專利名稱：鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的pcr引物對及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對及其應(yīng)用，特別涉及可以鑒定或輔助鑒定鼠、牛、羊、豬、雞和鴨這六種動物中至少一種動物的組織和/或器官的PCR引物對。
背景技術(shù)：
目前在國內(nèi)生肉和肉制品的生產(chǎn)和銷售領(lǐng)域，一些不法商販為了牟取暴利，利用摻雜摻假等手段欺騙消費者的事件時有發(fā)生，比如用鼠肉冒充豬肉、牛肉和羊肉等。因此一套快速、準確鑒別肉種類，并且能夠適應(yīng)混合肉制品鑒定的方法，無疑會為執(zhí)法人員提供了強大的技術(shù)支撐。傳統(tǒng)的肉制品鑒定的方法主要是基于蛋白質(zhì)水平的分析，包括電泳法、免疫法、 ELISA等技術(shù)。操作過程中首先需制備相應(yīng)物種的抗體，然后抗原和抗體間進行免疫反應(yīng)， 最后通過電泳或者顯色等方法進行鑒別。這類鑒別技術(shù)受蛋白質(zhì)(主要起作用的部分為抗原決定簇)結(jié)構(gòu)的影響很大，實際應(yīng)用中經(jīng)常出現(xiàn)的問題包括1.熱加工過程會改變蛋白質(zhì)(抗原決定簇)的結(jié)構(gòu)，因而無法檢測熱加工的肉類；2.對混合肉類的檢測可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)，因為不同物種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能具有某種程度的相似性，檢驗的靈敏程度取決于制備的抗體的特異性強弱?；谝陨显?，以核酸為基礎(chǔ)的檢測方法成為近幾年食品檢測領(lǐng)域的發(fā)展方向， 包括DNA分子雜交法和PCR方法等。DNA分子雜交法操作復(fù)雜，且成本較高，目前以逐漸被 PCR方法所取代。PCR方法靈敏度高、特異性強，可對混合肉類進行鑒別和區(qū)分，即使摻雜少量異種肉，也能用PCR方法加以鑒別；PCR方法可用于熱加工的肉制品鑒別當中，高溫過程僅僅打斷了核酸的片斷，并不會完全降解核酸，因而熱加工的肉制品當中仍然存在可擴增的模板，這在飼料工業(yè)肉骨粉來源的鑒別過程中得到了很好的證實；PCR反應(yīng)的迅速，結(jié)果易于觀測，使得這種檢測方法目前廣泛應(yīng)用在飼料、保健品的動物源性成分的鑒別當中。PCR技術(shù)中，引物設(shè)計是PCR成功的關(guān)鍵因素，好的引物將是檢測實驗更加快捷， 結(jié)果更加清晰。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對或引物對組合物，以及利用所述引物對或引物對組合物鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有鼠、豬、牛、羊、雞和鴨這六種動物中至少一種動物的組織和/或器官的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對既可為鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，也可為在含有鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對的前提下，再含有鑒定或輔助鑒定鼠、豬、牛、羊、雞、鴨組織和/或器官的6 個PCR引物對中其余五個引物對中的全部、或任意四對、或任意三對、或任意兩對、或任一對形成的引物對組合物。具體分為如下六種
1、鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的六個引物對組成，第一對引物是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，第二對引物是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，第三對引物是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的 PCR引物對，第四對引物是由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對，第五對引物是由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；第六對引物是由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的 PCR引物對；所述動物為鼠、豬、牛、羊、雞、鴨中的至少一種。2、鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的五個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，另外四個引物對為下述五個引物對中的任四個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/ 或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；由序列表中序列11 和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為鼠、豬、牛、羊、雞、鴨中的至少一種。3、鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的四個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，另外三個引物對為下述五個引物對中的任三個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/ 或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；由序列表中序列11 和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為鼠、豬、牛、羊、雞、鴨中的至少一種。4、鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的三個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，另外兩個引物對為下述五個引物對中的任兩個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/ 或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；由序列表中序列11 和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為鼠、豬、牛、羊、雞、鴨中的至少一種。5、鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的兩個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，另外一個引物對為下述五個引物對中的任一個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/ 或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；由序列表中序列11 和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為鼠、豬、牛、羊、雞、鴨中的至少一種。上述1中所述六個引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 1 1 1 1 1 ；上述2中所述五個引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 :1:1:1: 1;上述3中所述四個引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 :1:1: 1 ；上述4中所述三個引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 1 1 ；上述5中所述二個引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 1。6、鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，由兩條單鏈DNA組成，所述兩條DNA單鏈分別為序列表中序列1所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈DNA。其中，序列表中的序列1由沈個核苷酸組成，序列表中的序列2由沈個核苷酸組成，序列表中的序列3由M個核苷酸組成，序列4由沈個核苷酸組成，序列5由M個核苷酸組成，序列6由22個核苷酸組成，序列7由22個核苷酸組成，序列8由觀個核苷酸組成， 序列9由22個核苷酸組成，序列10由22個核苷酸組成，序列11由沈個核苷酸組成，序列 12由21個核苷酸組成。上述動物組織和/或器官可來源于鼠、豬、牛、羊、雞和鴨這六種動物中任一種動物組織和/或器官，也可以來源于鼠、豬、牛、羊、雞和鴨這六種動物中的任兩種、任三種、任四種、任五種或六種動物的混合組織和/或器官。含有上述引物對組合物或單獨的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。為了提高上述試劑盒的準確性，所述試劑盒除含有上述引物對組合物或單獨的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對外，還含有限制性內(nèi)切酶，所述限制性內(nèi)切酶為EcoR I和/或Hind III ；所述動物為鼠、豬、牛、羊、雞、鴨中的至少一種。由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得鼠肉線粒體16S rDNA基因的基因片段(如序列表中序列13所示)，該基因片段共有285個核苷酸，其中前沈位和后沈位分別為序列表中序列1和序列2所示上下游引物，第185-190位是EcoRI的識別序列。由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得豬肉線粒體腺苷三磷酸酶VI亞基和VIII亞基基因的基因片段(如序列表中序列14所示)，該基因片段共有611個核苷酸，其中前M位和后沈位分別為序列表中序列3和序列4所示上下游引物，第133-138位是Hind III的識別序列。
由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得牛肉線粒體DNA細胞色素C氧化酶II亞基基因的基因片段(如序列表中序列15所示)，該基因片段共有494個核苷酸，其中前M位和后22 位分別為序列表中序列5和序列6所示上下游引物，第沈3-268位是Hind III的識別序列。由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得羊肉線粒體DNA細胞色素B基因的基因片段(如序列表中序列16所示)，該基因片段共有716個核苷酸，其中前22位和后觀位分別為序列表中序列7和序列8所示上下游引物，第253-258位是EcoR I的識別序列。由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得雞肉線粒體DNA腺苷三磷酸合成酶VI亞基和 VIII亞基基因的基因片段(如序列表中序列17所示)，該基因片段共有259個核苷酸，其中前22位和后22位分別為序列表中序列9和序列10所示上下游引物，第97-102位是Hind III的識別序列。由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得鴨肉線粒體DNA細胞色素氧化酶亞基III基因的基因片段(如序列表中序列18所示)，該基因片段共有350個核苷酸，其中前沈位和后 21位分別為序列表中序列11和序列12所示上下游引物，第173-178位是Hind III的識別序列。本發(fā)明所提供的引物對組合物或引物對的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。該制備方法具體可包括將所述引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。上述鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。該制備方法具體可包括如下步驟上述引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR 反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP (dATP，dTTP，dCTP和dGTP)和限制性內(nèi)切酶，所述限制性內(nèi)切酶為Hind III和/或EcoR I。所述動物為鼠、豬、牛、羊、雞和鴨中至少一種。利用所述引物對組合物或引物對，或所述PCR試劑盒鑒定或輔助鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有鼠、豬、牛、羊、雞和鴨這六種動物中至少一種動物組織和/或器官的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，利用所述引物對組合物或引物對的鑒定或輔助鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有鼠、豬、牛、羊、雞和鴨這六種動物中至少一種動物組織和/或器官的方法包括下述1)和2、的步驟1)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用上述五種引物對組合物中的任一種組合物或單獨鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的引物對進行PCR擴增；2)檢測步驟1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是270-300bp，如^a3p的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有鼠組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是580-640bp，如61 Ibp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是460-520bp，如494bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是690-750bp，如716bp的DNA 片段，所述的DNA片段待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是230-270bp，如259bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是330-380bp，如 350bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有鴨組織和/或器官。所述檢測所得到的PCR產(chǎn)物大小的方法是將所得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示270-300bp之間的一條帶，如^^p，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有鼠組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示580-640bp之間的一條帶，如611bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示460-520bp之間的一條帶，如494bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官； 如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示690-750bp之間的一條帶，如716bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示230-270bp之間的一條帶，如259bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示330-380bp之間的一條帶，如350bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有鴨組織和/或器官。所述待測動物組織和/或器官來源于下述動物中的至少一種鼠、豬、牛、羊、雞、 鴨。利用所述PCR試劑盒的鑒定或輔助鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有鼠、豬、牛、羊、雞和鴨這六種動物中至少一種動物組織和/或器官的方法，包括下述 a)和c)的步驟a)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板， 選用60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，所述試劑盒中的引物對組合物或引物對進行PCR擴增；b)檢測步驟a)得到的PCR產(chǎn)物的大小，根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測動物組織和/ 或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官的方法同上；c)對經(jīng)步驟b)檢測的PCR產(chǎn)物進行酶切鑒定，所述酶切鑒定的步驟及確定所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官的方法為下述 cl)-c6)中的至少一種cl)將所述大小是270-300bpjB^5bp的DNA片段用EcoRI進行酶切鑒定，如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被EcoRI酶切為80-120bp和170_200bp的兩個片段，如98bp和187bp， 所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有鼠組織和/或器官；c2)將所述大小是580-640bp，如6Ilbp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定，如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被Hind III酶切為100_200bp和450_550bp的兩個片段，如
和476bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；c3)將所述大小為460-520bp，如494bp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被Hind III酶切為200-300bp的兩個片段，如和229bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；c4)將所述大小為690_750bp，如716bp的DNA片段用EcoR I進行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被EcoR I酶切為200-300bp和400-500bp的兩個片段，如 255bp和461bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；c5)將所述大小為230-270bp，如259bp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被Hind III酶切為50_100bp和150_200bp的兩個片段，如 99bp和160bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官；c6)將所述大小為330-380bp，如350bp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被Hind III酶切為150_200bp的兩個片段(根據(jù)實際電泳分辨率，可能重疊為一條條帶)，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有鴨組織和 /或器官。所述待測動物組織和/或器官來源于下述動物中的至少一種鼠、豬、牛、羊、雞、鴨。所述待測動物組織和/或器官具體可為結(jié)締組織(如血液)、肌肉組織。本發(fā)明的鼠、豬、牛、羊、雞、鴨特異性引物，均選用了 62°C的退火溫度，實現(xiàn)了在同一溫度一次PCR完成所有鑒別。同時，PCR產(chǎn)物的酶切鑒定，進一步增強了檢測的精確度。 本發(fā)明的檢測方法特異性強，能鑒別摻雜鼠、豬、牛、羊、雞和/或鴨的組織和/或器官。整個結(jié)果清晰、可信度高。本發(fā)明的方法檢測過程耗時短，從提取基因組到酶切結(jié)束，最短僅需要8小時的時間(樣品數(shù)量多時酌情延長)。


圖1為家鼠、民豬、黃牛、山羊、原雞、北京鴨6種肉類基因組的提取結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標準DL15000，泳道1為家鼠的基因組，泳道2為民豬的基因組，泳道3為黃牛的基因組，泳道4為山羊的基因組，泳道5為土雞的基因組，泳道6為北京鴨的基因組。圖2為鼠特異引物PCR檢測家鼠、民豬、黃牛、山羊、土雞、北京鴨肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標準50bp Ladder，泳道1為家鼠的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR 產(chǎn)物，泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物，泳道 6為北京鴨的PCR產(chǎn)物。圖3為豬特異引物PCR檢測家鼠、民豬、黃牛、山羊、土雞、北京鴨肌肉樣品結(jié)果。 其中，泳道M為DNA分子量標準IOObp Ladder,泳道1為家鼠的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的 PCR產(chǎn)物，泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物， 泳道6為北京鴨的PCR產(chǎn)物。圖4為牛特異引物PCR檢測家鼠、民豬、黃牛、山羊、土雞、北京鴨肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標準50bp Ladder，泳道1為家鼠的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR 產(chǎn)物，泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物，泳道 6為北京鴨的PCR產(chǎn)物。圖5為羊特異引物PCR檢測家鼠、民豬、黃牛、山羊、土雞、北京鴨肌肉樣品結(jié)果。 其中，泳道M為DNA分子量標準IOObp Ladder,泳道1為家鼠的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的 PCR產(chǎn)物，泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物，泳道6為北京鴨的PCR產(chǎn)物。圖6為雞特異引物PCR檢測家鼠、民豬、黃牛、山羊、土雞、北京鴨肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標準50bp Ladder，泳道1為家鼠的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR 產(chǎn)物，泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物，泳道 6為北京鴨的PCR產(chǎn)物。圖7為鴨特異引物PCR檢測家鼠、民豬、黃牛、山羊、土雞、北京鴨肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標準50bp Ladder，泳道1為家鼠的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR 產(chǎn)物，泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物，泳道 6為北京鴨的PCR產(chǎn)物。圖8為六個引物對組合物PCR檢測家鼠、民豬、黃牛、山羊、土雞、北京鴨肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標準IOObp Ladder,泳道1為家鼠的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR產(chǎn)物，泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR 產(chǎn)物，泳道6為北京鴨的PCR產(chǎn)物。圖9為六個引物對PCR擴增特異性片段的酶切結(jié)果。其中，泳道1為家鼠肌肉的 PCR產(chǎn)物，泳道2為家鼠PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，泳道3為民豬肌肉的PCR產(chǎn)物，泳道4為民豬 PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，泳道5為黃牛肌肉的PCR產(chǎn)物，泳道6為黃牛PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，泳道7為山羊肌肉的PCR產(chǎn)物，泳道8為山羊PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，泳道9為土雞肌肉的PCR 產(chǎn)物，泳道10為土雞PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，泳道11為北京鴨肌肉的PCR產(chǎn)物，泳道12為北京鴨PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，泳道M為DNA分子量標準IOObp Ladder。圖10為六對引物對組合物PCR擴增摻雜小白鼠肉的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和鴨肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標準IOObp Ladder，泳道1為摻雜0. 小白鼠肉的豬肉的PCR產(chǎn)物，泳道2為摻雜0. 1 %小白鼠肉的牛肉的PCR產(chǎn)物、泳道3為摻雜0. 1 %小白鼠肉的羊肉的PCR產(chǎn)物，泳道4為摻雜0. 1 %小白鼠肉的雞肉的PCR產(chǎn)物，泳道5為摻雜 0. 1 %小白鼠肉的鴨肉的PCR產(chǎn)物。圖11為鼠特異性引物對PCR檢測家鼠、小白鼠，田鼠肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M 為DNA分子量標準50bp Ladder,泳道1為小白鼠的PCR結(jié)果，泳道2為大白鼠的PCR結(jié)果， 泳道3為田鼠的PCR結(jié)果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、檢測動物純肌肉樣品一、制備鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對以鼠肉線粒體16S核糖體DNA基因為靶基因，設(shè)計特異擴增該基因的引物對。上游引物的序列為5 ‘ -GGATAGTGAATAATTAACAAAACAGC-3 ‘(序列表中的序列1)，下游引物的序列為5' -TGGTAGGTGGATTATTTATAGTGTGA-3‘(序列表中的序列2)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增小白鼠的靶序列如序列表中序列13所示。序列表中的序列13的第185-190位是EcoR I的識別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度分別為187bp和98bp。
以豬肉線粒體腺苷三磷酸酶VI亞基和VIII亞基基因為靶基因，設(shè)計特異擴增該基因的引物對。上游引物的序列為5 ‘ -CAGAATCAATTGAACTCAAAACTC-3 ‘(序列表中的序列 3)，下游引物的序列為5 ‘ -TAGTGTTGATGTTGAGTAGTGCTAAT-3 ‘(序列表中的序列4)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增民豬的靶序列如序列表中序列14所示。序列表中的序列14的第133-138位是Hind III的識別序列，PCR 產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度分別為135bp和476bp。以牛肉線粒體DNA細胞色素C氧化酶II亞基基因為靶基因，設(shè)計特異擴增該基因的引物對。上游引物的序列為5‘ -CGCTTGTCTTCTTAATTAGCTCAT-3‘(序列表中的序列5)， 下游引物的序列為5‘ -GTAATATAAGCCTGGACGGGAC-3‘(序列表中的序列6)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增黃牛的靶序列如序列表中序列15所示。序列表中的序列15的第263-268位是Hind III的識別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度分別為265bp和229bp。以羊肉線粒體DNA細胞色素B基因為靶基因，設(shè)計特異擴增該基因的引物對。上游引物的序列為5 ‘ -CGGCATTCATAGGCTATGTTTT-3 ‘(序列表中的序列7)，下游引物的序列為5' -GACCGGAATGATAAGGAAATATATAATA-3'(序列表中的序列8)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增山羊的靶序列如序列表中序列 16所示。序列表中的序列16的第253-258位是EcoR I的識別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度分別為255bp和461bp。以雞肉線粒體DNA腺苷三磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基基因為靶基因，設(shè)計特異擴增該基因的引物對。上游引物的序列為5 ‘ -TTATCCAACCCAAACTTCTTTC-3 ‘(序列表中的序列9)，下游弓丨物的序列為5 ‘ -TTGTTTTGTGATTAGGTGGGTG-3 ‘(序列表中的序列10)。 該引物對即為鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增土雞的靶序列如序列表中序列17所示。序列表中的序列17的第97-102位是Hind III的識別序列， PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度分別為99bp和160bp。以鴨肉線粒體DNA細胞色素氧化酶亞基III基因為靶基因，設(shè)計特異擴增該基因的弓I物對。上游弓I物的序列為5 ‘ -ATGTGATTCCACTACAACTCATCTAT-3 ‘(序列表中的序列 11)，下游引物的序列為5‘ -TGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3 ‘(序列表中的序列12)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增北京鴨的靶序列如序列表中序列18所示。序列表中的序列18的第173-178位是HindIII的識別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度相差小于^^，在2%瓊脂糖凝膠電泳中不能明顯區(qū)分， 電泳結(jié)果應(yīng)顯示為一條帶。二、檢測動物純肌肉樣品1、檢測樣品的制備該實驗中的樣品均是純肌肉，分別是家鼠、民豬、黃牛、山羊、土雞、北京鴨肌肉樣
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ΡΠ O2、利用步驟一的引物對PCR擴增線粒體基因組上的相關(guān)基因片段1)樣品基因組的提取使用北京全式金生物技術(shù)有限公司fesy Pure Genomic DNA Extraction Kit (貨號EE101-01)提取步驟1中樣品的基因組DNA。結(jié)果表明，步驟1中的所有樣品使用該試劑盒均能有效提取到基因組，提取的數(shù)量在電泳檢測時可見(如圖1)，足夠用作PCR反應(yīng)的模板。2)單重PCR和六重PCR反應(yīng)及電泳檢測分別以上述步驟1中各個樣品的基因組DNA為模板，利用如下六個引物對或者是所述六個引物對的組合物進行單重PCR和六重PCR 由序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA 組成的用于鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的引物對；由序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的引物對；由序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的引物對；由序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的引物對；由序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的引物對；由序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的引物對。其中，單個引物對的PCR體系10XBuffer 2. 0 μ L(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D4030)2.0yL，濃度為20 μ M的上游引物l.OyL，濃度為 20 μ M的下游引物1. 0 μ L，模板(總DNA) 2. 0 μ L, 5U/ μ L的Taq DNA聚合酶(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。其中，當上游引物為序列1時，下游引物為序列2，此時PCR體系為擴增鼠基因的 PCR體系；當上游引物為序列3時，下游引物為序列4，此時PCR體系為擴增豬基因的PCR體系；當上游引物為序列5時，下游引物為序列6，此時PCR體系為擴增?；虻腜CR體系；當上游引物為序列7時，下游引物為序列8，此時PCR體系為擴增羊基因的PCR體系；當上游引物為序列9時，下游引物為序列10，此時PCR體系為擴增雞基因的PCR體系；當上游引物為序列11時，下游引物為序列12，此時PCR體系為擴增鴨基因的PCR體系。六個引物對組合物的PCR體系10XBuffer 2. 0 μ L(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D4030) 2.0 μ L，濃度為20 μ M的上游引物(序列1、3、5、7、9 和11所示單鏈DNA)各l.OyL，濃度為20 μ M的下游引物(序列2、4、6、8、10和12所示單鏈DNA)各1. 0 μ L，模板(總DNA) 2. 0 μ L, 5U/ μ L的I1aq DNA聚合酶(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。PCR 程序:95°C，5min 預(yù)變性；95°C，30s, 62°C，30s, 72°C，45s，擴增反應(yīng)進行 30 個循環(huán)；72°C，延伸5min ；4°C，保溫結(jié)束。將PCR反應(yīng)獲得的產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為 1. 5% -2%。3、純肌肉樣品的PCR結(jié)果電泳檢測結(jié)果顯示⑴采用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對進行PCR反應(yīng)，其中家鼠的PCR擴增產(chǎn)物中得到一條大小270-300的條帶(圖2)，其它民豬、黃牛、山羊、土雞、北京鴨的肌肉樣品中沒有該條帶。說明鼠特異引物專一性非常好，與其他動物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。(2)采用由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對進行PCR反應(yīng)，其中民豬的PCR擴增產(chǎn)物中得到一條大小580_640bp的條帶(圖3)，其它家鼠、黃牛、山羊、土雞、北京鴨的肌肉樣品中沒有該條帶。 說明豬特異引物專一性非常好，與其他動物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。(3)采用由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對進行PCR反應(yīng)，其中黃牛的PCR擴增產(chǎn)物中得到一條大小460-520bp的條帶(圖4)，其它家鼠、民豬、山羊、土雞、北京鴨的肌肉樣品中沒有該條帶。說明牛特異引物專一性非常好，與其他動物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。(4)采用由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對進行PCR反應(yīng)，其中山羊的PCR擴增產(chǎn)物中得到一條大小690-750bp的條帶(圖5)，其它家鼠、民豬、黃牛、土雞、北京鴨的肌肉樣品中沒有該條帶。說明羊特異引物專一性非常好，與其他動物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。( 采用由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對進行PCR反應(yīng)，其中土雞的PCR擴增產(chǎn)物中得到一條大小230-270bp的條帶(圖6)，其它家鼠、民豬、黃牛、山羊、北京鴨的肌肉樣品中沒有該條帶。說明雞特異引物專一性非常好，與其他動物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。(6)采用由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA 組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對進行PCR反應(yīng)，其中北京鴨的PCR 擴增產(chǎn)物中得到一條大小330-380bp的條帶(圖7)，其它家鼠、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品中沒有該條帶。說明鴨特異引物專一性非常好，與其他動物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。(7)采用六個引物對組合物在同一反應(yīng)體系中進行PCR反應(yīng)，其中家鼠的PCR 擴增產(chǎn)物中只有一條270-300bp的條帶，民豬的PCR擴增產(chǎn)物中只有一條大小580_640bp 的條帶，黃牛的PCR擴增產(chǎn)物中只有一條大小460-520bp的條帶，山羊的PCR擴增產(chǎn)物中只有一條大小690-750bp的條帶，土雞的PCR擴增產(chǎn)物中只有一條大小230_270bp的條帶，北京鴨的PCR擴增產(chǎn)物中只有一條大小330-380bp的條帶(圖8)。這一結(jié)果再次說明六種 PCR引物對專一性非常好，與其他動物DNA沒有交叉反應(yīng)，沒有非特異的雜帶產(chǎn)生；另外，這一結(jié)果還表明，六種引物對可以同時使用，在檢測靈敏度方面能達到與單獨使用各引物對相同的效果，引物對組合物的形式使得一次PCR反應(yīng)完成六種肉類的檢測，大大節(jié)約了檢測時間與成本。4、酶切鑒定將PCR擴增獲得的民豬、黃牛、土雞、北京鴨的條帶使用Hind III進行酶切反應(yīng)； 山羊、家鼠的條帶使用EcoR I進行酶切反應(yīng)。酶切體系10 X Buffer 1. 0 μ L，限制性內(nèi)切酶0. 5 μ L，PCR產(chǎn)物8. 5 μ L，加雙蒸水至 20μ L。其中，當PCR產(chǎn)物為民豬、黃牛、土雞、北京鴨的條帶時，上述IOXBuffer為與Hind III匹配使用的IOXBuffer (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D1060A)，上述限制性內(nèi)切酶為Hind 111(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D1060A;當PCR產(chǎn)物為家鼠、山羊的條帶時，上述IOXBuffer為與EcoR I匹配使用的10XBuffer (購自寶生物工程 (大連)有限公司，貨號D1040A)，上述限制性內(nèi)切酶為EcoR 1(購自寶生物工程(大連) 有限公司，貨號D1040A)。酶切反應(yīng)獲得的產(chǎn)物進行凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為1. 5% -2%。
結(jié)果顯示PCR擴增獲得的家鼠肌肉的條帶被酶切為80_120bp和170_200bp的兩條條帶；PCR擴增獲得的民豬肌肉的條帶被酶切為100-200bp和450-550bp的兩條條帶； 黃牛肌肉的條帶被酶切為200-300bp的兩條條帶；山羊肌肉的條帶被酶切為200-300bp和 400-500bp的兩條條帶；土雞肌肉的條帶被酶切為50-100bp和150_200bp的兩條條帶；北京鴨肌肉的條帶被酶切為150-200bp的兩條條帶(根據(jù)實際電泳分辨率，重疊為一條條帶) (圖9)。說明PCR產(chǎn)物符合最初的設(shè)計，不是非特異性擴增的結(jié)果，說明PCR反應(yīng)結(jié)果真實有效。5、測序驗證將家鼠肌肉的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果表明家鼠(序列表中的序列13)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中家鼠NC_001700的16S核糖體DNA基因片段的序列同源性達到98% 以上，大小為285bPo將民豬肌肉的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果表明民豬(序列表中的序列14)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中家豬AP003^8. 1基因腺苷酸磷酸酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達到98%以上，大小為611bp。將黃牛肌肉的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果表明黃牛(序列表中的序列15)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中黃牛AY526085. 1的細胞色素C氧化酶II亞基基因片段的序列同源性達到98%以上，大小為494bp。將山羊肌肉的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果表明山羊(序列表中的序列16)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊⑶068049的細胞色素B基因片段的序列同源性達到98%以上， 大小為716bp。將土雞肌肉的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果表明土雞(序列表中的序列17) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中原雞AY235571. 1腺苷酸磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達到98%以上，大小為259bp。將北京鴨肌肉的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果表明北京鴨(序列表中的序列18)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中北京鴨EU755252細胞色素氧化酶亞基III基因片段的同源性達到98%以上，大小為350bp。上述實驗表明，本發(fā)明的檢測方法特異性強，引物之間沒有交叉反應(yīng)。擴增產(chǎn)物符合預(yù)計的大小，且都能被設(shè)計好的限制性內(nèi)切酶切割，說明擴增產(chǎn)物不是非特異性擴增的結(jié)果。整個結(jié)果清晰、可信度高。實施例2檢測摻雜肌肉樣品—、制備鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對設(shè)計和制備方法同實施例1 一。二、檢測動物肌肉樣品1、檢測樣品的制備該實驗中的樣品是摻雜家鼠肉的民豬肉、黃牛肉、山羊肉、土雞肉和北京鴨肉1)摻雜鼠肉的豬肉在99.9g豬肉中摻雜0. Ig鼠肉，制成0. 的摻雜鼠肉的豬肉。2)摻雜鼠肉的牛肉在99. 9g牛肉中摻雜0. Ig鼠肉，制成0. 的摻雜鼠肉的牛肉。
3)摻雜鼠肉的羊肉在99. 9g羊肉中摻雜0. Ig鼠肉，制成0. 的摻雜鼠肉的羊肉。4)摻雜鼠肉的雞肉在99. 9g雞肉中摻雜0. Ig鼠肉，制成0. 的摻雜鼠肉的雞肉。5)摻雜鼠肉的鴨肉:在99.9g雞肉中摻雜0. Ig鼠肉，制成0. 的摻雜鼠肉的鴨肉。2、利用步驟一的引物對PCR擴增線粒體基因組上的相應(yīng)基因片段1)樣品基因組的提取制備方法同實施例1步驟二 2。2) PCR反應(yīng)及電泳檢測分別以上述步驟1中各個樣品的基因組DNA為模板，以序列表中序列1、3、5、7、9 和所示的上游引物和序列表中序列2、4、6、8、10和12所示的下游引物，進行PCR擴增反應(yīng)。其PCR體系為10XBuffer 2. 0 μ L(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號 DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D4030)2.0yL，濃度為20 μ M的上游引物(序列1、3、5、7、9和11所示單鏈DNA)各l.OyL，濃度為20 μ M的下游引物(序列2、4、6、8、10和12所示單鏈DNA)各 1. 0 μ L，模板(總DNA) 2. OyL, 5U/ μ L的Taq DNA聚合酶(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。PCR 程序:95°C，5min 預(yù)變性；95°C，30s, 62°C，30s, 72°C，45s，擴增反應(yīng)進行 30 個循環(huán)；72°C，延伸5min ；4°C，保溫結(jié)束。將PCR反應(yīng)獲得的產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為 1. 5% -2%。3、摻雜鼠肉的肌肉樣品檢測結(jié)果電泳檢測結(jié)果表明，摻雜0. 1 %鼠肉的豬肉中得到兩條大小270_300bp和 580-640bp的條帶，摻雜0. 1 %鼠肉的牛肉中得到兩條大小270-300bp和460-520bp的條帶，摻雜0. 鼠肉的羊肉中得到兩條大小270-300bp和690-750bp的條帶，摻雜0. 1 % 肉的雞肉中得到兩條大小230-270bp和270-300bp的條帶，摻雜0. 1 %鼠肉的鴨肉中得到兩條大小270-300bp和330-380bp的條帶(圖10)。4、測序驗證將如下PCR 產(chǎn)物均進行測序:230-270bp (雞)、270_300bp (鼠)、330_380bp (鴨)、 460-520bp (牛)、580-640bp (豬)、690_750bp (羊)，結(jié)果表明家鼠(序列表中的序列13) PCR 產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中家鼠NC_001700的16S核糖體DNA基因片段的序列同源性達到 98%以上，大小為觀釙？，且在185-190位有EcoRI酶切位點。民豬(序列表中的序列14) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中家豬AP003^8. 1基因腺苷酸磷酸酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達到98%以上，大小為611bp，且在133-138位有HindIII酶切位點；黃牛 (序列表中的序列15)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中黃牛AY526085. 1的細胞色素C氧化酶II亞基基因片段的序列同源性達到98%以上，大小為494bp，且在沈3-268位有HindIII 酶切位點；山羊(序列表中的序列16)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊⑶068049的細胞色素B基因片段的序列同源性達到98%以上，大小為716bp，且在253-258位有EcoRI酶切位點；土雞(序列表中的序列17斤0 產(chǎn)物的序列與^^1數(shù)據(jù)庫中原雞々￥235571.1腺苷酸磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達到98%以上，大小為259bp，且在 97-102位有HindIII酶切位點；北京鴨(序列表中的序列18) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中北京鴨EU755252細胞色素氧化酶亞基III基因片段的序列同源性達到98%以上，大小為350bp，且在173-178位有HindIII酶切位點。實施例3、利用鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對檢測不同鼠肉樣品一、制備鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對設(shè)計和制備方法同實施例1步驟一。二、檢測各種鼠肉樣品1、檢測樣品檢測樣品為小白鼠、大白鼠和田鼠肌肉。2、利用步驟一的引物對PCR擴增線粒體基因組上的16S核糖體DNA基因片段1)樣品基因組的提取同實施例1。2) PCR 反應(yīng)同實施例1。將PCR反應(yīng)獲得的產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為2%。電泳檢測結(jié)果表明小白鼠、大白鼠和田鼠肌肉中均得到一條大小270-300bp的條帶(圖11)。 這說明鼠的引物對鼠類具有通用性，能適合多種鼠的鑒定。3、測序驗證將所有的小白鼠、大白鼠和田鼠肌肉的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果表明小白鼠(序列表中的序列19)、大白鼠(序列表中的序列20)和田鼠(序列表中的序列21)肌肉的PCR產(chǎn)物的大小均為^^3p，均在第185-190位有EcoR I的識別位點。
權(quán)利要求
1.鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的六個引物對組成，第一對引物是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，第二對引物是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，第三對引物是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對，第四對引物是由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對，第五對引物是由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對，第六對引物是由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR 引物對；所述動物為鼠、牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種。
2.鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，為下述1)-4)中任一種1)由獨立包裝的五個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，另外四個引物對為下述五個引物對中的任四個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和 /或器官的PCR引物對；所述動物為鼠、牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種；2)由獨立包裝的四個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，另外三個引物對為下述五個引物對中的任三個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和 /或器官的PCR引物對；所述動物為鼠、牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種；3)由獨立包裝的三個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，另外兩個引物對為下述五個引物對中的任兩個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和 /或器官的PCR引物對；所述動物為鼠、牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種；4)由獨立包裝的二個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，另外一個引物對為下述五個引物對中的任一個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和 /或器官的PCR引物對；所述動物為鼠、牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對組合物，其特征在于權(quán)利要求1所述六個引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 :1:1:1:1: 1 ；權(quán)利要求2中1)所述五個引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 :1:1:1: 1 ；權(quán)利要求2中2)所述四個引物對在PCR 反應(yīng)體系中的配比為1 :1:1: 1;權(quán)利要求2中3)所述三個引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 1 1;權(quán)利要求2中4)所述二個引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 1。
4.鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對，由兩條單鏈DNA組成，所述兩條 DNA單鏈分別為序列表中序列1所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈DNA。
5.鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對和限制性內(nèi)切酶，所述限制性內(nèi)切酶為EcoR I和/或Hind III ；所述動物為鼠、牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種。
6.權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
7.權(quán)利要求5所述的PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP和限制性內(nèi)切酶；所述限制性內(nèi)切酶為Hind III和/或EcoR I。
8.利用權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對鑒定或輔助鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有鼠、牛、羊、豬、雞和鴨這六種動物中至少一種動物組織和/或器官的方法，包括下述(1)和O)的步驟所述(1)為如下A)-F)中任一步驟A)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求1所述的引物對組合物進行PCR擴增；B)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求2中1)所述的引物對組合物進行PCR擴增；C)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求2中2、所述的引物對組合物進行PCR擴增；D)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求2中幻所述的引物對組合物進行PCR擴增；E)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求2中4)所述的引物對組合物進行PCR擴增；
9.F)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求3所述的引物對進行PCR擴增；(2)檢測步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是270-300bp，如^a3p的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有鼠組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是580-640bp，如61 Ibp的DNA 片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是460-520bp，如494bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是690-750bp，如716bp的DNA 片段，所述的DNA片段待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是230-270bp，如259bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是330-380bp，如 350bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有鴨組織和/或器官； 所述待測動物組織和/或器官來源于下述動物中的至少一種鼠、牛、羊、豬、雞、鴨。 9.利用權(quán)利要求5所述的試劑盒鑒定或輔助鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有鼠、牛、羊、豬、雞和鴨這六種動物中至少一種動物組織和/或器官的方法，包括下述a)和c)的步驟a)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求4所述試劑盒中的引物對組合物或引物對進行PCR擴增；b)檢測步驟a)得到的PCR產(chǎn)物的大小，確定所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官，方法如權(quán)利要求8步驟( 所述；c)對經(jīng)步驟b)檢測的PCR產(chǎn)物進行酶切鑒定，所述酶切鑒定的步驟及確定所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官的方法為下述 cl)-c6)中的至少一種cl)將所述大小是270-300bp，如的DNA片段用EcoR I進行酶切鑒定，如果所述 PCR擴增產(chǎn)物可被EcoR I酶切為80-120bp和170_200bp的兩個片段，如98bp和187bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有鼠組織和/或器官；c2)將所述大小是580-640bp，如611bp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定，如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被Hind III酶切為100_200bp和450_550bp的兩個片段，如135bp和 476bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；c3)將所述大小為460-520bp，如494bp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定的步驟， 如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被Hind III酶切為200-300bp的兩個片段，如和229bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；c4)將所述大小為690-750bp，如716bp的DNA片段用EcoR I進行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被EcoR I酶切為200-300bp和400-500bp的兩個片段，如255bp和 461bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；c5)將所述大小為230480bp，如259bp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定的步驟， 如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被Hind III酶切為50_100bp和150_200bp的兩個片段，如99bp和160bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官；c6)將所述大小為330-380bp，如350bp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定的步驟， 如果所述PCR擴增產(chǎn)物可被Hind III酶切為150_200bp的兩個片段，所述待測動物組織和 /或器官中含有或候選含有鴨組織和/或器官；所述待測動物組織和/或器官來源于下述動物中的至少一種鼠、牛、羊、豬、雞、鴨。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述方法，其特征在于所述檢測所得到的PCR產(chǎn)物大小的方法是將所得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示270-300bp之間的一條帶，如^^p，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有鼠組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示580-640bp之間的一條帶，如 611bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示460-520bp之間的一條帶，如494bp，所述待測動物組織和/ 或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示 690-750bp之間的一條帶，如716bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示230-280bp之間的一條帶，如 259bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官；如果所述PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示330-380bp之間的一條帶，如350bp，所述待測動物組織和/ 或器官中含有或候選含有鴨組織和/或器官。
全文摘要
本發(fā)明公開了鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的引物對為鑒定或輔助鑒定鼠、牛、羊、豬、雞和鴨組織和/或器官的共六個PCR引物對中，包含鑒定或輔助鑒定鼠組織和/或器官的PCR引物對在內(nèi)的至少一種引物對；所述鑒定或輔助鑒定鼠、豬、牛、羊、雞和鴨組織和/或器官的共六個PCR引物對依次分別由序列1和序列2所示兩條DNA單鏈、序列3和序列4所示兩條DNA單鏈組成、序列5和序列6所示兩條DNA單鏈、序列7和序列8所示兩條DNA單鏈、序列9和序列10所示兩條DNA單鏈、序列11和序列12所示兩條DNA單鏈組成。本發(fā)明六個引物對均選用了62℃的退火溫度，實現(xiàn)了在同一溫度一次PCR完成所有鑒別，且特異性強，檢測過程耗時短。
文檔編號C12N15/11GK102312011SQ201110304629
公開日2012年1月11日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者于雷, 姜艷彬, 尹艷, 李通, 李穎, 楊紅菊, 王海 申請人:侯東軍