專利名稱：用于哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞和唾液腺干細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域，尤其涉及哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞和唾液腺干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
唾液腺是哺乳動(dòng)物的重要外分泌腺之一，其分泌物可以幫助消化、保護(hù)黏膜及抗菌抑菌。唾液腺的主要功能是產(chǎn)生和分泌唾液，正常情況下，人每天唾液分泌量約1升至 1.5升。唾液的25%由腮腺分泌，5%由舌下腺分泌，10%由各種小涎腺(唇腺、頰腺、腭腺等)分泌，60%由下頌下腺分泌。目前已從動(dòng)物及人的頌下腺發(fā)現(xiàn)或分離出近30種生物活性多肽，如神經(jīng)生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、內(nèi)皮生長刺激因子(EGSF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、骨髓克隆刺激因子(CSF)、腎素(renin)、激肽釋放酶(kail ikreinAk)、生長抑素、胰島素、淀粉酶、酸性磷酸酶、核糖核酸酶和酯肽酶等。這些多肽物質(zhì)或直接分泌入血， 或隨唾液進(jìn)入消化道再由胃腸吸收入血，對(duì)多種組織和細(xì)胞的生理活動(dòng)起重要調(diào)節(jié)作用。唾液腺的實(shí)質(zhì)部分由腺泡和導(dǎo)管組成。腺泡是腺體的分泌部，由單層腺上皮細(xì)胞圍繞而成。導(dǎo)管是排泄分泌物的管道，由導(dǎo)管上皮細(xì)胞構(gòu)成。現(xiàn)有的研究成果顯示，唾液腺干細(xì)胞很有可能存在于導(dǎo)管部位。因此唾液腺上皮細(xì)胞是形成腺體、分泌和排泄唾液的重要功能細(xì)胞，唾液腺上皮細(xì)胞的功能異常，將會(huì)導(dǎo)致多種唾液腺疾病(1)隨著年齡的增長，腺體的腺泡部分萎縮，導(dǎo)致簡直纖維性變和脂肪細(xì)胞增多，唾液流量減少。這種脂肪細(xì)胞增多是腺泡萎縮后的一種替代現(xiàn)象；(2)米古利茲氏病、舍格林氏綜合征(口干綜合征)。 這是唾液腺的自身免疫性疾病，淋巴細(xì)胞浸潤并取代腺泡；C3)頭頸部腫瘤患者在接受放射性治療后，唾液腺上皮細(xì)胞受到損傷，唾液的分泌也會(huì)顯著減少，影響患者的生存質(zhì)量；唾液腺上皮細(xì)胞發(fā)生惡變形成腫瘤，如多形性腺瘤、腺樣囊性癌等。腫瘤細(xì)胞影響唾液腺的正常機(jī)能，但這些疾病的發(fā)病機(jī)理尚不清楚。因此，明確唾液腺上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性，可以幫助在治療中避免損傷正常唾液腺，并利用唾液腺干細(xì)胞修復(fù)唾液腺組織及其功能。 唾液腺上皮細(xì)胞是研究唾液腺的重要材料，體外培養(yǎng)唾液腺上皮細(xì)胞和唾液腺干細(xì)胞是本研究領(lǐng)域的重要環(huán)節(jié)。以往的唾液腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中添加有血清。血清中的復(fù)雜成分掩蓋了唾液腺上皮細(xì)胞的真實(shí)特性，并加速了唾液腺上皮干細(xì)胞的分化，細(xì)胞無法長期培養(yǎng)和繼代。近幾年市面上出售了進(jìn)口的角化上皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)液，有少數(shù)報(bào)道提示，這種培養(yǎng)液可以培養(yǎng)唾液腺上皮細(xì)胞，并可繼代3-4次。2008年Lombaert等人報(bào)道了用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠頌下腺上皮細(xì)胞(I. M. Lombaert, J. F. Brunsting, P. K. Wierenga, H. H. Kampinga, G. de Haan and R. P.Coppes, Keratinocyte growth factor prevents radiation damage to salivary glands by expansion of the stem/ progenitor pool, Stem Cells 洸 Q008)，2595-2601)，他們?cè)?DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了表皮細(xì)胞生長因子EGFQOng/mL)，成纖維細(xì)胞生長因子FGF2 (20ng/mL)，商品化產(chǎn)品N2 (1/100)，胰島素(10yg/mL)和地塞米松(1 μ Μ)。Ν2是一種商品化產(chǎn)品，其組分不明確， 而且價(jià)格昂貴。EGF和FGF2也是高價(jià)格商品，因此本領(lǐng)域迫切需要一種成本低廉、應(yīng)用性強(qiáng)、適用于唾液腺上皮細(xì)胞和干細(xì)胞的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液。一方面能夠保證實(shí)驗(yàn)過程中唾液腺上皮細(xì)胞的穩(wěn)定生長，另一方面，能夠獲得唾液腺干細(xì)胞。本發(fā)明的目的就是提供一種用于哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞和唾液腺干細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)液及其配制方法和使用方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種無血清培養(yǎng)液，是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加氨基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、緩沖液、激素類化合物、轉(zhuǎn)金屬蛋白、抗氧化劑、血清白蛋白、糖類、嘌呤、嘧啶堿類物質(zhì)以及PH值指示劑?；A(chǔ)培養(yǎng)基是M⑶Β153ΗΑΑ ；或三種培養(yǎng)基M⑶Β153ΗΑΑ培養(yǎng)基、高糖DMEM和 RPMI1640三者混合的培養(yǎng)基；具體的，可以是在MCDB153HAA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加1/20 (ν/ν) 的高糖DMEM和1/20 (ν/ν)的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)配而成，上述該培養(yǎng)基是一種適合上皮細(xì)胞生長的培養(yǎng)基。氨基酸選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺酸、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、 谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、羥基脯氨酸中的一種或幾種；添加含量優(yōu)選谷氨酰胺 600 900mg/L，精氨酸100 300mg/L，亮氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、脯氨酸或賴氨酸20 100mg/L，組氨酸、天冬酰胺酸、蘇氨酸、谷氨酸或甘氨酸含量為10 20mg/L，異亮氨酸、酪氨酸二鈉、丙氨酸、甲硫氨酸或苯基丙氨酸的含量為5 10mg/L，天冬氨酸、色氨酸或羥基脯氨酸的含量為0. 5 5mg/L ；更優(yōu)選氨基酸及含量如下

發(fā)明內(nèi)容
L-谷氨酰胺 L-精氨酸 L-亮氨酸 L-絲氨酸
50-80 mg/L 50-80 mg/L 40-70 mg/L
750-850 mg/L 150-250 mg/L
L-半胱氨酸·Η20L-纈氨酸30-50 mg/LL-脯氨酸20-50 mg/LL-賴氨酸20-50 mg/LL-組氨酸15-20 mg/LL-天冬酰胺酸·Η2015-20 mg/LL-蘇氨酸15-20 mg/LL-谷氨酸10-15 mg/L甘氨酸10-15 mg/LL-異亮氨酸5-10 mg/LL-酪氨酸二鈉5-10 mg/LL-丙氨酸5-10 mg/LL-曱硫氨酸5-10 mg/LL-苯基丙氨酸5-10 mg/LL-天冬氨酸2~5 mg/LL-色氨酸2~5 mg/L羥基脯氨酸0.5-2 mg/L維生素選自生物素、氯化膽堿、葉酸、肌醇、腐胺、泛酸鈣、核黃素、維生素Bi、維生素B6、維生素B12、吡多素HCL、鹽酸硫胺、煙酰胺、胺基安息香酸中的一種或幾種；添加含量優(yōu)選如下，肌醇或氯化膽堿含量為10 30mg/L，葉酸或腐胺1 5mg/L，胺基安息香酸、 泛酸、維生素Bi、維生素B6、維生素B-12、煙酰胺或核黃素的含量是0. 1 lmg/L，生物素 0. 01 0. lmg/L ；更優(yōu)選維生素及含量如下
肌醇15-25 mg/L氯化膽堿10-15 mg/L腐胺1~3 mg/L葉酸1~3 mg/L胺基安息香酸0.1-1 mg/L維生素Bl0.5-1 mg/L泛酸0.1-1 mg/L維生素B-120.1-0.5 mg/L維生素B60.1-0.5 mg/L煙酰胺0.1-0.5 mg/L核黃素0.1-0.5 mg/LD-生物素0.01-0.05 mg/L 鹽類選自氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙酮酸鈉、無水醋酸鈉、硅酸鈉、硝酸鈣、中的一種或幾種；優(yōu)選含量如下氯化鈉5000 7000mg/L，碳酸氫鈉 1000 1500mg/L，無水磷酸二氫鈉、丙酮酸鈉或無水醋酸鈉100 400mg/L，硅酸鈉0. 1 lmg/L,氯化鉀200 500mg/L，氯化鈣或硝酸鈣1 20mg/L ；
更優(yōu)選鹽類及含量如下
氯化鈉5500 7000 mg/L
無水磷酸ニ氫鈉200 350 mg/L
無水醋酸鈉200 350 mg/L
丙酉同酉史孝內(nèi)100 200 mg/L
硅酸鈉.9H200.1 0.5 mg/L
氯化鉀300 400mg/L
無水氯化鈣10 15 mg/L
確酸錦WH2O1 10 mg/L脂類選自油酸、亞油酸、氨基乙醇、硫辛酸中的ー種或幾種；其中優(yōu)選油酸70 140mg/L，氨基乙醇0. 1 L5mg/L，硫辛酸0. 1 1. Omg/L ；更優(yōu)選油酸88 126mg/L，氨 基乙醇0. 48 1. lmg/L，硫辛酸0. 15 0. 2mg/L0微量元素選自硫酸銅、硝酸鐵、硫酸亞鐵、氯化鎂、硫酸鎂、硫酸鋅、偏釩酸銨、亞 硒酸鈉、鉬酸、氯化鎳、氯化錫、硫酸鐵、硫酸錳中的ー種或幾種；優(yōu)選含量如下，氯化鎂 90 140mg/L，硫酸錳、硫酸鐵1 10mg/L，硫酸鋅0. 1 lmg/L，硫酸銅、硝酸鐵或亞硒酸 鈉0. 001 0. 01mg/L，氯化鎳、偏釩酸銨、鉬酸0. 0001 0. 0015mg/L，氯化錫0. 00001 0. 00015mg/L ；更優(yōu)選微量元素及含量如下
氯化鎂.6H20100 120 mg/L
硫酸錳4 8 mg/L
硫酸鐵"H2O1 5 mg/L
硫酸鋅.7H200.1 0.5 mg/L
硫酸銅.5H200.001 0.005 mg/L
確酸鐵.9H200.001 0.005 mg/L
亞硒酸鈉0.001 0.005mg/L
氯化鎳.6H，00.0001 0.0005mg/L
偏釩酸銨0.0001 0.0006 mg/L
鉬酸.4H200.0005 0.0012 mg/L
氯化錫QH2O0.00005 0.00015 mg/L緩沖液為碳酸氫鈉和/或HEPES ；優(yōu)選含量為碳酸氫鈉1000 1500mg/L，HEPES 6000 7000mg/L ；更優(yōu)選含量為碳酸氫鈉 1180 1210mg/L，HEPES6600 6700mg/L。激素類化合物為胰島素，優(yōu)選1 20mg/L，更優(yōu)選1. 6 12. 8mg/L ；轉(zhuǎn)金屬蛋白為轉(zhuǎn)鐵蛋白，優(yōu)選3 8mg/L，更優(yōu)選3. 6 5. 8mg/L ；血清白蛋白為牛血清白蛋白，優(yōu)選400 700mg/L，更優(yōu)選450 600mg/L ；糖類為葡萄糖和丙酮酸鈉，優(yōu)選葡萄糖3000 4000mg/L、丙酮酸45 57mg/L ；抗氧化劑為P -巰基乙醇和/或谷胱甘肽，優(yōu)選P -巰基乙醇0. 52 0. 88mg/L,谷胱甘肽0. 04 0. 06mg/L ；嘌呤類為腺嘌呤，優(yōu)選27 ^mg/L ；所述嘧啶堿類物質(zhì)為胸腺嘧啶，優(yōu)選0. 6pH值指示劑酚紅，優(yōu)選8 9mg/L。更優(yōu)選的，上述培養(yǎng)液的添加組合如下
偏釩酸銨無水氯化鈣硝酸鈣·4Η20 硫酸銅·5Η20 硫酸鐵·7Η20 硝酸鐵·9Η20 氯化鎂·6Η20 石充酸錳鉬酸·4Η20 氯化鎳·6Η20 氯化鉀無水醋酸鈉氯化鈉碳酸氫鈉
0. 75mg/L ；
0.0004-0.0006 mg/L 12-15 mg/L
3-7mg/L 0.002-0.003 mg/L 1-1.5 mg/L 0.003-0.005 mg/L 108-120 mg/L
4-6mg/L
0.0009-0.0012 mg/L 0.0001-0.00015 mg/L 340-380 mg/L 250-290 mg/L 6000-6700 mg/L 1180-1210 mg/L硅酸鈉·9Η200.11-0.14 mg/L無水碟酸二氫鈉295-320 mg/L丙酮酸鈉100-120 mg/L氯化錫·2Η200.00009-0.00015 mg/L硫酸鋅·7Η200.11 0.18 mg/LL-丙氨酸7 9 mg/LL-精氨酸190 210 mg/LL-天冬酰胺酸·Η2016-19 mg/LL-天冬氨酸4.2-5 mg/LL-半胱氨酸·Η2043 46 mg/LL-谷氨酸14.5-15 mg/LL-谷氨酰胺790-810 mg/L甘氨酸13-14 mg/LL-組氣酸16-19 mg/LL-異亮氨酸9-10 mg/LL-亮氨酸64-68 mg/LL-賴氨酸24 27 mg/LL-曱硫氨酸6-7.5 mg/LL-苯基丙氨酸6-6.6 mg/LL-脯氨酸30-34 mg/L羥基脯氨酸0.8 1.1 mg/LL-絲氣酸59-63 mg/LL-蘇氣酸15.5-18 mg/LL-色氣酸3.5 4 mg/LL-酪氨酸二鈉9-10 mg/LL-纈氣酸37 39 mg/LD-生物素0.02-0.03 mg/L氯化膽堿12-14 mg/L葉酸1.5-1.8 mg/L月幾醇19~20mg/L煙酰胺0.2 0.3 mg/L胺基安息香酸0.4 0.7 mg/L泛酸0.38-0.55 mg/L維生素Β60.29 0.35 mg/L核黃素0.1 0.13 mg/L維生素Bl0.5-0.6 mg/L維生素Β-120.3-0.4 mg/L腺嘌呤27-29 mg/L葡萄糖3000 4000 mg/L谷胱甘肽0.04-0.06 mg/LHEPES6600-6700 mg/L酚紅8-9 mg/L腐胺2.5-3 mg/L丙酮酸45-57 mg/L疏辛酸0.15-0.2 mg/L胸腺嘧啶0.6-0.75 mg/Lβ-巰基乙醇0.52-0.88mg/L氨基乙醇0.48-1.lmg/L亞石西酸鈉0.0017~0.002mg/L胰島素1.6~12.8mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白3.6~5.8mg/L牛血清白蛋白450~600mg/L油酸88~126mg/L上述無血清細(xì)胞培養(yǎng)液可以用于哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)，也可以用于其他正常上皮組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)，優(yōu)選乳腺上皮、胰腺上皮，皮膚角化上皮，粘膜上皮。進(jìn)一步的，上述培養(yǎng)液中還可以添加12 15mg/L牛腦提取物(BPE)，BPE是一種多種生長因子的混合物，從牛的垂體組中提取，可以有效地促進(jìn)細(xì)胞增殖。上述獲得的培養(yǎng)液用于更好的培養(yǎng)富集哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞，也可以用于其他正常上皮組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)，正常上皮組織優(yōu)選乳腺上皮、胰腺上皮，皮膚角化上皮，粘膜上皮等。本發(fā)明無血清細(xì)胞培養(yǎng)液的使用方法是將哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞置于前述無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)；或?qū)⒉溉閯?dòng)物唾液腺上皮組織的組織塊剪碎或消化成單細(xì)胞接種到前述的無血清培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)，在37°C，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48-7 后，即可獲得上皮細(xì)胞?；蛘呤鞘共溉閯?dòng)物正常上皮組織細(xì)胞置于所述的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，或?qū)⒉溉閯?dòng)物上皮組織的組織塊剪碎或消化成單細(xì)胞接種到所述的無血清培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)， 在37°C，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48-7 后，即可獲得上皮細(xì)胞。正常上皮組織包括乳腺上皮細(xì)胞、胰腺上皮，皮膚角化上皮，粘膜上皮等。可以選擇的，上述培養(yǎng)液中不添加BPE，進(jìn)一步添加人FGF2、肝素鈉、L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽和谷丙氨酸二肽，用于培養(yǎng)富集哺乳動(dòng)物唾液腺干細(xì)胞。其中，將谷丙氨酸二肽應(yīng)用于唾液腺上皮干細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)，谷丙氨酸二肽在培養(yǎng)條件下比較穩(wěn)定，不僅可以持續(xù)為干細(xì)胞提供能量，而且可以避免因自然代謝而造成的有毒代謝物的積累；添加的L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽是一種比維生素C更穩(wěn)定的抗氧化劑，它在培養(yǎng)液中可以長時(shí)間保持活性，大大延緩?fù)僖合偕掀じ杉?xì)胞衰老的速度，且有助于維持干細(xì)胞的特性；進(jìn)一步添加了肝素鈉，以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)FGF2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。上述無血清細(xì)胞培養(yǎng)液用于培養(yǎng)唾液腺上皮干細(xì)胞，具體的使用方法是將哺乳動(dòng)物正常唾液腺上皮干細(xì)胞置于上述獲得的無血清培養(yǎng)液中在37°C，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。本發(fā)明另一方面提供了上述無血清培養(yǎng)液的配制方法，包括以下步驟(1)以MCDB153HAA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加氨基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、緩沖液、激素類化合物、轉(zhuǎn)金屬蛋白、抗氧化劑、血清白蛋白、糖類、嘌呤、嘧啶堿類物質(zhì)以及PH值指示劑；(2)加入12 15mg/L的牛腦提取物(BPE)在步驟(1)所得到的培養(yǎng)液中；或分別添加9. 5 12. 5mg/L的L-抗壞血酸_2_磷酸三鈉鹽，0. 3 lmg/L的肝素鈉，5 20 μ g/ L的FGF2和400-460mg/L的谷丙氨酸二肽至步驟(1)所得到的培養(yǎng)液中。具體的，可以是直接選用MCDB153HAA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，或是在MCDB153HAA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加1/20 (ν/ν)的高糖DMEM和1/20 (ν/ν)的RPMI1640培養(yǎng)基的成分調(diào)配而成的。該培養(yǎng)基是一種適合上皮細(xì)胞生長的培養(yǎng)基。接下來，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加氨基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、緩沖液、血清白蛋白制備基礎(chǔ)培養(yǎng)液，將酸堿度調(diào)至7. 0 7. 2，經(jīng)過濾滅菌處理；再添加轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、氨基乙醇、亞硒酸鈉、β -巰基乙醇得到進(jìn)一步的培養(yǎng)液；可以向培養(yǎng)液中加入12 15mg/L的牛腦提取物(BPE)；或分別添加9.5 12. 5mg/L的L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽，0. 3 lmg/L的肝素鈉，5 20 μ g/L的TOF2和 400-460mg/L的谷丙氨酸二肽至上述得到的培養(yǎng)液中。其中，上述組分溶解于無熱源超純水中(電阻率為18. 2Ω)配置而成。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液可以使培養(yǎng)的細(xì)胞保持良好的增殖能力和生物學(xué)特性。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液的積極效果是(1)不含血清，實(shí)驗(yàn)體系清晰、成份確定，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，避免了不可知成份所造成的實(shí)驗(yàn)背景不清對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果所帶來的影響；(2)本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液中如添加BPE，可極大地促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和細(xì)胞成活率，為實(shí)驗(yàn)提供充足的細(xì)胞數(shù)量；(3)適用范圍廣，適用于多種類型的哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，如乳腺上皮細(xì)胞、 胰腺上皮細(xì)胞和角化上皮細(xì)胞等；(4)適用于唾液腺干細(xì)胞培養(yǎng)，在3-D Matrigel培養(yǎng)體系中可以分化成為唾液腺導(dǎo)管或腺泡。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液成分明確，添加物成分簡單易配制，成本更低廉，應(yīng)用范圍更廣范。本發(fā)明用上述成分代替?zhèn)鹘y(tǒng)有血清培養(yǎng)液，避免了血清組分對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影響。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液可以有效地抑制原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中成纖維細(xì)胞的生長，因而可以得到純度較高的上皮細(xì)胞。


圖1所示為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人原代頌下腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞圖。圖2所示為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人原代頌下腺腺泡上皮細(xì)胞圖。圖3所示為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人原代腮腺上皮細(xì)胞圖。圖4所示為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人原代舌下腺上皮細(xì)胞圖。圖5所示為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠頌下腺上皮細(xì)胞圖。圖6所示為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠原代胰腺上皮細(xì)胞圖。圖7所示為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠原代頌下腺上皮細(xì)胞圖。圖8所示為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠頌下腺上皮細(xì)胞系第42代細(xì)胞圖。圖9所示為本發(fā)明不含BPE的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人頌下腺導(dǎo)管干細(xì)胞圖。圖10(a)-10(d)所示為根據(jù)本發(fā)明制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液三維立體培養(yǎng)人頌下腺導(dǎo)管干細(xì)胞圖。圖11所示為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠頌下腺上皮細(xì)胞系第42代細(xì)胞的核型分析。圖12(a)和12(b)所示為本發(fā)明不含BPE的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠頌下腺上皮細(xì)胞系第42代對(duì)表皮細(xì)胞生長因子EGF和成纖維細(xì)胞生長因子FGFl的反應(yīng)性。圖13所示為本發(fā)明不含BPE的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠頌下腺上皮細(xì)胞對(duì)表皮細(xì)胞生長因子EGF、成纖維細(xì)胞生長因子FGFl和牛腦提取物BPE的反應(yīng)性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明用于哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)液，是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基 MCDB153HAA中添加如下成分氨基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、激素、緩沖劑及葡萄糖、非必須氨基酸、胸苷、次黃嘌呤、酚紅、巰基乙醇、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白，其各組分的含量見如下實(shí)施例1 6所示，將各實(shí)施例中組分溶解于無熱源超純水中(電阻率為 18. 2 Ω)配置而成。實(shí)施例1
偏釩酸銨0.0004 mg/L無水氯化鈣UmgfL硝酸鈣·4Η203 mg/L硫酸銅·5Η200.002 mg/L硫酸鐵·7Η201 mg/L硝酸鐵·9Η200.003 mg/L氯化鎂·6Η20108 mg/L石充酸錳4 mg/L鉬酸·4Η200.0009 mg/L氯化鎳·6Η200.0001 mg/L氯化鉀340 mg/L無水醋酸鈉250 mg/L
14
氯化鈉6000 mg/L碳酸氫鈉1180 mg/L硅酸鈉·9Η200.11 mg/L無水磷酸二氫鈉295 mg/L丙酮酸鈉100 mg/L氯化錫·2Η200.00009 mg/L硫酸鋅·7Η200.11 mg/LL-丙氨酸7 mg/LL-精氨酸190 mg/LL-天冬酰胺酸·Η2016 mg/LL-天冬氨酸4.2 mg/LL-半胱氨酸·Η2043 mg/LL-谷氨酸14.5 mg/LL-谷氨酰胺790 mg/L甘氨酸13 mg/LL-組氨酸16 mg/LL-異亮氨酸9 mg/LL-亮氨酸64 mg/LL-賴氨酸24 mg/LL-曱硫氨酸6 mg/LL-苯基丙氨酸6 mg/LL-脯氨酸30 mg/L羥基脯氨酸0.8 mg/LL-絲氨酸59 mg/LL-蘇氨酸15.5 mg/LL-色氨酸3.5 mg/LL-酪氨酸二鈉9 mg/LL-纈氛酸37 mg/LD-生物素0.02 mg/L氯化膽堿12 mg/L葉酸1.5 mg/L肌醇19 mg/L煙酰胺0.2 mg/L胺基安息香酸0.4 mg/L泛酸0.38 mg/L維生素Β60.29 mg/L核黃素0.1 mg/L維生素Bl0.5 mg/L維生素B-120.3 mg/L腺嘌呤27 m￡/L葡萄糖谷胱甘肽 HEPES 酚紅腐胺丙酮酸疏辛酸胸腺嘧啶 β-巰基乙醇氨基乙醇亞石西酸鈉
胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白牛血清白蛋白油酸
牛腦提取物實(shí)施例2
偏釩酸銨無水氯化鈣硝酸鈣·4Η20 硫酸銅·5Η20 硫酸鐵·7Η20 硝酸鐵·9Η20 氯化鎂·6Η20 石充酸錳鉬酸·4Η20 氯化鎳·6Η20 氯化鉀無水醋酸鈉氯化鈉碳酸氫鈉硅酸鈉·9Η20 無水碟酸二氫鈉丙酮酸納氯化錫·2Η20 硫酸鋅·7Η20 L-丙氨酸
3000 mg/L 0.04 mg/L 6600 mg/L 8 mg/L
2.5mg/L 45 mg/L 0.15 mg/L 0.6 mg/L 0.52 mg/L 0.48 mg/L 0.0017 mg/L
1.6mg/L 3.6 mg/L 450 mg/L 88 mg/L 12 mg/L
0.000526 mg/L 13 mg/L 5 mg/L 0.00247 mg/L 1.25 mg/L 0.0045 mg/L 110.4 mg/L 5.000136 mg/L 0.00112 mg/L 0.00011 mg/L 360 mg/L 271.38 mg/L 6540 mg/L 1200 mg/L 0.128 mg/L 301.88 mg/L 110 mg/L 0.000102 mg/L 0.130 mg/L 8.02 mg/L
16L-精氨酸203.8 mg/L
L-天冬酰胺酸-H2O16 mg/L
L-天冬氨酸4.59 mg/L
L-半胱氨酸.H2O44.18 mg/L
L-谷氨酸14.24 mg/L
L-谷氨酰胺804.5 mg/L
甘氨酸1326 mg/L
L-組氣酸17.94 mg/L
L-異亮氨酸9.271 mg/L
L-亮氨酸66.5 mg/L
L-賴氣酸25.74 mg/L
L-甲破L氨酸6.55 mg/L
L-笨基丙氨酸6.28 mg/L
L-脯氨酸32.08 mg/L
羥基脯氨酸1 mg/L
L-絲氨酸60.35 mg/L
L-蘇氨酸16.42 mg/L
L-色氨酸3.8 mg/L
L-酪氨酸二鈉9.67 mg/L
L-纈氣酸37 J2 mg/L
D-生物素0.0231 mg/L
氯化膽堿12.91 mg/L
葉酸1.61 mg/L
肌醇19.33 mg/L
煙酰胺0.28297 mg/L
胺基安息香酸0.5 mg/L
泛酸0.4265 mg/L
維生素B60.30554 mg/L
核黃素0.1038 mg/L
維生素Bl0.553 mg/L
維生素B-120.3665 mg/L
腺嘌呤27.79 mg/L
葡萄糖3000 mg/L
谷胱甘肽0.05 mg/L
HEPES6625.8 mg/L
酚紅8.618 mg/L
腐胺2.845 mg/L
丙酮酸50 mg/L
硫辛酸0.185 mg/L
胸腺嘧啶0.654 mg/L
實(shí)施例3
β-巰基乙醇氨基乙醇亞石西酸鈉
胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白牛血清白蛋白油酸
牛腦提取物
偏釩酸銨無水氯化鈣硝酸鈣·4Η20 石充酸銅·5Η20 硫酸鐵·7Η20 硝酸鐵·9Η20 氯化鎂·6Η20 疏酸鍤鉬酸·4Η20 氯化鎳·6Η20 氯化鉀無水醋酸鈉氯化鈉碳酸氫鈉硅酸鈉·9Η20 無水碟酸二氫鈉丙酮酸鈉氯化錫·2Η20 硫酸鋅·7Η20 L-丙氨酸 L-精氨酸
L-天冬酰胺酸·Η20 L-天冬氨酸 L-半胱氨酸·Η20 L-谷氨酸 L-谷氨酰胺甘氨酸 L-組氨酸
0.7 mg/L 0.8 mg/L 0.0019 mg/L 10 mg/L 4.58 mg/L 500 mg/L 100 mg/L 12.5 mg/L
0.0006 mg/L 15 mg/L 7 mg/L 0.003 mg/L 1.5 mg/L 0.005 mg/L 120 mg/L 6 mg/L 0.0012 mg/L 0.00015 mg/L 380 mg/L 290 mg/L 6700 mg/L 1210 mg/L 0.14 mg/L 320 mg/L 120 mg/L 0.00015 mg/L 0.18 mg/L 9 mg/L 210 mg/L 19 mg/L 5 mg/L 46 mg/L 15 mg/L 810 mg/L 14 mg/L 19 mg/LL-異亮氨酸10mg/LL-亮氨酸68 mg/LL-賴氨酸27 mg/LL-曱硫氨酸7.5 mg/LL-苯基丙氨酸6.6 mg/LL-脯氨酸34 mg/L羥基脯氨酸1.1 mg/LL-絲氣酸63 mg/LL-蘇氨酸18 mg/LL-色氨酸4 mg/LL-酪氨酸二鈉10 mg/LL-纈氨酸39 mg/LD-生物素0.03 mg/L氯化膽堿14 mg/L葉酸1.8 mg/L肌醇20 mg/L煙酰胺0.3 mg/L胺基安息香酸0.7 mg/L泛酸0.55 mg/L維生素B60.35 mg/L核黃素0.13 mg/L維生素Bl0.6 mg/L維生素B-120.4 mg/L腺嘌呤29 mg/L葡萄糖4000 mg/L谷胱甘肽0.06 mg/LHEPES6700 mg/L酚紅9 mg/L腐胺3 mg/L丙酮酸57 mg/L硫辛酸0.2 mg/L胸腺嘧啶0.75 mg/Lβ-巰基乙醇0.88 mg/L氨基乙醇1.1 mg/L亞袖酸鈉0.002 mg/L胰島素12.8 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白5.8 mg/L牛血清白蛋白600 mg/L油酸126 mg/L牛腦提取物15 mg/L實(shí)施例4與實(shí)施例1相比，該實(shí)施例中不添加BPE，另外添加9. 5mg/L的L-抗壞血酸_2_磷酸三鈉鹽，0. 3mg/L的肝素鈉，5 μ g/L的FGF2和400mg/L的谷丙氨酸二肽，其他添加成分及含量與實(shí)施例1相同。實(shí)施例5與實(shí)施例2相比，該實(shí)施例中不添加BPE，另外添加11. 5mg/L的L-抗壞血酸_2_磷酸三鈉鹽，0. 6mg/L的肝素鈉，15 μ g/L的FGF2和420mg/L的谷丙氨酸二肽，其他添加成分及含量與實(shí)施例2相同。實(shí)施例6與實(shí)施例3相比，該實(shí)施例中不添加BPE，另外添加12. 5mg/L的L-抗壞血酸_2_磷酸三鈉鹽，lmg/L的肝素鈉，20 μ g/L的FGF2和460mg/L的谷丙氨酸二肽，其他添加成分及含量與實(shí)施例3相同。實(shí)施例7如圖9所示，為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人頌下腺導(dǎo)管上皮干細(xì)胞圖。在該實(shí)施例中，為培養(yǎng)5-7天獲得的唾液腺上皮干細(xì)胞。實(shí)施例8應(yīng)用三維立體培養(yǎng)的方法，觀察導(dǎo)管形成情況。培養(yǎng)10天后，利用免疫熒光染色的分析方法，檢測實(shí)施例7的唾液腺干細(xì)胞中α-amylase的表達(dá)。如圖10(a)-10(d) 所示，在Matrigel中干細(xì)胞形成導(dǎo)管狀，藍(lán)色熒光是細(xì)胞核染料DAPI，綠色熒光是 α -amylase (唾液腺上皮細(xì)胞特異性分子標(biāo)志物)抗體染色。實(shí)施例9利用核型分析方法，檢測小鼠頌下腺上皮細(xì)胞系。如圖11所示，為本發(fā)明無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠頌下腺上皮細(xì)胞系第42代細(xì)胞的核型分析，結(jié)果顯示核型正常，為二倍體，表明經(jīng)過長期培養(yǎng)和連續(xù)傳代后，細(xì)胞仍保持健康的狀態(tài)。實(shí)施例10圖12所示為本發(fā)明不含BPE的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠頌下腺上皮細(xì)胞系第 42代對(duì)表皮細(xì)胞生長因子EGF和成纖維細(xì)胞生長因子FGFl的反應(yīng)性。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞播種至M孔板，每孔10000個(gè)細(xì)胞；24小時(shí)后分別加入不同濃度的EGF或FGFl。如圖12(a)和(b)所示，生長因子添加5天后計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，第42代細(xì)胞仍然對(duì)兩種生長因子有明顯反應(yīng)，與第7代細(xì)胞沒有明顯差異。圓形標(biāo)記代表第7代細(xì)胞，三角形標(biāo)記代表第42代細(xì)胞。圖13所示為本發(fā)明不含BPE的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠頌下腺上皮細(xì)胞對(duì)表皮細(xì)胞生長因子EGF、成纖維細(xì)胞生長因子FGFl和牛腦提取物BPE的反應(yīng)性。白色圓形標(biāo)記代表同時(shí)添加EGF (InM)和FGF (IOOpM)，正方形標(biāo)記代表只添加FGF (IOOpM)，三角形標(biāo)記代表只添加EGF(InM)，黑色圓形標(biāo)記代表添加BPE (15mg/mL)。如圖13所示，一定量的生長因子添加后，每天計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，共計(jì)6天。結(jié)果表明，在培養(yǎng)液中添加BPE可以顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。
權(quán)利要求
1.用于哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)液，其特征在于，是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加氨基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、緩沖液、激素類化合物、轉(zhuǎn)金屬蛋白、抗氧化劑、血清白蛋白、糖類、嘌呤、嘧啶堿類物質(zhì)以及PH值指示劑；其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MCDBl53HAA，或MCDBl53HAA培養(yǎng)基、高糖DMEM和RPMI1640三者混合的培養(yǎng)基；所述氨基酸選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺酸、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、羥基脯氨酸中的一種或幾種；所述維生素選自生物素、氯化膽堿、葉酸、肌醇、腐胺、泛酸鈣、核黃素、維生素Bi、維生素B6、維生素B12、吡多素HCL、鹽酸硫胺、煙酰胺、胺基安息香酸中的一種或幾種；所述鹽類選自氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙酮酸鈉、無水醋酸鈉、碳酸氫鈉、硅酸鈉、硝酸鈣、中的一種或幾種；所述脂類選自油酸、亞油酸、氨基乙醇、硫辛酸中的一種或幾種； 所述微量元素選自硫酸銅、硝酸鐵、硫酸亞鐵、氯化鎂、硫酸鎂、硫酸鋅、偏釩酸銨、亞硒酸鈉、鉬酸、氯化鎳、氯化錫、硫酸鐵、硫酸錳中的一種或幾種； 所述緩沖液為碳酸氫鈉和/或HEPES ； 所述激素類化合物為胰島素； 所述轉(zhuǎn)金屬蛋白為轉(zhuǎn)鐵蛋白； 所述抗氧化劑為β-巰基乙醇和/或谷胱甘肽； 所述血清白蛋白為牛血清白蛋白； 所述糖類為葡萄糖和/或丙酮酸鈉； 所述嘌呤為腺嘌呤； 所述嘧啶堿類物質(zhì)為胸腺嘧啶；和所述PH值指示劑酚紅。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)液，其特征在于，所述添加成分含量如下所述氨基酸為谷氨酰胺600 900mg/L，精氨酸100 300mg/L，亮氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、脯氨酸或賴氨酸20 70mg/L，組氨酸、天冬酰胺酸、蘇氨酸、谷氨酸或甘氨酸含量為10 20mg/L，異亮氨酸、酪氨酸二鈉、丙氨酸、甲硫氨酸或苯基丙氨酸的含量為5 10mg/L，天冬氨酸、色氨酸或羥基脯氨酸的含量為0. 5 5mg/L ；所述維生素為肌醇或氯化膽堿含量為10 30mg/L，葉酸或腐胺1 :3mg/L，胺基安息香酸、泛酸、維生素Bi、維生素B6、維生素B-12、煙酰胺或核黃素的含量是0. 1 lmg/L，生物素 0.01 0. lmg/L ；所述鹽類為氯化鈉5000 7000mg/L，碳酸氫鈉1000 1500mg/L，無水磷酸二氫鈉、丙酮酸鈉或無水醋酸鈉100 400mg/L，硅酸鈉0. 1 lmg/L，氯化鉀200 500mg/L，氯化鈣或硝酸鈣1 20mg/L ；所述脂類為油酸88 126mg/L，氨基乙醇0. 48 1. lmg/L，硫辛酸0. 15 0. 2mg/L ； 所述微量元素為氯化鎂100 120mg/L，硫酸錳、硫酸鐵1 10mg/L，硫酸鋅0. 1 lmg/L，硫酸銅、硝酸鐵或亞硒酸鈉0. 001 0. 0lmg/L,氯化鎳、偏釩酸銨、鉬酸0. 0001 0. 0015mg/L,氯化錫 0. 00001 0. 00015mg/L ；所述緩沖液為碳酸氫鈉1180 1210mg/L，HEPES 6600 6700mg/L ；胰島素1. 6 12. 8mg/L ；轉(zhuǎn)鐵蛋白3. 6 5. 8mg/L ；牛血清白蛋白450 600mg/L ；葡萄糖3000 4000mg/L、丙酮酸45 57mg/L ；β -巰基乙醇0. 52 0. 88mg/L,谷胱甘肽0. 04 0. 06mg/L ；腺嘌呤27 29mg/L ；胸腺嘧啶0. 6 0. 75mg/L ；和酚紅8 9mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)液，其特征在于，包括以下成分及含量偏釩酸銨0.0004-0.0006 mg/L無水氯化鈣12-15 mg/L硝酸鈣·4Η203~7 mg/L硫酸銅·5Η200.002-0.003 mg/L硫酸鐵·7Η201-1.5 mg/L硝酸鐵·9Η200.003-0.005 mg/L氯化鎂·6Η20108-120 mg/L石充酸錳4~6 mg/L鉬酸·4Η200.0009-0.0012 mg/L氯化鎳·6Η200.0001-0.00015 mg/L氯化鉀340-380 mg/L無水醋酸鈉250-290 mg/L氯化鈉6000-6700 mg/L碳酸氫鈉1180-1210 mg/L硅酸鈉·9Η200.11-0.14 mg/L無水碟酸二氫鈉295-320 mg/L丙酮酸納100-120 mg/L氯化錫·2Η200.00009-0.00015 mg/L硫酸鋅·7Η200.11-0.18 mg/LL-丙氨酸7~9 mg/LL-精氨酸190-210 mg/LL-天冬酰胺酸·Η2016-19 mg/LL-天冬氨酸4.2-5 mg/LL-半胱氨酸·Η2043-46 mg/LL-谷氨酸14.5-15 mg/LL-谷氣酰胺790-810 mg/L甘氨酸13 14 mg/LL-組氨酸16-19 mg/LL-異亮氨酸9-10 mg/LL-亮氨酸64-68 mg/LL-賴氨酸24 27 mg/LL-甲硫氨酸6-7.5 mg/LL-笨基丙氨酸6 6.6 mg/LL-脯氨酸30-34 mg/L羥基脯氨酸0.8 1.1 mg/LL-絲氣酸59-63 mg/LL-蘇氨酸15.5-18 mg/LL-色氨酸3.5-4 mg/LL-酪氨酸二鈉9-10 mg/LL-纈氨酸3 7 3 9 mg/LD-生物素0.02-0.03 mg/L氯化膽堿12-14 mg/L葉酸1.5 1.8 mg/L肌醇19-20 mg/L煙酰胺0.2-0.3 mg/L胺基安息香酸0.4-0.7 mg/L泛酸0.38-0.55 mg/L維生素Β60.29-0.35 mg/L核黃素0.1 0.13 mg/L維生素Bl0.5 0.6 mg/L維生素Β-120.3-0.4 mg/L腺嘌呤27 29 mg/L葡萄糖3000-4000 mg/L谷胱甘肽0.04-0.06 mg/LHEPES6600 6700 mg/L酚紅8 9 mg/L腐胺2.5-3 mg/L丙酮酸45-57 mg/L疏辛酸0.15 0.2 mg/L胸腺嘧啶0.6-0.75 mg/Lβ-巰基乙醇0.52~0.88mg/L氨基乙醇亞石西酸鈉胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白`1.6~12.8mg/L 3.6~5.8mg/L 450~600mg/L 88~126mg/L`0.48-1.lmg/L 0.0017 0.002mg/L牛血清白蛋白油酸
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的無血清培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中還添加 12 15mg/L牛腦提取物。
5.用于哺乳動(dòng)物唾液腺干細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)液，其特征在于，是在權(quán)利要求1 3任一所述的無血清培養(yǎng)液中添加9. 5 12. 5mg/L的L-抗壞血酸_2_磷酸三鈉鹽，`0. 3 lmg/L的肝素鈉，5 20 μ g/L的FGF2和400_460mg/L的谷丙氨酸二肽。
6.權(quán)利要求1 5任一所述的無血清培養(yǎng)液的配制方法，包括以下步驟(1)以MCDB153HAA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加氨基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、緩沖液、 激素類化合物、轉(zhuǎn)金屬蛋白、抗氧化劑、血清白蛋白、糖類、嘌呤、嘧啶堿類物質(zhì)以及PH值指示劑；(2)加入12 15mg/L的牛腦提取物(BPE)在步驟(1)所得到的培養(yǎng)液中；或分別添加9. 5 12. 5mg/L的L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽，0. 3 lmg/L的肝素鈉，5 20 μ g/L 的FGF2和400-460mg/L的谷丙氨酸二肽至步驟(1)所得到的培養(yǎng)液中。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是在 MCDB153HAA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加l/20(v/v)的高糖DMEM和l/20(v/v)的RPMI1640培養(yǎng)基的成分調(diào)配而成。
8.權(quán)利要求1 4任一所述的無血清培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于，將哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞置于所述無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)；或?qū)⒉溉閯?dòng)物唾液腺上皮組織的組織塊剪碎或消化成單細(xì)胞接種到所述無血清培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)，在37°C，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
9.權(quán)利要求1 4任一所述的無血清培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于，使哺乳動(dòng)物正常上皮組織細(xì)胞置于權(quán)利要求1 3所述的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)；或?qū)⒉溉閯?dòng)物上皮組織的組織塊剪碎或消化成單細(xì)胞接種到如權(quán)利要求1 3所述的無血清培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)，在37°C，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)；所述正常上皮組織是胰腺上皮、粘膜上皮、乳腺上皮、皮膚角化上皮。
10.權(quán)利要求5所述的無血清培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于，在37°C，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)唾液腺上皮干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞和唾液腺干細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液是以MCDB153HAA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加氨基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、緩沖液、激素類化合物、轉(zhuǎn)金屬蛋白、抗氧化劑、血清白蛋白、糖類、嘌呤、嘧啶堿類物質(zhì)以及pH值指示劑制成。本發(fā)明的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液不僅能使哺乳動(dòng)物唾液腺上皮細(xì)胞生長旺盛，維持其良好的細(xì)胞活性和生理特性，而且也適合唾液腺上皮干細(xì)胞的培養(yǎng)，非常適用于生物組織工程相關(guān)研究領(lǐng)域，是一種可以商品化的細(xì)胞培養(yǎng)液。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102399742SQ20111030310
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者張雁, 汪華 申請(qǐng)人:東莞中山大學(xué)研究院