 μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶(高濃度)20 uOligo(dT)弓 I物0.5 μg加無核酸酶的水至終體積為20 μL3)將反應(yīng)體系于42°C溫育30min。4)將樣品于95°C加熱5min，冰上置5min，反應(yīng)后保存在-20°C，使用前用無核酸酶的水稀釋到100 μ 1。cDNA濃度的調(diào)節(jié)和Real Time PCR引物的效率分析為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確，在進(jìn)行Real Time PCR分析前調(diào)整cDNA的濃度，分析設(shè)計(jì)的Real Time PCR引物的效率。
1) cDNA濃度的初步調(diào)整用半定量PCR完成，按下列組分配制PCR反應(yīng)體系，每一個(gè)樣品的cDNA配制4個(gè)體系。
試劑使用量IOxbuffer2 μLdNTP混合物，IOmM2 μLActin 引物 F(IOnM)1 μLActin 引物 R(IOnM)1 μL第一鏈cDNA2 μLrTaq 酶0.5 u加ddH20至20 μLPCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性^iin，94°C變性40S，56°C復(fù)性30S，72°C延長(zhǎng)45S，四個(gè)PCR反應(yīng)體系分別運(yùn)行25，26，27，28個(gè)循環(huán)。2)取2μ L PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像儀上照相后根據(jù)電泳條帶的亮度粗略判斷不同樣品CDNA的濃度的差異并用ddH20進(jìn)行調(diào)整，使所有樣品的cDNA濃度基本一致。3)設(shè)置梯度實(shí)驗(yàn)分析Real Time PCR引物的效率，梯度實(shí)驗(yàn)的Real Time PCR反應(yīng)體系與正常的反應(yīng)體系(步驟1. 3. 7)只有⑶NA的濃度不同，cDNA的濃度梯度為每20 μ L 加0、0. 25,0. 5、1、2、4μ L第一鏈cDNA。通過分析引物在不同的cDNA濃度下得到的Ct值的差異以及溶解曲線判斷設(shè)計(jì)引物的優(yōu)劣。選擇溶解曲線單一，Ct值的差異和模板的濃度變化較一致的引物用于Real Time PCR分析。Real Time PCR 分析Real Time PCR 分析，所用 OsASIEl 的 PCR 引物如下F 5 ‘ -TGGTCTGATTTGGTAGCC-3 ‘ ；R 5 ‘ -TCCAA GAACTGGCAGACGA-3 ‘； 內(nèi)參基因 Actinl 引物序列為 F:5 ‘ -GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3 ‘ ；R 5' -GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3‘。Real Time PCR 的分析使用 TaKaRa 的 STOR PremixEx Taq 試劑盒(Code no :DRR041A)，應(yīng)用的 Real Time PCR 擴(kuò)增儀為 ABI PRISM7000/7300。1)體系的配制使用8連管，按下列組份配制PCR反應(yīng)液(反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
試劑用量SYBRPremixExTaq (2X )IOul引物 F(IOuM)0.4ul引物 R(IOuM)0.4ulROX Reference Dye (50X )0.4ulcDNA2ulddH206.8ul
2) Real Time PCR反應(yīng)，采用兩步法PCR反應(yīng)程序
Stage 1 預(yù)變性Stage 2 PCR反應(yīng) Stage 3 Dissiociation Stage
Reps 1Reps 40
95°C 30 s95 °C 5 s
60 °C 31 s數(shù)據(jù)分析用相對(duì)定量法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量Rel. Exp = 2_ΔΔα，其中Δ Δ Ct =[(待測(cè)樣品目的基因的Ct-待測(cè)樣品看家基因的Ct)-(對(duì)照組目的基因的Ct-對(duì)照組看家基因的Ct)]。Ct (threshold cycle)值，即臨介循環(huán)數(shù)，為PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，與模板cDNA的起始拷貝數(shù)成反比。相對(duì)定量計(jì)算法通過看家基因把目的基因歸一化(normalization)，所得結(jié)果為待測(cè)基因相對(duì)于對(duì)照目的基因所改變的倍數(shù)，因此該計(jì)算方法減少了由于抽提RNA獲得率的差異所引起的誤差。標(biāo)準(zhǔn)方差的計(jì)算用Excel完成，先用統(tǒng)計(jì)函數(shù)STDEV算出樣品和對(duì)照的S值，再將
兩個(gè)S值算平方，算出(S/+S22) /3的值，進(jìn)而算出X = Power ((S/+S22) /3,0. 5)，最后算出方
差—(2(-ddct-x)_2(-ddct+x))丨c^結(jié)果日本晴中OsASIEI在低溫、高鹽和PEG脅迫下的表達(dá)量變化譜結(jié)果如圖1所示 (圖 1 中，cold:4°C 處理(低溫脅迫)；NaCl :150 mmol L1 NaCl 處理(鹽脅迫)；PEG:20% PEG處理(滲透脅迫)，從圖中可見，在3種脅迫下OsASIEI表達(dá)量都有增高，但是表達(dá)模式存在差異。在低溫和PEG脅迫下，OsASIEI表達(dá)量均呈逐漸上升趨勢(shì)，并在脅迫處理池達(dá)最高水平。然而相比于低溫脅迫，在PEG脅迫下OsASIEI表達(dá)量增加幅度較大，并且在脅迫后期仍能保持較高水平。在鹽脅迫下OsASIEI呈逐步升高的趨勢(shì)，并且表達(dá)量變化幅度較大，最高點(diǎn)到達(dá)20倍以上。以上結(jié)果表明OsASIEI參與水稻對(duì)低溫、鹽和干旱脅迫的早期應(yīng)答，并在應(yīng)答模式上存在差別。OsASIEI在典型抗逆水稻品種中脅迫前后的表達(dá)差異結(jié)果如圖2所示(N 日本晴；L 麗江新團(tuán)黑谷；F :FL478 ；I JRAT109)，圖2中A 冷脅迫下OsASIEI在日本晴(N)和麗江新團(tuán)黑谷(L)中的表達(dá)量差異；圖2中B:鹽脅迫下OsASIEI在日本晴和FL478 (F)中的表達(dá)量差異；圖2中C 干旱脅迫下OsASIEI在日本晴和IRAT109 (I)中的表達(dá)量差異。 結(jié)果表明無論是在葉片中還是在根系中，OsASIEI在典型抗逆水稻品種中的表達(dá)模式與日本晴基本相同，而且在脅迫前后的表達(dá)量和日本晴相比差異也不太顯著。然而，在脅迫前后 OsASIEI在葉和根中的表達(dá)量變化稍有差異，在低溫和干旱脅迫下，OsASIEI在根中的表達(dá)量增幅高于葉片；在鹽脅迫下，OsASIEI在葉片中的表達(dá)量增幅高于根系。二、凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)1、原核表達(dá)蛋白的制備以PCR擴(kuò)增出OsASIEI的AP2保守域(67 193aa)的基因編碼序列(即序列表中序列1第703位-1083位所示的核苷酸序列)，并構(gòu)建到質(zhì)粒pET-32a(Novagen，USA,69015-3)中，在大腸桿菌 BL21(DE3)pLysS (TransGen Biotech, China, Cat. No :DR101) 中進(jìn)行蛋白表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)His-trap柱子純化(GE)，Miliproe超濾管濃縮和脫鹽后，采用 Bradford法測(cè)定蛋白濃度。具體方法如下(I)PCR擴(kuò)増目的基因編碼區(qū)所用引物分別為0sASIEl-AP2-F 5' -GCACTGCAGCAACTCCACATGCAGCGG-3‘(下劃線部分為 Pst I 酶切位點(diǎn))；0sASIEl-AP2-R 5' -TAAGGATCCCCTGGATGAGGCGTTCTTGG-3‘(下劃線部分為 BamH I酶切位點(diǎn))。目的基因的擴(kuò)增采用高保真酶KOD-Plus (Τ0Υ0Β0 Code no :K0D_201)，擴(kuò)增體系為 50 μ 1，依照所列順序加入以下試劑以建立一個(gè)50 μ 1的反應(yīng)體系
試劑使用量10 X KOD -Plus- buffer5 pL2 mM dNTP5 pLMgSO42 μLOsASIE 1-AP2-F (IOuM)1.5 pLOsASIEl-AP2-R (IOuM)1.5 pL模板cDNA2 μLKOD -Plus Polymerase1 μLWddH2O 至50 μLPCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5°C變性30s，退火30s，72°C延伸(lKb/min) ；34個(gè)循環(huán)后 72°C延伸lOmin，然后4°C保存。PCR程序結(jié)束后，取3 μ L PCR產(chǎn)物，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果獲得了 38Ibp 的目的片段。PCR產(chǎn)物的回收回收試劑盒采用TIANGEN公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型，Code no :DP209)，具體操作步驟見產(chǎn)品說明書。將上述回收產(chǎn)物與克隆載體pMD18 (Takara pMD18_T VECTOR試劑盒)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物與Gramene數(shù)據(jù)庫中OsASIEI基因 (0s08g31580)序列AP2結(jié)構(gòu)域相同(即序列表中序列1第703位-1083位所示的核苷酸序列)。酶切連接和轉(zhuǎn)化1)酶切使用TaKaRa的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，雙酶切的體系為50 μ L。雙酶切通用的Buffer和酶切溫度在TaKaRa的網(wǎng)站上(www. takara. com. cn)查詢。酶切3h后DNA和質(zhì)粒pET-32a(NOVagen，USA, 69015-3)分別用DNA回收試劑盒和酒淀法回收。酶切反應(yīng)體系如下
試劑使用量
IOxbuffer2.5 ドL
Pst I1 ドL
BamH I1 jxL
DNA/質(zhì)粒約1ドg
カロddH20至50ドL2)連接DNA片段和載體用jM連接酶(TaKARa Code :D2011A)連接，酶切回收DNA片段和 酶切回收質(zhì)粒的量約為1 3，配制好反應(yīng)體系后在16°C連接反應(yīng)過夜。配制的反應(yīng)體系
如下
試劑使用量
Duffer2.5 jxL
回收NDA片段約0.3 pmol
回收質(zhì)粒約0.03 pmol
T4連接酶1ドL
カロ ddH20至25ドL3)轉(zhuǎn)化取15 ii L連接反應(yīng)液與滅菌的1.5ml離心管中，加入冰上溶解的33 ii L DH5 a (購(gòu) 自北京博邁德生物有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CC02)并用槍吸打混勻，冰浴30min;42°C水浴 熱激Imin,冰浴2min ；加入Iml SOC培養(yǎng)基，37°C，200r恢復(fù)培養(yǎng)Ih ；8000g離心Imin,收集 菌液涂布到含有氨芐青霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜。4)陽性克隆的驗(yàn)證挑取4個(gè)陽性克隆于含有氨芐青霉素(50mg/L)的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C，200i 培養(yǎng)8-12h ；PCR驗(yàn)證陽性克隆，得到的陽性克隆送公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果 表明，在質(zhì)粒pET-32a的I^st I和BamH I酶切位點(diǎn)間插入了序列表中序列1第703位到 1083位所示的核苷酸序列，說明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將重組質(zhì)粒命名為pET-3^i-ASIEl (AP2)。質(zhì)粒的提取質(zhì)粒采用TIANGEN公司的質(zhì)粒回收試劑盒(離心柱型，Code =DP 103)，具體操作步 驟見產(chǎn)品說明書。目的蛋白的制備(1)原核表達(dá)目的蛋白原核表達(dá)目的蛋白的步驟參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南并進(jìn)行局部調(diào)整，具體實(shí)驗(yàn)步驟 如下1)將上述重組質(zhì)粒pET-3^i-ASIEl (AP^轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3) pLysS (TransGen Biotech, China, Cat. No :DR101)。轉(zhuǎn)化物涂布于含有 50 u g/ml 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。3)挑取單克隆，進(jìn)行限制酶切分析和PCR分析驗(yàn)證陽性克隆。4)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定蛋白誘導(dǎo)最佳的IPTG濃度(lmM)、培養(yǎng)時(shí)間(3小時(shí))及培養(yǎng)溫度(28 0C )。5)分別挑取含有陰性對(duì)照質(zhì)粒(即空質(zhì)粒pET_32a)、重組表達(dá)質(zhì)粒的克隆接種至 5ml含50 μ g/ml氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200r/min培養(yǎng)過夜。6)轉(zhuǎn)接Iml培養(yǎng)液于IOOml含50 μ g/ml氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在250ml 的三角瓶中37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(A550 = 0. 5-1. 0)，大約2_汕。7)在培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度lmmOl/LJ8°C，200r/min振蕩培養(yǎng)汕，得到菌體。(2)目的蛋白純化樣品的制備l)4°C，5000rpm離心IOmin收集上一步得到的菌體，去除上清液。2)加入結(jié)合緩沖液(20mM 磷酸鈉(sodium phosphate),0. 5M NaCl，40mM 咪唑 (imidazole), pH7. 4) 5ml重懸菌液，加溶菌酶、PMSF至終濃度lmg/ml、ImM，冰上孵育30min。3)加入Triton X-100至終濃度1 %，超聲波破碎細(xì)胞至溶液不再粘稠。4)4°C，5000g離心15min，回收上清并用0.45 μ M濾膜過濾。(3)目的蛋白的純化使用AKTA purifier 儀器和 Iml 的 His-trap HP 柱子(GE，Code No. 17-5247-01) 純化目的蛋白，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下1)把His-trap HP柱子安裝在AKTA purifier儀器上，用3-5倍柱體積的蒸餾水洗滌柱子。2)用至少5倍體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子，流速為lml/min。3)用注射器把前面制備的裂解物上清液(步驟4)上樣。4)用10-15倍柱體積結(jié)合緩沖液洗滌親和柱，直到吸光率穩(wěn)定。5)用 5-10 倍體積的洗脫緩沖液 QOmM 磷酸鈉(sodium phosphate), 0. 5M NaCl, 500mM咪唑(imidazole)，ρΗ7· 4)洗脫目的蛋白，每份Iml分步收集。6)每份樣品取20μ 1進(jìn)行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析目的蛋白的洗脫分布。7)用Mi 1 iproe 4000超濾管脫鹽和濃縮蛋白。Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度選擇純化后經(jīng)驗(yàn)證條帶單一、濃度較大的幾管目的蛋白采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。具體和方法如下1)配制考馬斯亮蘭G-250染色液取考馬斯亮蘭G_250100mg溶于50mL 95%乙醇中，加IOOmL 85%磷酸，加水稀釋至IL02)配制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液在分析天平上精確稱量0. Ig結(jié)晶牛血清白蛋白于小燒杯內(nèi)，加入少量去離子水溶解后轉(zhuǎn)入IOOmL容量瓶中，燒杯內(nèi)的殘液用少量去離子水沖洗數(shù)次，沖洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸餾水定容至刻度。配制成1000μ g/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液。4)分別取8支試管，編號(hào)，按下表加入試劑，混勻，室溫放置5 30分鐘。
權(quán)利要求
1.序列表中序列2所示的蛋白在增強(qiáng)植物耐鹽性中的應(yīng)用。
2.序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在增強(qiáng)植物耐鹽性中的應(yīng)用；所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-5)中任一所述的基因1)序列表中序列1的自5'末端第703位-1083位所示的DNA分子；2)序列表中序列1的自5'末端第505位-1343位所示的DNA分子；3)序列表中序列1所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或幻或幻所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)或4)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的 DNA分子。
3.含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在增強(qiáng)植物耐鹽性中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在pCUbil390的多克隆位點(diǎn)間插入所述序列表中序列2所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與目的植物相比耐鹽性增強(qiáng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因是通過含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在pCUbi1390的多克隆位點(diǎn)間插入所述序列表中序列2所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，使用增強(qiáng)子。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻OsASIE1基因在增強(qiáng)植物耐鹽性中應(yīng)用。本發(fā)明提供了序列表中序列2所示的蛋白在增強(qiáng)植物耐鹽性中的應(yīng)用、序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在增強(qiáng)植物耐鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OsASIE1基因在受到高鹽和干旱脅迫時(shí)表達(dá)量迅速增加，但受到低溫脅迫時(shí)增加幅度較??；OsASIE1轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合下游基因啟動(dòng)子區(qū)域的GCC box和DRE來調(diào)控下游基因的表達(dá)，參與植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)；在水稻中超表達(dá)OsASIE1基因能夠在一定程度上改善水稻耐鹽脅迫的能力。本發(fā)明為改良、增強(qiáng)水稻抗逆性，加速抗逆分子育種進(jìn)程，具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102304176SQ20111030192
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者傅彬英, 劉曉月, 吳惠敏, 宗瑩, 張婷, 朱苓華, 王文生, 黃立鈺, 黎志康 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所