專利名稱：結(jié)核患者血清IgG抗體適配子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物感染免疫和檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種血清IgG (免疫球蛋白G)抗體的適配子及其制備方法，尤其涉及一種結(jié)核患者血清IgG抗體適配子及其制備方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis)感染人體導(dǎo)致的結(jié)核病是一種嚴(yán)
重危害人民身體健康的慢性傳染病。結(jié)核病是歷史上患病率和死亡率最高的疾病之一。上
世紀(jì)50年代以來，結(jié)核病的流行在一定程度上得到了控制。我國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，國
務(wù)院已確定結(jié)核病為我國三大重點(diǎn)防治傳染病之一。因此，加強(qiáng)對結(jié)核病的研發(fā)力度，亟待
研制新型抗結(jié)核新藥，以便對該病進(jìn)行有效的治療和預(yù)防，具有很大的研究價值和社會效益。目前結(jié)核病控制存在的最主要的問題是病人發(fā)現(xiàn)率低、治愈率低。在診斷方面，現(xiàn)有的檢查方法均存在著一定的局限，難以達(dá)到快速、準(zhǔn)確的結(jié)核病診斷。在治療方面，常規(guī)的化療藥物面臨著巨大的挑戰(zhàn)，現(xiàn)有的藥物已很難應(yīng)對不斷出現(xiàn)的耐多藥臨床菌株，治愈率難以提高。近40余年來，尚無新的高效抗結(jié)核藥物問世。因此，加大結(jié)核分枝桿菌的基礎(chǔ)研究，尋找快速、靈敏、簡便、實(shí)用的結(jié)核病診斷新方法，提高結(jié)核病人的檢出率，以及尋找新的治療方法或者開發(fā)新的抗結(jié)核藥物，是目前結(jié)核病研究需要迫切解決的問題。但現(xiàn)代結(jié)核病癥狀交叉、隱蔽，導(dǎo)致漏診、誤診時有出現(xiàn)。臨床對肺結(jié)核的診斷方法提出更高要求。常規(guī)方法的抗酸染色鏡檢查抗酸桿菌陽性率低，培養(yǎng)結(jié)果雖可靠，但耗時長，需3 8周，且陽性率也低。結(jié)核菌素試驗(yàn)的影響因素較多，存在假陰性等問題?；顒有越Y(jié)核病患者細(xì)胞免疫減損而體液免疫亢進(jìn)，血液及其他體液中結(jié)核抗體(主要是IgG)升高，檢測出結(jié)核抗體有助于結(jié)核病的診斷。結(jié)核抗體測定對活動性肺結(jié)核診斷具有較高的實(shí)用價值。因此，結(jié)核IgG抗體可以作為新的抗結(jié)核藥物的篩選靶點(diǎn)，與其特異性結(jié)合的分子將有可能成為新的抗結(jié)核藥物。寡核苷酸適配子技術(shù)是近年來發(fā)展的一種新型的分子生物學(xué)技術(shù)，是采用指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX)篩選獲得的。SELEX技術(shù)是20世紀(jì)90年代初研制的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，基本原理是運(yùn)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫，并結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，并結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過多輪篩選，或得高親和力、特異性強(qiáng)的寡核苷酸適配子(aptamers),具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高等優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用范圍十分廣泛。已成功運(yùn)用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機(jī)染料、蛋白質(zhì)、藥物、氨基酸以及各種細(xì)胞因子等。已有研究通過SELEX技術(shù)篩選到相應(yīng)靶物質(zhì)的適配子作為拮抗劑，適用于腫瘤生長時的血管內(nèi)皮生長因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白和促生長因子等，已達(dá)到治療目的。在微生物檢測方面，特別是對一些未知的致病性細(xì)菌或病毒的研究， 雖然不知道其內(nèi)部結(jié)構(gòu)、功能以及這些物質(zhì)的表位，但將其作為靶物質(zhì)，通過SELEX過程篩選到與其相對應(yīng)的適配子，檢測靶物質(zhì)，已成為該領(lǐng)域的研究探索熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明的目的是提供了一種結(jié)核患者血清免疫球蛋白G抗體的DNA適配子及其制備方法。本發(fā)明的另一個目的是提供了應(yīng)用上述適配子檢測結(jié)核患者血清的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的一種結(jié)核患者血清免疫球蛋白G抗體適配子，其序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。SEQ ID NO.1 GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-CGCATTTCGCAACACGACTTGGCCAACGTACCTGG -TTCGACATGAGGCCCGGATC
SEQ ID NO. 2 GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-GACCTGGACGTCTTGCGCATAGTGCGGTGGCCCGC -TTCGACATGAGGCCCGGATCSEQ ID NO. 3 GGGAGCTCAGAATAA`ACGCTCAA-CGGTCAACTCGTGTA-TTCGACATGAGGCCCGGATC
上述結(jié)核患者血清免疫球蛋白G抗體適配子的制備方法，包括以下步驟
步驟1，構(gòu)建隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫，設(shè)計(jì)合成78堿基對的隨機(jī)單鏈DNA文庫
5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表堿基 A、G、C、T中的任意一個，容量為IO14-1O15,并進(jìn)一步得到純化的單鏈ssDNA文庫用于IgG抗體適配子的SELEX技術(shù)篩選；
步驟2，利用適配子技術(shù)篩選免疫球蛋白G抗體適配子用包被緩沖液將IgG適配子包被于微孔板中，同時設(shè)空白反篩孔及健康人血清反篩孔；ssDNA文庫和SELEX結(jié)合緩沖液混勻后先與空白反篩孔進(jìn)行孵育；然后轉(zhuǎn)移到IgG抗體包被孔進(jìn)行孵育，SELEX沖洗緩沖液洗滌，甩干后加入SELEX洗脫緩沖液洗脫與IgG抗體結(jié)合的ssDNA，產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化，PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行10輪篩選，篩選后的飽和文庫，經(jīng)克隆測序，獲得單個適配子。在本發(fā)明的一個較佳實(shí)施例中，步驟I中還包括對免疫球蛋白G抗體的純化。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述純化包括按常規(guī)方法將結(jié)核患者血清過層析柱，并用硫氰酸鉀洗脫。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，步驟2中使用SELEX結(jié)合緩沖液為20mmol/LHepes, 120mmol/LNaCl, 5mmol/LKCl, lmmol/LCaCl2, Immol/LMgCl，所述 SELEX 結(jié)合緩沖液的pH值為7. 35。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，步驟2中使用SELEX沖洗緩沖液為所述SELEX結(jié)合緩沖液與O. 05% Tween 20溶液的混合溶液。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，步驟2中使用SELEX洗脫緩沖液為20 mmol/LTris-HCl, 4 mol/L異硫氰酸胍，ImmoI/L DTT，所述SELEX洗脫緩沖液pH值為8. 3。本發(fā)明的結(jié)核患者血清IgG抗體DNA適配子親和性、特異性高，制備方法簡便；其用于血清學(xué)檢測能顯著提高結(jié)核病人陽性檢出率，可用于人及動物結(jié)核病的快速、簡便診斷，可以為結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷及抗結(jié)核治療評估提高有利依據(jù)。


圖1是SEQ ID NO.1的IgG抗體DNA適配子的二級結(jié)構(gòu)圖譜；
圖2是SEQ ID NO.1的IgG抗體DNA適配子的二級結(jié)構(gòu)圖譜；
圖3是SEQ ID NO.1的IgG抗體DNA適配子的二級結(jié)構(gòu)圖譜。
具體實(shí)施例方式一種結(jié)核患者血清免疫球蛋白G (IgG)抗體適配子，其具有SEQ ID NO. USEQ IDNO. 2或SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。一種結(jié)核患者血清免疫球蛋白G抗體的DNA適配子的制備方法，包括以下步驟 步驟1，構(gòu)建隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫設(shè)計(jì)合成78堿基對的隨機(jī)單鏈DNA文庫·5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表堿基 AGCT中的任意一個，容量為IO14-1O15,并進(jìn)一步得到純化的單鏈ssDNA文庫用于IgG抗體適配子的SELEX技術(shù)篩選；
步驟2，以微孔板為分離介質(zhì)利用適配子技術(shù)篩選免疫球蛋白G抗體適配子用包被緩沖液將IgG適配子包被于微孔板中，同時設(shè)空白反篩孔及健康人血清反篩孔；ssDNA文庫和SELEX結(jié)合緩沖液混勻后先與空白反篩孔進(jìn)行孵育；然后轉(zhuǎn)移到IgG抗體包被孔進(jìn)行孵育，SELEX沖洗緩沖液洗滌，甩干后加入SELEX洗脫緩沖液洗脫與IgG抗體結(jié)合的ssDNA，產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化，PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行10輪篩選，篩選后的飽和文庫，經(jīng)克隆測序，獲得單個適配子。本發(fā)明將LESEX技術(shù)引進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的研究領(lǐng)域，以IgG為靶物質(zhì)，篩選獲得IgG的適配子，為進(jìn)一步利用適配子技術(shù)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的診斷治療提供依據(jù)。應(yīng)用上述結(jié)核患者血清免疫球蛋白G抗體的DNA適配子診斷結(jié)核病的方法，選擇IgG適配子或適配子組合構(gòu)建寡核苷酸酶聯(lián)免疫檢測體系。本發(fā)明在獲得IgG適配子后，可通過選擇IgG適配子或適配子組合構(gòu)建寡核苷酸酶聯(lián)免疫檢測體系來進(jìn)行結(jié)核患者血清學(xué)檢測。已達(dá)到快速、準(zhǔn)確診斷的目的。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，一種結(jié)核患者血清IgG抗體的DNA適配子的制備方法，包括
步驟1,(1)結(jié)核患者血清IgG抗體的純化
用5倍體積的結(jié)合緩沖液(O. lmol/LNaHC03、0· 5mol/LNaCl, pH值為8. 3)洗層析柱；10份結(jié)核初治患者的血清過層析柱2次，過柱速度稍慢；10倍體積的結(jié)合緩沖液洗滌；ImlKSCN(硫氰酸鉀10柱體積，3mol/L，pH值6.1)洗脫；柱子用結(jié)合緩沖液洗滌、蒸餾水洗柱、20%酒精洗柱；柱回收至Iml指形管中，4°C保存；洗脫餾分中回收的IgG抗體進(jìn)行SDS-PAGE膠、Bradford法定量抗體濃度；回收的IgG抗體放_20°C保存待用。(2)構(gòu)建隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫并得到純化的單鏈DNA文庫
構(gòu)建隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫設(shè)計(jì)合成78堿基對的隨機(jī)單鏈DNA文庫
5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表堿基 AGCT中的任意一個，容量為IO14-1O15 ;構(gòu)建上游引物5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’，構(gòu)建下游引物 5’ -TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。并進(jìn)一步得到純化的單鏈ssDNA文庫用于IgG抗體適配子的SELEX技術(shù)篩選。設(shè)計(jì)并得到純化的單鏈DNA文庫可以通過一般的PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增、不對稱PCR法和酚氯仿法純化得到。步驟2，利用適配子技術(shù)篩選免疫球蛋白G (IgG)抗體適配子
用包被緩沖液(O. 05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值9. 6)將IgG適配子包被于微孔板中，同時設(shè)空白反篩孔及健康人血清反篩孔；IgG抗體包被孔和反篩孔均以5% BSA(牛血清白蛋白)封閉；ssDNA文庫和SELEX結(jié)合緩沖液混勻后先與空白反篩孔于37°C下進(jìn)行孵育，去除與BSA和微孔板結(jié)合的ssDNA ;然后轉(zhuǎn)移到IgG抗體包被孔于37°C下進(jìn)行孵育，SELEX沖洗緩沖液洗滌，甩干后加入SELEX洗脫緩沖液于80°C作用lOmin，洗脫與IgG抗體結(jié)合的ssDNA，產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化，PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行下一輪篩選。共進(jìn)行10輪篩選。在第5、7、8、9、10輪進(jìn)行以健康人血清為背景的反篩。篩選后的飽和文庫，經(jīng)克隆測序，獲得單個適配子。該適配子即為能與IgG抗體結(jié)合的DNA適配子，其序列為序列1、序列2和序列3，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析獲得該適配子的二級結(jié)構(gòu)圖譜(見圖1至圖3)。本發(fā)明的實(shí)施例所用的SELEX結(jié)合緩沖液為20mmol/L Hepes, 120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，lmmol/LCaCl2，Immol/LMgCl，結(jié)合緩沖液 pH 值為 7.35 ；SELEX 沖洗緩沖液為SELEX結(jié)合緩沖液+0. 05% Tween 20 ;SELEX洗脫緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl,4 mol/L異硫氰酸胍，lmmol/L DTT，洗脫緩沖液的pH值為8. 3。應(yīng)用本發(fā)明IgG抗體的DNA適配子進(jìn)行血清檢測的方法，包括
選擇具有高親和性的Ig G抗體適配子或適配子組合構(gòu)建寡核苷酸酶聯(lián)免疫檢測體系(enzyme-linked oligonucleotide sorbent assay, EL0SA)用于結(jié)核病的血清學(xué)檢測。適配子用分光光度計(jì)測濃度，并經(jīng)99°C變性5min，冰浴IOmin進(jìn)行預(yù)處理；處理后的適配子用包被液(0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值9. 6)稀釋，按照每孔0. μδ的濃度包被酶聯(lián)板，包被過程為37°C孵育2h，4°C過夜；然后5% BSA (牛血清白蛋白)37°C下封閉Ih ；
將血清用樣品稀釋液按照1:25的比例稀釋加入，37°C孵育30min ;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人二抗，37°C孵育30min ;加入PBST洗滌3次，3min/次；
顯色試劑A與顯色試劑B按照1:1的比例混合加入，37°C孵育lOmin，加入終止液終止顯色；加入PBST洗滌3次，3min/次；
利用酶標(biāo)儀雙波長(450nm和620nm)檢測樣本的吸光度值(A450，A620)。結(jié)果判斷進(jìn)行結(jié)果判斷的OD值應(yīng)為0D450nm與0D630nm的差值。陽性對照每孔OD值彡0. 5 ;陰性對照OD值< 0. 1，否則試驗(yàn)不成立。臨界值(Cutoff)計(jì)算陰性對照平均OD值+ 0. 06 (備注陰性對照OD值低于0. 05，以0. 05計(jì)算，高于0. 05按實(shí)際值計(jì)算)。結(jié)果解釋樣品OD值彡臨界值為結(jié)核抗體陽性；樣品OD值〈臨界值為結(jié)核抗體陰性。本發(fā)明的IgG抗體DNA適配子用于血清學(xué)檢測能顯著提高結(jié)核病人陽性檢出率，可用于人及動物結(jié)核病的快速、簡便診斷，可以為結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷及抗結(jié)核治療評估提聞有利依據(jù)。以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核患者血清IgG抗體適配子，其序列為SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2或SEQ IDNO. 3所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1，構(gòu)建隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫，設(shè)計(jì)合成如下78堿基對的隨機(jī)單鏈DNA文庫5， -gggagctcagaataaacgctcaa-n35-ttcgacatgaggcccggATC-3，， 其中N代表堿基A、G、C、T中的任意ー個，容量為IO14-1O15 ； 步驟2，利用適配子技術(shù)篩選免疫球蛋白G抗體適配子。
3.如權(quán)利要求2所述的結(jié)核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在干，步驟I中還包括對免疫球蛋白G抗體的純化。
4.如權(quán)利要求3所述的結(jié)核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在于，所述純化包括按常規(guī)方法將結(jié)核患者血清過層析柱，并用硫氰酸鉀洗脫。
5.如如權(quán)利要求2所述的結(jié)核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在于，步驟2 的適配子技術(shù)中使用了 SELEX 結(jié)合緩沖液20mmol/L Hepes, 120mmol/L NaCl, 5 mmol/LKCl，lmmol/LCaCl2, Immol/LMgCl，所述 SELEX 結(jié)合緩沖液的 pH 值為1. 35。
6.如如權(quán)利要求5所述的結(jié)核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在于，步驟2中的適配子技術(shù)使用了 SELEX沖洗緩沖液所述SELEX結(jié)合緩沖液與0. 05% Tween 20溶液的混合溶液。
7.如如權(quán)利要求2所述的結(jié)核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在于，步驟2中的適配子技術(shù)使用了 SELEX洗脫緩沖液20mmol/L Tris-HCl, 4mol/L異硫氰酸胍，lmmol/L DTT,所述SELEX洗脫緩沖液pH值為8. 3。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種結(jié)核患者血清IgG抗體適配子，其序列為SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的核苷酸序列及其制備方法。本發(fā)明的結(jié)核患者血清IgG抗體DNA適配子親和性、特異性高，其用于血清學(xué)檢測能顯著提高結(jié)核病人陽性檢出率，可用于人及動物結(jié)核病的快速、簡便診斷，可以為結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷提供有利依據(jù)。
文檔編號C12N15/115GK103045600SQ201110305110
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者秦蓮花, 胡忠義, 楊華, 劉忠華, 蔡江麗 申請人:上海市肺科醫(yī)院