專利名稱：焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，尤其涉及一種使用焦磷酸測序方法從痰標(biāo)本中直接檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥突變的引物和檢測方法。
背景技術(shù)：
利福平是抗結(jié)核聯(lián)合化療中主要的一線藥物，利福平耐藥性是MDR-TB的標(biāo)志物。利福平通過與RNA聚合酶的β亞單位結(jié)合阻礙了 RNA的轉(zhuǎn)錄和延伸。rpoB基因編碼RNA聚合酶的β亞單位。90%以上結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥菌株rpoB基因的利福平耐藥確定區(qū)域(Rifampin Resistance Retermining Region,RRDR)內(nèi)存在遺傳變異。突變類型包括單個核苷酸、缺失和插入變異。通過大量研究表明，利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株有87種不同類型的點突變或短核苷酸的插入與缺失，突變位于507 533密碼子處、編碼27個氨基酸、長度為81bp的RRDR。目前，前期建立的焦磷酸測序結(jié)核桿菌利福平耐藥性檢測方法是從結(jié)核分枝桿菌痰標(biāo)本培養(yǎng)物中進行檢測，但結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)的過程至少需時I月，嚴重制約了分子生物學(xué)檢測手段快速的優(yōu)越性，如果能從痰標(biāo)本中直接進行耐藥性檢測，則可以大大縮短藥敏結(jié)果的時間，對臨床指導(dǎo)價值更大。但由于痰標(biāo)本中所含菌量遠遠低于痰標(biāo)本純培養(yǎng)物，用以前的方法僅進行一輪PCR擴增，所得PCR產(chǎn)物濃度過低，遠遠達不到焦磷酸測序檢測的要求，無法實現(xiàn)在痰標(biāo)本中的檢測。中國專利CN1311435A披露了一種結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測芯片，其中在一經(jīng)修飾的載玻片上，固定有一系列寡核苷酸點陣探針。在檢測芯片中所說的探針是針對rpoB基因、katG基因、inhA 基因、kasA基因，每個探針長度至少為10個堿基，并且各個探針長度相同；突變點盡可能位于探針中間。鄭瑞娟等人在《中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志》2011年第2期中刊登了 “焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌四種藥物耐藥性” 一文，其中利用焦磷酸測序技術(shù)以10株已知藥敏結(jié)果和經(jīng)直接測序已知耐藥基因突變情況的MTB為試驗菌株，摸索焦磷酸測序檢測MTB的rpoB、katG、gyrA、rrs耐藥基因的最佳模式,并用該條件檢測89株MTB臨床分離株,并將檢測結(jié)果與BACTEC 960藥敏法進行比較，以便得到最佳的檢測方法。在現(xiàn)有常規(guī)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法中，都不可以避免需要事先對患者痰標(biāo)本進行分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株，這就使得檢測時間增長，檢測中需要進行反應(yīng)的次數(shù)也比較多，使得不能快速得出耐藥性的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種利用焦磷酸測序方法從痰標(biāo)本中直接檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥突變的引物和檢測條件。為了實現(xiàn)上述本發(fā)明提供一種焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法，包括以下順序步驟步驟I，對rpoB基因進行PCR擴增；
步驟2，對PCR擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序，判斷rpoB基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SQA模式、核苷酸加樣順序為AGCT。在上述提供的焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法中，其中對rpoB基因RRDR區(qū)進行焦磷酸測序。在焦磷酸測序過程中，針對rpoB基因507飛15位點和516 531位點設(shè)計引物。在上述提供的焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法中，其中核苷酸以A、G、C、T順序循環(huán)加樣16次。在上述提供的焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法中，其中所述對rpoB基因進行PCR擴增進行兩次PCR擴增，其中第一次擴增以痰標(biāo)本結(jié)核桿菌DNA提取物為模板，第二次擴增以第一次擴增PCR產(chǎn)物為模板。在上述提供的焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法中，其中所述第一次擴增使用的第一 PCR引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示序列，所述第二次擴增使用的第二 PCR引物具有SEQ ID NO. 3所示序列或帶有生物素標(biāo)記的具有SEQ IDNO. 2所示序列。在上述提供的焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法中，其中所述第一 PCR引物和第二 PCR引物的濃度為0. 4 μ mol/L。在上述提供的焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法中，其中在焦磷酸測序中用的測序引物具有SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5所示序列。在上述提供的焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法中，其中所述擴增反應(yīng)過程包括下列順 序步驟
步驟1:在94°C下進行預(yù)熱5分鐘；
步驟2 :在95°C下保持30秒進行變性、65°C下保持30秒進行退火、72°C下保持30秒進行擴增和延伸，循環(huán)該過程40次；
步驟3 :在72°C下保持10分鐘。本發(fā)明提供的焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法可以從患者痰標(biāo)本直接進行耐藥性檢測，無需再做分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株，相比現(xiàn)在常用檢測方法可以縮短檢測時間，減少焦磷酸序列測定所需要的反應(yīng)次數(shù)和檢測試劑用量。


圖1是本發(fā)明中對利福平rpoB基因第一輪PCR擴增檢測結(jié)果。圖2是本發(fā)明中對利福平rpoB基因第二輪PCR擴增檢測結(jié)果。圖3是用SQA模式測序利福平rpoB基因511及516位點標(biāo)準株焦磷酸結(jié)果。圖4是本發(fā)明中用SQA模式檢測利福平rpoB基因511及516位點痰標(biāo)本焦磷酸結(jié)果。
具體實施例方式
由于rpoB基因的突變主要集中于RRDR區(qū)，在RRDR區(qū)內(nèi)突變位點較多，在本發(fā)明主要針對利福平rpoB耐藥基因RRDR區(qū)進行焦磷酸測序檢測方法。本發(fā)明提供的一種檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥性的方法，先對rpoB基因進行PCR擴增，再對PCR擴增產(chǎn)物采用SQA模式進行焦磷酸測序，判斷rpoB基因是否具有突變位點，其中核苷酸加樣順序為AGCT。焦磷酸測序技術(shù)
焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術(shù)是全新的一種DNA序列分析技術(shù),可以快速、準確地測定一段較短的目標(biāo)片段。該技術(shù)無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，操作極為簡便。由于焦磷酸測序技術(shù)操作簡單，且結(jié)果準確可靠，可應(yīng)用于SNP位點檢測、等位基因頻率測定、細菌和病毒分型等領(lǐng)域。焦磷酸測序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，基本原理如下將I個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase 和 Apyrase)和底物混合物(包括 APS 和Luciferin)。向反應(yīng)體系中加入I種dNTP,如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對,貝U會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時釋放出摩爾數(shù)的焦磷酸基團。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP ;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。加入另一種dNTP,使第2 — 4步反應(yīng)重復(fù)進行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。焦磷酸測序操作系統(tǒng)中共有2個模式能進行堿基突變的檢測，即序列分析模式(Sequence Analysis, SQA)和單核苷酸多態(tài)性模式(Single Nucleotide polymorphism,SNP)ο其中SQA模式的核苷酸加樣順序為循環(huán)順序加樣法，即通過循環(huán)反復(fù)的加入A、G、C、T四種核苷酸以檢測出待檢樣品的序列，該法一次能準確判讀40bp左右的堿基，將所測定序列與已知序列比對后自行 判讀突變情況。SNP模式的核苷酸加樣順序為特定順序加樣法，即系統(tǒng)根據(jù)設(shè)定的待檢位點及位點周圍的序列自動生成核苷酸的加樣順序，僅對單個位點的堿基變化進行檢測，不對整個序列進行測定。針對不同的檢測對象，需要摸索不同的焦磷酸測序檢測方法。以下通過實施例對本發(fā)明內(nèi)容作進一步的詳細說明，以便更好理解本發(fā)明創(chuàng)造的內(nèi)容，但是下述實施例并不限制本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍。采集檢測物
收集病人晨痰并存放在無菌樣本保存管內(nèi)，痰量以3 5mL為宜，密封后送檢。檢測物預(yù)處理和DNA提取
取適量被檢測物，加入等量N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化液，震蕩30秒，置于室溫下15分鐘，如果標(biāo)本粘稠可適當(dāng)延長消化時間。檢測物中加入PBS緩沖液20mL，混勻并離心，離心條件為20分鐘3000g。去除上層清液，加入PBS緩沖液20mL用于洗滌沉淀。洗滌2次后，將沉淀重懸于50 μ L TB裂解液中(TB裂解液為含有0. 04%Na0H, 0. 1% SDS和15%ChelexlOO溶液)，在50°C下水浴I小時，后沸水浴10分鐘。再次離心分離，取上層清液并在_20°C環(huán)境下保存?zhèn)溆?，即得到到結(jié)核桿菌DNA提取物。利福平rpoB耐藥基因的PCR擴增用具有SEQ ID NO.1所示序列的PCR第一引物和具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第一引物進行第一輪擴增，模板為病人痰檢測物的結(jié)核桿菌DNA提取物。在50 μ L反應(yīng)體系中，第一引物最佳的濃度為O. 4μ mol/L。PCR反應(yīng)過程如下先在94°C下進行預(yù)熱5分鐘；在95°C下保持30秒進行變性、65°C下保持30秒進行退火、72°C下保持30秒進行擴增和延伸，并循環(huán)該過程40次；最后在72°C下保持10分鐘。用具有SEQ ID NO. 3所示序列的PCR第二引物和帶有生物素(BIO)標(biāo)記的具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第二引物進行第二輪擴增，模板為第一輪擴增的PCR產(chǎn)物。在50 μ L反應(yīng)體系中，第二引物最佳的濃度為O. 4 μ mol/L。PCR反應(yīng)過程如下先在94°C下進行預(yù)熱5分鐘；在95°C下保持30秒進行變性、65°C下保持30秒進行退火、72°C下保持30秒進行擴增和延伸，并循環(huán)該過程40次；最后在72°C下保持10分鐘。取2 μ L的PCR產(chǎn)物進行1. 5 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，在12V/cm電位梯度下電泳20分鐘，后在紫外燈下檢 查擴增效果。圖1和圖2是對利福平rpoB基因進行PCR擴增結(jié)果，其中M為標(biāo)準帶，Γ5為結(jié)核病人痰標(biāo)本。圖中可以看到存在一條單一信號較強的條帶，并且沒有剩余的引物，也沒有引物二聚體或其他非特異的條帶存在。具有SEQ ID NO.1所示序列擴增引物、具有SEQ ID NO. 2所示序列擴增引物和具有SEQ ID NO. 3所示序列擴增引物的序列表如下所示。SEQ ID NO.1 CCGGTGGAAACCGACGACATCGACCSEQ ID NO. 2 GGCACGCTCACGTGACAGAC
SEQ ID NO. 3 GGAGCGGATGACCACCCAGGAC
具有SEQ ID NO.1所示序列的PCR第一引物和具有SEQ ID NO. 3所示序列的PCR第二引物為兩條正向引物。具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第一引物和帶有生物素(BIO)標(biāo)記的具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第二引物為兩條反向引物，具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第一引物與帶有生物素(BIO)標(biāo)記的具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第二引物序列一致。由此具有相同的退火溫度，可以共用同樣的PCR擴增條件。帶有生物素標(biāo)記的引物在檢測中起到標(biāo)記作用。焦磷酸測序1.檢測試劑配制
結(jié)合緩沖液將 IOmmoI/L Tris_HCl、2mol/L NaClUmmol/L EDTA 和 O. 1% Tween20 去離子水溶解，用I mol/L HCl調(diào)pH至7. 6。變性緩沖液(denatureationbuffer) 0. 5 mol/L NaOH。退火緩沖液將20 mmol/L Tris_Acetate、2mmol/L MgAc2 溶液混合,用 4mol/L 乙酸調(diào)pH至7. 6。洗漆緩沖液(washingbuffer):用 4mol/L 乙酸將 10 mmol/L Tris-Acetate 溶液調(diào)pH至7. 6。70%乙醇在70mL無水乙醇中加入高純水20mL,充分混勻后定容至100mL。2.檢測儀器及配套試劑
(1) PSQ 96全自動焦磷酸測序儀、PSQ96單鏈制備工具臺(Vacuum prepworkstation)、真空樣品轉(zhuǎn)移器(Vacuum prep tool)、真空泵、潤旋振蕩器、PCR儀。(2)瑞典PYROSEQUENCING AB公司生產(chǎn)的焦磷酸微測序試劑盒(PSQ 96MA SQAUpgrade Kit)和鏈親和素包被的磁珠(Sepharose beads)。3.焦磷酸測序檢測步驟
(I)PCR產(chǎn)物固定在PCR板中放入40 μ L的具有PCR擴增產(chǎn)物，再分別加入36 μ L的結(jié)合緩沖液和4 μ L鏈親和素包被的磁珠。將PCR板放在渦旋振蕩器上常溫振蕩20分鐘，使PCR產(chǎn)物固定在磁珠上。(2)單鏈模板的純化打開真空泵，將真空樣品轉(zhuǎn)移器移到PCR板中，抓取結(jié)合PCR產(chǎn)物的磁珠，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空樣品轉(zhuǎn)移器上。再將真空樣品轉(zhuǎn)移器放入70%乙醇中輕微振蕩5秒，然后移到變性緩沖液中抽吸5秒，使DNA變性以得到純化的單鏈DNA模板，最后移到洗滌緩沖液中清洗5 10秒，洗滌未固定的單鏈DNA，從而得到作為測序模板的單鏈DNA。(3)引物雜交先在焦磷酸測序微孔板各孔中加入退火緩沖液50 μ L，再加入具有SEQ ID NO. 4所不序列測序引物和具有SEQ ID NO. 5所不序列的測序引物。測序引物的最低要求濃度為I μ mol/L,最高濃度為O. 2mmol/L。再將真空樣品轉(zhuǎn)移器從PCR板移入焦磷酸測序微孔板，關(guān)閉真空泵，將已純化好的單鏈DNA模板與具有SEQ ID NO. 4所示序列測序物和具有SEQ ID NO. 5所示序列測序引物混和，在80°C下變性2分鐘，然后冷卻至室溫，使引物與模板退火雜交。具有SEQ ID NO. 4所不序列測序引物和具有SEQ ID NO. 5所不序列測序引物的序列表如下所示。SEQ ID NO. 4 GCGATCAAGGAGTTC SEQ ID NO. 5 ATGGACCAGAACAACC
(4)焦磷酸測序利用由瑞典Pyrosequencing AB公司生產(chǎn)的PSQ96MA測序儀和試劑盒，依次在試劑倉中加入酶、底物和4種dNTPs，選用SQA檢測模式、以A、G、C、T順序循環(huán)加樣16次的堿基加入順序進行測序反應(yīng)。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)對每次加樣后產(chǎn)物進行檢測，以獲得特異的檢測峰，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。圖4是采用SQA模式利福平rpoB基因511及516位點痰標(biāo)本焦磷酸測序結(jié)果，檢測得出的序列為TTCGGCACCAGCCAGa^AGCCAATTCATft^CCAGAA。將其與圖3的利福平rpoB基因511及516位點標(biāo)準株焦磷酸測序結(jié)果得到序列為TTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATQGACCkQkk的結(jié)果相比，可得出圖中方框內(nèi)為突變的基因序列。通過將多次檢驗結(jié)果與利福平rpoB基因511及516位點標(biāo)準株焦磷酸測序結(jié)果相比較，具有SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示序列的測試引物能高度準確的檢測出利福平耐藥突變位點，在臨床研究中可以方便將其應(yīng)用在檢測之中。由于通常痰標(biāo)本中所含菌量遠遠低于痰標(biāo)本純培養(yǎng)物，用以前的方法僅進行一輪PCR擴增，得到的PCR產(chǎn)物濃度過低，遠遠達不到焦磷酸測序檢測的要求，無法實現(xiàn)在痰標(biāo)本中的檢測。在本發(fā)明中利用三條引物進行兩次PCR擴增，使得約95%的痰標(biāo)本均能獲得高質(zhì)量的耐藥基因目的片段，滿足焦磷酸測序檢測的需求，實現(xiàn)從痰標(biāo)本直接進行結(jié)核桿菌耐藥性測定，滿足臨床快速診斷耐藥結(jié)核病的需求，為臨床合理用藥提供實驗室依據(jù)。本發(fā)明提出的焦磷酸測序技術(shù)檢測耐藥性的方法，同樣也可以應(yīng)用在胸水、腦脊液血液等體液標(biāo)本的檢測中、檢測速度快、準確性高。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因 此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法，其特征在于，包括以下順序步驟 步驟I，對rpoB基因進行PCR擴增； 步驟2，對PCR擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序，判斷rpoB基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SQA模式、核苷酸加樣順序為AGCT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對rpoB基因RRDR區(qū)進行焦磷酸測序。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在干，所述焦磷酸測序過程中，針對rpoB基因507 515位點和516 531位點設(shè)計引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸以A、G、C、T順序循環(huán)加樣16次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對rpoB基因進行PCR擴增進行兩次PCR擴增，其中第一次擴增以痰標(biāo)本結(jié)核桿菌DNA提取物為模板，第二次擴增以第一次擴增PCR產(chǎn)物為模板。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增使用的第一PCR引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示序列，所述第二次擴增使用的第二 PCR引物具有SEQ IDNO. 3所示序列或帶有生物素標(biāo)記的具有SEQ ID NO. 2所示序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PCR引物和第二 PCR引物的濃度為 0. 4 u mol/Lo
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在焦磷酸測序中用的測序引物具有SEQID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增反應(yīng)過程包括下列順序步驟 步驟1:在94°C下進行預(yù)熱5分鐘； 步驟2 :在95°C下保持30秒進行變性、65°C下保持30秒進行退火、72°C下保持30秒進行擴增和延伸，循環(huán)該過程40次； 步驟3 :在72°C下保持10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法，包括以下順序步驟對rpoB基因進行PCR擴增；對PCR擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序，判斷rpoB基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SQA模式、核苷酸加樣順序為AGCT。本發(fā)明提供的焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法可以從患者痰標(biāo)本直接進行耐藥性檢測，無需再做分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株，相比現(xiàn)在常用檢測方法可以縮短檢測時間，減少焦磷酸序列測定所需要的反應(yīng)次數(shù)和檢測試劑用量。
文檔編號C12R1/32GK103045717SQ201110305109
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者鄭瑞娟, 胡忠義, 朱長太, 周燕, 王潔, 秦蓮花 申請人:上海市肺科醫(yī)院