專利名稱：高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及高效分泌表達AcAP5的CHO細胞株。
背景技術：
犬鉤蟲吸血時，其頭腺分泌一種具有抗凝血活性的物質(zhì)，被稱作犬鉤蟲抗凝血肽 (anticoagulant ρ印tide，AcAPs)。該物質(zhì)本質(zhì)是一種蛋白水解酶，具有延長血漿凝血酶原時間(Pt)、抑制血液凝固以及促進纖維蛋白溶解的作用。AcAPs目前已有AcAP5、AcAP6、 AcAPc2三種重組蛋白。AcAP5由77個氨基酸組成，是Xa因子的高效特異性抑制劑，與Xa 的反應位區(qū)在肽37-42 (-C-R-S-R-G-C-)，作用位點在第40位精氨酸和第41位甘氨酸之間。 AcAPs的抗凝血、抗血栓作用有將會成為臨床上一種新的抗凝劑和抗血栓治療藥物。目前用CHO表達AcAP5的最高表達量是6mg/L，且無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決目前用CHO表達外源基因產(chǎn)物的表達量低，且無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的問題，提供高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株。本發(fā)明高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株，利用二氫葉酸還原酶缺陷型中華倉鼠卵巢細胞(CH0-dhfr_)作為宿主細胞，經(jīng)篩選、擴增后得到穩(wěn)定、高效表達AcAP5的細胞株，表達量最高達到12mg/L · 72h。本發(fā)明高分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株的構(gòu)建方法，按以下步驟進行—、目的片段雙酶切由上海生工公司合成帶有信號肽的AcAP5基因序列克隆到T 載體上，將T載體用BamHI和NotI進行雙酶切，反應體系如下
成分用量
0.2昭/叫T載體20|iL
IOx MbufFer6|iL
BamHl3 μ
Notl3μL
ddH2028|iL酶切反應條件為37°C放置3小時，然后將酶切產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到插入片段；二、質(zhì)粒載體雙酶切用BamHI和NotI雙酶切消化質(zhì)粒載體pcDNA3. l/V5-His_C，
反應體系如下成分用量
0.2(^g/|iL pcDNA3.1/V5-His-C20μL
IOx MbufFer6|iL
,SawHI3 μ
XhoI3μL
ddH2028|iL酶切反應條件為37°C放置3小時，然后將酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，再用 DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到酶切后的質(zhì)粒載體；三、DNA片段的連接，反應體系如下
成分用量
0.2μ§/μ 酶切后的質(zhì)粒載體3|iL
10ng/|iL 插入片段13|iL
IOx T4 DNA 連接酶 buffer2μL
T4 DNA連接酶2|iL連接反應條件為16 °C放置過夜，獲得連接產(chǎn)物重組質(zhì)粒pcDNA3. 1/ V5-His-C-AcAP5 ；四、細胞培養(yǎng)用含1001^/1胎牛血清、離4、1\肌的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞CHO-dhfr—；五、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3. l/V5-His-C_AcAP5與質(zhì)粒 pDCHlPll 混合，使用 Lipofeetmine 2000Reagent 共轉(zhuǎn)染 CHO-dhfr-細胞，在 24 孔板中進行轉(zhuǎn)染，細胞達到95%融合時，將培養(yǎng)基更換為無抗生素、無血清的CHO-S-SFM II，500 μ L/ 孔，轉(zhuǎn)染6h后更換含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II，繼續(xù)培養(yǎng)48h，用ELISA試劑盒鑒定陽性轉(zhuǎn)染的細胞按1 10傳代，24h細胞貼壁后更換為選擇性培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 16d后有陽性克隆形成，然后用定向消化的方法將陽性克隆轉(zhuǎn)入24孔板，又傳代至12孔板，經(jīng)ELISA 試劑盒測定對陽性克隆中10株高表達的細胞克隆進行擴大培養(yǎng)；六、MTX的加壓培養(yǎng)以MTX加壓篩選，濃度依次為2X10_8mmol/L、lX10_7mmol/L 和5X liTmmol/L，最終得到能夠在5X l(Tmmol/L的MTX中正常生長的CHO細胞株，即為高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株。步驟一所述帶有信號肽的AcAP5基因序列根據(jù)Genbank中犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)的mRNA序列(Aceession :U30795)的原始序列，去掉原始信號肽序列，同時根據(jù)表達系統(tǒng)的特點選擇CH0-dhft_偏愛密碼子。為了使轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，同時使表達產(chǎn)物分泌到細胞外，在原始序列5’端加上Kozak序列和信號肽，在原始序列兩端分別加上限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI的位點。步驟一所述帶有信號肽的AcAP5基因的序列如SEQ ID NO=I所示。步驟一所述帶有信號肽的AcAP5基因中加入的信號肽的基因序列如SEQ ID NO 2 所示。
本發(fā)明高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株的表達產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明選用CHO-dhfr—細胞作為宿主細胞，具有以下優(yōu)點CH0-dhfr_細胞適用于各種蛋白質(zhì)的分泌表達和胞質(zhì)內(nèi)表達；在MTX選擇壓力下，DHFR基因及該基因兩側(cè)的序列可以大量擴增；對培養(yǎng)基的適應性強，可以用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；CHO細胞既可進行貼壁培養(yǎng)也可進行懸浮培養(yǎng)；可大量地規(guī)模性生產(chǎn)，培養(yǎng)量可達5000L。本發(fā)明的CHO細胞株可以高效表達AcAP5，表達量為9 12mg/L · 72h，且可以工業(yè)化生產(chǎn)。AcAP5可以抗凝血、抗血栓，其主要抑制凝血因子Xa，直接與Xa的活性中心結(jié)合從而特異性抑制Xa，阻斷凝血的共同途徑，達到抗凝血作用。本發(fā)明為犬鉤蟲抗凝血肽抗凝活性的深入研究和臨床應用奠定了基礎。


圖1為具體實施方式
一中重組質(zhì)粒DNA的測序圖；圖2為具體實施方式
一中陽性克隆的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株，利用二氫葉酸還原酶缺陷型中華倉鼠卵巢細胞(CH0-dhfr_)作為宿主細胞，經(jīng)篩選、擴增后得到穩(wěn)定、高效表達AcAP5的細胞株，表達量最高達到12mg/L · 72h。本實施方式高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株的構(gòu)建方法具體如下一、目的片段雙酶切由上海生工公司合成帶有信號肽的AcAP5基因序列克隆到T 載體上，將T載體用BamHI和NotI進行雙酶切，反應體系如下酶切反應條件37°C放置3小時，將酶切產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到插入片段。二、質(zhì)粒載體雙酶切用BamHI和NotI雙酶切消化質(zhì)粒載體pcDNA3. 1/ V5-His-C (購自Invitrogen公司)，反應體系如下
成分 0.2昭/叫T載體 IOx Mbuffer
20μL 6μL 3 |iL 3 |iL 28|iL
BamHl Notl
ddH20成分用量
0.2(^g/|iL pcDNA3.1/V5-His-C20μL
IOx MbufFer6|iL
,SawHI3 μ
XhoI3μL
ddH2028|iL酶切反應條件37°C放置3小時，將酶切產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到酶切后的質(zhì)粒載體。三、DNA片段的連接反應體系如下
成分用量
0.2μ§/μ 酶切后的質(zhì)粒載體3|iL
10ng/|iL 插入片段13|iL
IOx T4 DNA 連接酶 buffer2|iL
T4 DNA連接酶2|iL連接反應條件16°C放置過夜，連接反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli ToplO (購自天津天有利科技有限公司)，采用菌落PCR的方法篩選陽性菌落，并進一步提取重組質(zhì)粒 DNA進行測序，測序結(jié)果表明無堿基的錯誤，未改變載體閱讀框，方向相同(如圖1)。BamHI、 NotI和DNA連接酶購自NEB公司。四、細胞培養(yǎng)二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞CH0-dhfr_由哈爾濱醫(yī)科大學病理教研室贈予，用含100mL/L胎牛血清(FBS)、NAA、1 XHT的DMEM培養(yǎng)基(購自GIBCO公司)培養(yǎng)。五、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3. l/V5-His-C_AcAP5與質(zhì)粒pDCHlPll混合，使用 Lipofeetmine 2000Reagent (購自 Invitrogen 公司)共轉(zhuǎn)染 CHO-dhfr-細胞，在 24 孔板中進行轉(zhuǎn)染，細胞達到95%融合時，將培養(yǎng)基更換為無抗生素、無血清的CHO-S-SFM II， 500 μ L/孔，轉(zhuǎn)染6h后更換含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II (不含HT、NAA) ImL,繼續(xù)培養(yǎng) 48h，用ELISA試劑盒(購自R&D公司)鑒定陽性轉(zhuǎn)染的細胞按1 10傳代，24h細胞貼壁后更換為選擇性培養(yǎng)基(不含HT、NAA,但含0. 75mg/L的G418 (購自上海浩然生物技術有限公司)，100mL/L的FBS)，培養(yǎng)14 16d后有陽性克隆形成(因培養(yǎng)基中不含HT，故存活細胞為成功共轉(zhuǎn)染的細胞)；然后用定向消化的方法將陽性克隆轉(zhuǎn)入24孔板，又傳代至12 孔板，經(jīng)ELISA試劑盒測定對陽性克隆中10株高表達的細胞克隆進行擴大培養(yǎng)。六、MTX的加壓培養(yǎng)待細胞長成單層，取培養(yǎng)3d的上清用ELISA試劑盒檢測，以 MTX (氨甲喋呤)加壓篩選，濃度依次為2 X l(T%mol/L、1 X 10"7mmol/L和5 X 10"7mmol/L,最終得到能夠在5X 10_7mmol/L的MTX中正常生長的CHO細胞株，即為高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株。
本實施方式的陽性克隆的RT-PCR鑒定試驗，具體方法為收集MTX加壓篩選后的細胞，以TRIzoI進行細胞總RNA的提取，RNA反轉(zhuǎn)錄后以Pl和P2為引物進行PCR擴增，PCR 反應條件為95°C預變性5min ；94°C 30s,51°C 30s, 72°C 30s，共30個循環(huán)；再72°C最終延伸 5min。上游引物P1 5 ‘ -AGTGCGGCGAGAACGAGTGG-3 ‘下游引物P2 5 ‘ -CGATGACGGTGTCGCGGTAGAA-3 ‘試驗結(jié)果如圖2所示，泳道1為DNA marker,泳道2為陽性克隆的RT-PCR產(chǎn)物，泳道3為未轉(zhuǎn)染的細胞。對未轉(zhuǎn)染pcDNA3. l/V5-His-C-AcAP5和pDCHlPll的CHO細胞進行擴增后無條帶。由于CHO細胞自身并無AcAP5 mRNA形式存在，所以未轉(zhuǎn)染細胞無相應片段被擴增。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株中擴增出295bp的片段，表明目的片段已完整的整合到CHO 細胞中，有目的基因的轉(zhuǎn)錄。重組AcAP5蛋白表達水平的檢測試驗，具體方法為分別對2 X 10_8mmol/L、 1 X liTmmol/L和5 X liTmmol/L三個不同濃度MTX加壓培養(yǎng)后的細胞株培養(yǎng)72h，之后取培養(yǎng)液上清，用ELISA試劑盒測定重組AcAP5蛋白含量。檢測結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株，其特征在于利用二氫葉酸還原酶缺陷型中華倉鼠卵巢細胞作為宿主細胞，經(jīng)篩選、擴增后得到穩(wěn)定、高效表達AcAP5的細胞株，具體方法按以下步驟進行一、目的片段雙酶切由上海生工公司合成帶有信號肽的AcAP5基因序列克隆到T載體上，將T載體用BamHI和NotI進行雙酶切，反應體系如下成分用量·0.2昭/叫T載體20|iLIOx MbufFer6|iLBamHl3 μ Notl3μLddH2028|iL酶切反應條件為37°C放置3小時，然后將酶切產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到插入片段；二、質(zhì)粒載體雙酶切用BamHI和NotI雙酶切消化質(zhì)粒載體pcDNA3.1/V5-His-C,反應體系如下成分用量·0.2(^g/|iL pcDNA3.1/V5-His-C20μLIOx MbufFer6|iLBamHl3 μ XhoI3μLddH2028|iL酶切反應條件為37°C放置3小時，然后將酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，再用 DNAGEL EXTRACTION KIT純化回收，得到酶切后的質(zhì)粒載體；三、DNA片段的連接，反應體系如下成分用量·0.2μ§/μ 酶切后的質(zhì)粒載體3|iL10ng/|iL 插入片段13|iLIOx T4 DNA 連接酶 buffer2|iLT4 DNA連接酶2|iL連接反應條件為16°C放置過夜，獲得連接產(chǎn)物重組質(zhì)粒pcDNA3. l/V5-His-C-AcAP5 ；四、細胞培養(yǎng)用含1001^/1胎牛血清、離4、1\肌的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞CH0-dhfr_ ；五、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3. l/V5-His-C_AcAP5與質(zhì)粒 pDCHlPll 混合，使用 Lipofeetmine 2000Reagent 共轉(zhuǎn)染 CH0_dhff 細胞，在 M 孔板中進行轉(zhuǎn)染，細胞達到95%融合時，將培養(yǎng)基更換為無抗生素、無血清的CHO-S-SFM II，500 μ L/孔，轉(zhuǎn)染6h后更換含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II，繼續(xù)培養(yǎng)48h，用ELISA試劑盒鑒定陽性轉(zhuǎn)染的細胞按1 10傳代，24h細胞貼壁后更換為選擇性培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 16d后有陽性克隆形成，然后用定向消化的方法將陽性克隆轉(zhuǎn)入24孔板，又傳代至12孔板，經(jīng)ELISA 試劑盒測定對陽性克隆中10株高表達的細胞克隆進行擴大培養(yǎng)；六、MTX的加壓培養(yǎng)以MTX加壓篩選，濃度依次為2Xl(T8mmol/L、lXl(T7mmol/L和 5X 10_7mmol/L，最終得到能夠在5X 10_7mmol/L的MTX中正常生長的CHO細胞株，即為高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株，其特征在于步驟一所述帶有信號肽的AcAP5基因的序列如SEQ ID N0:1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株，其特征在于步驟一所述帶有信號肽的AcAP5基因中加入的信號肽的基因序列如SEQ ID NO :2所7J\ ο
4.權(quán)利要求1所述高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株的表達產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
全文摘要
高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株，涉及高效分泌表達AcAP5的CHO細胞株。本發(fā)明是要解決目前用CHO表達外源基因產(chǎn)物的表達量低，且無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的問題。高效分泌表達AcAP5的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株，利用二氫葉酸還原酶缺陷型中華倉鼠卵巢細胞作為宿主細胞，經(jīng)篩選、擴增后得到穩(wěn)定、高效表達AcAP5的細胞株。本發(fā)明的CHO細胞株可以高效表達AcAP5，表達量最高達到12mg/L·72h，且可以工業(yè)化生產(chǎn)。用于抗凝血、抗血栓。
文檔編號C12N5/10GK102358893SQ201110304079
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者付海燕, 余瓊, 劉威, 張巍 申請人:黑龍江大學