專利名稱：擴增青蝦gih-a和青蝦gih-b的引物組及其擴增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因克隆領(lǐng)域，特別涉及擴增青蝦GIH基因的引物組及擴增方法。
背景技術(shù)：
青蝦，學(xué)名日本沼蝦(MacrobrachiUin nipponense)，隸屬十足目(Decapoda)，長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)，廣泛分布于全國各地，是我國重要的淡水養(yǎng)殖蝦類。近年來青蝦出現(xiàn)了種質(zhì)資源退化嚴重，規(guī)格小、性早熟等現(xiàn)象成為制約青蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。解決這些生產(chǎn)問題的關(guān)鍵在于對青蝦的生長發(fā)育、繁殖、蛻皮等調(diào)控機理的掌握。已有研究表明，性腺抑制激素(Gonad-inhibting hormone, GIH)作為甲殼動物眼柄中合成分泌的甲殼動物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone, CHH)家族神經(jīng)肽的重要成員之一，在調(diào)控甲殼運物的蛻皮、變態(tài)發(fā)育、生殖、血糖平衡以及體內(nèi)的滲透壓等方面起著重要的作用。GIH在雌性個體中又稱為卵黃發(fā)生抑制激素(vitellogensis inhibiting bormone，VIH)，其主要作用是抑制雌性蝦蟹的卵黃發(fā)生作用。目前有關(guān)青蝦的研究主要集中在生物學(xué)特性、核型分析、養(yǎng)殖技術(shù)、病害防治和營養(yǎng)飼料以及群體遺傳學(xué)等方面，而關(guān)于青蝦眼柄神經(jīng)激素的克隆研究還尚未報道。在美洲鰲龍蝦、歐洲鰲龍蝦iBoimrus ^a—r^s)、挪威海螯蝦、刀額新對蝦、斑節(jié)對蝦，羅氏沼蝦、沿fflicaris Karrei和普通卷甲蟲中已經(jīng)克隆獲得了 GIH cDNA序列。研究表明，已獲得的GIH cDNA序列所編碼的GIH前體均由一個信號肽和一個成熟肽組成，信號肽的長度為31aa、23aa、17aa、3^ia、;Maa不等，成熟肽的長度為78aa、79aa、81aa不等.沼蝦和龍蝦的GIH氨基酸序列比較相似性為45-59%，對蝦和龍蝦的相似性為46%，而對蝦和沼蝦的相似性為30%，這表明GIH在物種間的保守性差，這也是CHH家族肽普遍存在的情況，可能是由于與脊椎動物相比低等生物在進化的過程中變異較大造成的。因此，提供引物組用于擴增青蝦GIH基因，對于研究青蝦的蛻皮、變態(tài)發(fā)育、 生殖、血糖平衡以及體內(nèi)的滲透壓調(diào)控機制等方面，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供擴增青蝦GIH基因的引物組及克隆方法。利用本發(fā)明提供的引物組從青蝦眼柄中克隆到了一種GIH-A和GIH-B基因，對研究青蝦蛻皮、變態(tài)發(fā)育、生殖、血糖平衡以及體內(nèi)的滲透壓調(diào)控機制提供參考，為青蝦良種繁育積累背景資料。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案
本發(fā)明提供了擴增Gene Bank登錄號為HQ724325. 1的青蝦GIH-A基因的引物組，其由如下引物組成 引物組1:
4正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物組2
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向內(nèi)引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向內(nèi)引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。本發(fā)明還提供了擴增Gene Bank登錄號為HQ7243^. 1的青蝦GIH-B基因的引物組，其由如下引物組成
引物組1:
正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物組2
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 正向內(nèi)引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 反向內(nèi)引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示。本發(fā)明還提供了一種擴增Gene Bank登錄號為HQ724325. 1的青蝦GIH-A基因的方法，包括如下步驟
步驟1 獲得青蝦眼柄總RNA ； 步驟2 合成cDNA ；
步驟3 用引物組1擴增獲得青蝦GIH-A基因片段；所述引物組1由乳腺癌引物組成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；
步驟4 用引物組2擴增獲得青蝦GIH-A基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組2 由如下引物組成
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向內(nèi)引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向內(nèi)引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示；
步驟5 將所述GIH-A因片段、所述GIH-A基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。作為優(yōu)選，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。本發(fā)明還提供了一種擴增Gene Bank登錄號為HQ7243^. 1的青蝦GIH-B基因的方法，包括如下步驟
步驟1 獲得青蝦眼柄總RNA ； 步驟2 合成cDNA ；步驟3 用引物組1擴增獲得青蝦GIH-B基因片段；所述引物組1由乳腺癌引物組成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步驟4 用引物組2擴增獲得青蝦GIH-B基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組3 由如下引物組成
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；
正向內(nèi)引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示；
反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
反向內(nèi)引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
步驟5 將所述GIH-B基因片段、GIH-B基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。作為優(yōu)選，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。本發(fā)明以青蝦眼柄為材料，分離了青蝦GIH的全長cDNA序列，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、嵌套聚合酶鏈反應(yīng)(Nested-PCR)、3’端cDNA快速擴增(3，-RACE)以及 5，端cDNA快速擴增(5，-RACE)的方法，對青蝦GIH-A和GIH-B基因進行了研究，首次從青蝦眼柄中克隆到了一種GIH-A和GIH-B基因，并對其所編碼的神經(jīng)肽的序列特征、同源性、 進化地位進行了分析，為進一步研究青蝦GIH基因的表達、調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，對研究青蝦蛻皮、變態(tài)發(fā)育、生殖、血糖平衡以及體內(nèi)的滲透壓調(diào)控機制提供參考，為青蝦良種繁育積累背景資料，同時也為甲殼動物整個CHH家族的功能和進化研究提供了新的材料。


圖1為青蝦GIH-A和GIH-B的氨基酸序列與其它CHH家族神經(jīng)肽的比對，其中“ |，，表示信號肽的切割位點；
““，，表示CHH前體相關(guān)肽的位置。 圖2為甲殼動物CHH家族激素前體的NJ系統(tǒng)進化樹。
具體實施例方式本發(fā)明公開了擴增青蝦GIH基因的引物組及克隆方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供了擴增Gene Bank登錄號為HQ724325. 1的青蝦GIH-A基因的引物組， 其由如下引物組成
引物組1:
正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物組2
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向內(nèi)引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向內(nèi)引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。本發(fā)明還提供了擴增Gene Bank登錄號為HQ7243^. 1的青蝦GIH-B基因的引物組，其由如下引物組成
引物組1:
正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物組2
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 正向內(nèi)引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 反向內(nèi)引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示。本發(fā)明還提供了一種擴增Gene Bank登錄號為HQ724325. 1的青蝦GIH-A基因的方法，包括如下步驟
步驟1 獲得青蝦眼柄總RNA ； 步驟2 合成cDNA ；
步驟3 用引物組1擴增獲得青蝦GIH-A基因片段；所述引物組1由乳腺癌引物組成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；
步驟4 用引物組2擴增獲得青蝦GIH-A基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組2 由如下引物組成
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向內(nèi)引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向內(nèi)引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示；
步驟5 將所述GIH-A因片段、所述GIH-A基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。作為優(yōu)選，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。本發(fā)明還提供了一種擴增Gene Bank登錄號為HQ7243^. 1的青蝦GIH-B基因的方法，包括如下步驟
步驟1 獲得青蝦眼柄總RNA ； 步驟2 合成cDNA ；
步驟3 用引物組1擴增獲得青蝦GIH-B基因片段；所述引物組1由乳腺癌引物組成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步驟4 用引物組2擴增獲得青蝦GIH-B基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組3 由如下引物組成
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；
正向內(nèi)引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示；
反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
反向內(nèi)引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
步驟5 將所述GIH-B基因片段、GIH-B基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。作為優(yōu)選，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。使用ClustalWl. 83將GIH-A和GIH-B的cDNA序列全長以及所編碼的氨基酸進行比對，青蝦GIH-A和GIH-B的cDNA序列全長以及所編碼的氨基酸長度等均不相同(見表 1)。信號肽長度相差2個氨基酸，序列差異大，前體相似性為56%，成熟肽相似性為69%。 使用ClustalWl. 83將GIH-A和GIH-B氨基酸序列與已公布的部分蝦蟹類CHH家族氨基酸序列進行了比對。前體的比對(不包括CHH的CPRP)結(jié)果如圖1。結(jié)果顯示，青蝦GIH-A與羅氏沼蝦SGP-A最相似(99% )，青蝦GIH-B與羅氏沼蝦的SGP-B最相似(94% )，都比青蝦 GIH-A和GIH-B之間相似性(69% )高，總體而言青蝦GIH-A與其它物種II型肽(GIH、MIH、 Μ0ΙΗ)的相似性要比青蝦GIH-B與其它物種II型肽(GIH、ΜΙΗ、Μ0ΙΗ)的相似性高一些。通過對青蝦中獲得的該基因的序列與其它物種GIH序列利用DNAstar軟件對GIH 進行alignment分析和使用MEGA 4構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖2)，由系統(tǒng)發(fā)育樹可見，甲殼動物CHH家族分為兩組，分別是蝦蟹類的CHH和蝦蟹類的GIH、MIH、MOIH這兩組，這與CHH 家族結(jié)構(gòu)的分型一致(I型和II型)。沼蝦的II型肽與海螯蝦的II型肽親緣關(guān)系最近，其次與蟹的II型肽親緣關(guān)系較近，與對蝦II型肽親緣關(guān)系較遠，與鰲蝦II型肽親緣關(guān)系最遠。本發(fā)明中青蝦由太湖無錫湖區(qū)漁民提供，試劑均可由市場夠得，純化及cDNA第一鏈合成試劑盒購自上海生工生物工程有限公司(Sang0n)，3'及5' RACE試劑盒購自寶生物(大連)有限公司(Takara)。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明 實施例1
總RNA提取逐個取青蝦眼柄，去色素后迅速放入盛有液氮的預(yù)冷研缽中，共取六個眼柄約30mg，解剖速度要快并且注意添加液氮；總RNA的提取使用上海博星生物公司的 Unizol RNA提取試劑結(jié)合RNeasy Mini Kit法進行，提取方法參照使用說明書。cDNA第一鏈合成據(jù)上海生工生物工程有限公司(Sangon) cDNA合成試劑盒說明書進行。青蝦GIH cDNA片段克隆
根據(jù)已獲得的GIH cDNA序列(美洲鰲龍蝦你fflarm afflerica/HAs，X87192 ；歐洲鰲龍 If Homarus ga/marus ,OQ181793 ；挪威海螯蟲下 Afe^Aro/ ^· norvegicus, AF16 3 7 71 ’ Rimi car is kairei，F(xiàn)J447500 ；羅氏沼蝦 Macrobrachium rosenbergii，AF432346)的編碼區(qū)進行比對， 依據(jù)比對結(jié)果，在保守區(qū)域設(shè)計引物，用于PCR擴增，得到青蝦GIH-A和GIH-B基因片段；正向引物
FZl 5' - GGBffTCTCTGYHCAGAGAGT -3' FZ2 5' - CGAATGCCCHGGBGTVATGG -3' 反向引物
RZ 5' - TAGACRCACCACAGGAARTC -3' PCR擴增反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.擴增GeneBank登錄號為HQ724325. 1的青蝦GIH-A基因的引物組，其特征在于，其由如下引物組成引物組1:正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物組2 正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向內(nèi)引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向內(nèi)引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。
2.擴增GeneBank登錄號為HQ7243^. 1的青蝦GIH-B基因的引物組，其特征在于，其由如下引物組成引物組1 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物組2 正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 正向內(nèi)引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 反向內(nèi)引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示。
3.一種擴增Gene Bank登錄號為HQ724325. 1的青蝦GIH-A基因的方法，其特征在于， 包括如下步驟步驟1 獲得青蝦眼柄總RNA ； 步驟2 合成cDNA ；步驟3 用引物組1擴增獲得青蝦GIH-A基因片段；所述引物組1由乳腺癌引物組成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；步驟4 用引物組2擴增獲得青蝦GIH-A基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組2 由如下引物組成正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向內(nèi)引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向內(nèi)引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示；步驟5 將所述GIH-A因片段、所述GIH-A基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。
5.一種擴增Gene Bank登錄號為HQ7243^. 1的青蝦GIH-B基因的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟1 獲得青蝦眼柄總RNA ； 步驟2 合成cDNA ；步驟3 用引物組1擴增獲得青蝦GIH-B基因片段；所述引物組1由乳腺癌引物組成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；步驟4 用引物組2擴增獲得青蝦GIH-B基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組3 由如下引物組成正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；正向內(nèi)引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示；反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；反向內(nèi)引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；步驟5 將所述GIH-B基因片段、GIH-B基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因克隆領(lǐng)域，特別涉及擴增青蝦性腺抑制激素(Gonad-inhibtinghormone，GIH)基因的引物組及克隆方法。利用本發(fā)明提供的引物組從青蝦眼柄中克隆到了一種GIH-A和GIH-B基因，為青蝦蛻皮、生殖、變態(tài)發(fā)育、血糖平衡以及體內(nèi)滲透壓的調(diào)控機制研究提供理論基礎(chǔ)，為青蝦良種繁育積累背景資料。
文檔編號C12N15/10GK102433328SQ20111030379
公開日2012年5月2日 申請日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者喬慧, 傅洪拓, 吳滟, 王寧 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心