專利名稱：一種熒光原位雙雜交方法
技術領域：
本發(fā)明涉及熒光原位雜交，特別涉及一種熒光原位雙雜交方法，屬于生物醫(yī)學領域。
背景技術：
熒光原位雜交(fluorescencein situ hybridization, FISH)是在放射性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。FISH的基本原理是將DNA (或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記，然后將探針直接雜交到染色體或DNA (或RNA)上，并用熒光素分子標記的單克隆抗體與探針分子特異性結合，來檢測DNA序列在染色體或DNA (或RNA)上的定性、定位。國內外的熒光原位雜交應用主要在于臨床方面，用來檢驗基因染色體位點變異，如慢性粒細胞白血病bcr/abl易位DNA探針和實體腫瘤檢測的HER-2/neu基因探針。然而對組織中目的基因mRNA水平的定位及表達差異變化的研究方面應用甚少，目前缺乏一套穩(wěn)定的體系來進行檢測。在以往的FISH研究中，由于探針自身信號的強弱不同，雜交信號的顯示存在不足。盡管采用的熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡對雜交結果進行觀察，仍然不能很好地克服雜交信號顯示不清楚的問題。在雙標熒光原位雜交的方法的應用中，仍局限于臨床染色體異常檢測方面，如檢測人精子染色體數(shù)目異常、檢測星形細胞瘤染色體17pl3. 1 的丟失等。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種熒光原位雙雜交方法，對建立模型后的活體動物進行灌注、取材、切片后，該方法通過生物素標記的探針與組織中的mRNA發(fā)生特異性的結合，對組織中目標基因mRNA的定位、表達差異變化進行熒光顯示，從而方便、準確的觀察到組織中目標基因mRNA水平的變化。本發(fā)明的技術方案是設計一種熒光原位雙雜交方法，其特征是它包括以下具體步驟是一種熒光原位雙雜交方法，其特征是它包括以下具體步驟是
1)用含有H2A終濃度為m的摩爾濃度為0.1 mol/L的DEPC-PB孵育切片1次，室溫， 10-15分鐘；所述的H2A終濃度為m，所述的0. lmol/L DEPC-PB是用磷酸氫二鈉29. 0 克，磷酸二氫鈉2. 9克，用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為0. 1%的DEPC Iml過夜放置后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述的切片為生物組織切片；
2)用摩爾濃度為0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步驟1)中處理過的切片1次，室溫，10-20 分鐘；
3)用含有TritonX-100終濃度為0. 3%的摩爾濃度為0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步驟2)中處理過的切片1次，室溫，10-15分鐘；所述的Triton X-100終濃度為0. 3% ；
4)50 ml的乙?；悍跤襟E3)中處理過的切片1次，室溫，10-15分鐘；
5)摩爾濃度為0.1 mol/L DEPC-PB孵育步驟4)中處理過的切片2次，室溫，各10 -15分鐘；
6)在雜交液中孵育步驟5)中處理過的切片，此過程稱為預雜交，溫度為60°C，所需時間1-2小時；
7)在雜交液中加入DIG標記的探針，同時再加入FITC標記的探針，DIG標記的探針和 FITC標記的探針的終濃度為lug/ml，雜交過夜16-20小時，雜交溫度根據(jù)探針引物的退火
溫度來確定；
8)從步驟7)所述的雜交液中取出切片用洗滌液清洗2次，60°C，各20-30分鐘；
9)用RNA緩沖液孵育步驟8)中處理過的切片1次，370C，20-30分鐘；
10)用加入RNA酶的RNA緩沖液孵育步驟9)中處理過的切片，37°C，30-40分鐘；所述的RNA酶終濃度為20ug/ml ；
11)用2X SSC孵育步驟10)中處理過的切片2次，37°C，各20-30分鐘；
12)用0.2x SSC孵育步驟11)中處理過的切片2次，37°C，各20-30分鐘；
13)用TS7.5孵育步驟12)中處理過的切片1次，室溫，5-10分鐘；所述的TS7. 5是由摩爾濃度為0. 1 mol /L Tris-HCl, PH 7. 5，摩爾濃度為0. 15 mol /L NaCl溶液用超純水配制而成；
14)用TBS封閉將步驟13)中處理過的片子封閉，室溫孵育1-2小時；所述的TBS:是由TS7. 5和體積百分比為1%的Blocking Reagent配制而成；
15)按1:200的抗體效價，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步驟14) 中處理過的切片，室溫，過夜；
16)用TNT于室溫洗滌步驟15)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；所述的 TNT:是由TS7. 5和體積百分比為0. 05% Tween20配制而成；
17)用摩爾濃度為0.1 mol/L的PB洗滌步驟16)中處理過的切片1次，室溫，10-15分
鐘；
18)TSA-Biotin反應，放大雜交信號
①將步驟17)中處理過的切片加入反應液中，室溫，孵育10-15分鐘；
②在上述反應液中加入50ul的濃度為200mg/mlβ-D葡萄糖，于室溫孵育30分鐘；
19)用0.1 mol /L的PB洗滌步驟18)中處理過的切片，室溫，10-20分鐘；
20)在NaN3的終濃度為21的0.1 mol/L的PB中孵育步驟19)處理過的切片，室溫， 10-15分鐘；
21)用TNT洗滌步驟20)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；
22)按1 2000的抗體效價，用TBS稀釋Anti-Fluorescein-POD抗體，室溫孵育步驟21) 中處理過的切片，過夜；
23)用TNT洗滌步驟22)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；
24)TSA-DNP反應根據(jù)試劑盒的說明書操作，按照1 :50比例將TSA-DNP稀釋后孵育步驟23)中處理過的切片；
25)用TNT洗滌步驟中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；
26)用TNT 按照 2 種熒光抗體Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效價 1 :200 同時稀釋這兩種熒光抗體，室溫孵育步驟25)中處理過的切片2-4小時；
27)用TNT洗滌步驟沈)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；28)將步驟27)中處理過的切片表片，封片。所述的步驟4)中的50. 0 ml乙?；菏怯杉尤? mol/L，pH值為8. 0的三乙醇胺 5.0 ml ；再加入最終體積百分比為0. 25%的純冰醋酸0. 125 ml用DEPC-Water定容到50. 0 ml即得，上述試劑的配制，能按比例擴大。所述的步驟7)中的雜交液是由以下5種試劑混合配成加入體積百分比為25% 的20 χ SSC ；再加入體積百分比為20%的濃度為10%的Blocking Reagent試劑；再加入體積百分比為50%的濃度為100%的去離子甲酰胺；再加入體積百分比為5%的濃度為1的 yV-Lauroylsarcosine溶液；再加入體積百分比為0. 1%的濃度為10%的SDS溶液；所述的20 X SSC為一種緩沖液；所述的SDS為十二烷基硫酸鈉。所述的步驟8)中的洗滌液由以下3種試劑組成分別是終濃度為2 χ SSC，終體積百分比為50%的100%離子甲酰胺和終濃度為0. 1%的Kauroylsarcosine溶液；在配制洗滌液的過程中使用超純水將上述試劑稀釋到終濃度。所述的步驟9)中的RNA緩沖液由以下3種試劑組成分別是終濃度為10 m mol/ L，pH值為8. 0的Tris-HCl ；終濃度為Im mol/L的EDTA ；終濃度為0. 5摩爾濃度的NaCl組成；在配制RNA緩沖液的過程中使用超純水將上述試劑稀釋到終濃度。所述的步驟18)中的反應液是由以下試劑混合配成在5 ml的0. 1 mol/L PB溶液中加入牛血清粉末0. 005g，再按1 1000的終濃度加入TSA-Biotin試劑5 μ 1，再按3ug/ml 的終濃度加入1. 0mg/ml的葡萄糖氧化酶15μ 1 ；上述試劑的配制，能按比例擴大；其中，所述的TSA-Biotin是一種絡氨酸和生物素結合的放大系統(tǒng)，其制備方法是首先溶解15mg Tyramine hydrochloride 于 300 ul 的 DMSO 中；再溶解 3. 5mg Biotin-NHS 于 36. 5 ul 的 DMSO中；然后將上述36. 5 ul的Tyramine溶液加入Biotin-NHS中，室溫避光孵育過夜；再加入1 / 10體積的一乙醇胺至上述混合液中，室溫放置4-5小時；將以上液體放于-20°C 保存?zhèn)溆?；所述的DMSO為二甲基亞砜。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明對建立模型后的活體動物進行灌注、取材、切片，通過生物素標記的探針與組織中的HiRNA發(fā)生特異性的結合，對組織中目標基因mRNA的定位、 表達差異變化進行熒光顯示，從而方便、準確的觀察到組織中目標基因mRNA水平的變化。 本發(fā)明使用了 TSA-Biotin的放大系統(tǒng)，在結合熒光素標記的抗體之前先將雜交信號進行級聯(lián)放大，克服了由于探針自身信號強弱不同導致的雜交信號檢測不理想的問題。本發(fā)明首次引入對兩種目標基因的探針的不同熒光標記、相應的雜交及檢測方法，為在同一樣本上檢測兩個不同基因的mRNA定位及表達差異提供了可能，極大地提升了熒光原位雜交的在活體組織檢測的應用范圍。


下面結合實施例和實施例附圖對本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。圖1是本發(fā)明實施例1的雜交效果對比圖，其中，A為A探針的雜交信號，B為B 探針的雜交信號，熒光原位雜交雙標可以同時顯示一個組織上的兩個不同基因的mRNA定位及表達差異；
圖2是本發(fā)明實施例2的雜交效果對比圖，其中，A熒光原位雜交技術單標，B熒光原位雜交技術雙標；A為C探針的雜交信號，B為B探針的雜交信號；熒光原位雜交雙標可以同時顯示一個組織上的兩個不同基因的mRNA定位及表達差異。
具體實施例方式
一種熒光原位雙雜交方法，它包括以下具體步驟是
I)用含有H2A終濃度為m的摩爾濃度為0.1 mol/L的DEPC-PB孵育切片1次，室溫， 10-15分鐘；所述的H2A終濃度為m，所述的0. lmol/L DEPC-PB是用磷酸氫二鈉29. 0 克，磷酸二氫鈉2. 9克，用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為0. 1%的DEPC Iml過夜放置后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述的切片為生物組織切片；
2)用摩爾濃度為0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步驟1)中處理過的切片1次，室溫， 10-20分鐘；
3)用含有TritonX-100終濃度為0. 3%的摩爾濃度為0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步驟2)中處理過的切片1次，室溫，10-15分鐘；所述的Triton X-100終濃度為0. 3% ；
4)50 ml的乙?；悍跤襟E3)中處理過的切片1次，室溫，10-15分鐘；
5)摩爾濃度為0.1 mol/L DEPC-PB孵育步驟4)中處理過的切片2次，室溫，各10 -15 分鐘；
6)在雜交液中孵育步驟5)中處理過的切片，此過程稱為預雜交，溫度為60°C，所需時間1-2小時；
7)在雜交液中加入DIG標記的探針，同時再加入FITC標記的探針，DIG標記的探針和 FITC標記的探針的終濃度為lug/ml，雜交過夜16-20小時，雜交溫度根據(jù)探針引物的退火
溫度來確定；
8)從步驟7)所述的雜交液中取出切片用洗滌液清洗2次，60°C，各20-30分鐘；
9)用RNA緩沖液孵育步驟8)中處理過的切片1次，370C，20-30分鐘；
10)用加入RNA酶的RNA緩沖液孵育步驟9)中處理過的切片，37°C，30-40分鐘；所述的RNA酶終濃度為20ug/ml ；
II)用2X SSC孵育步驟10)中處理過的切片2次，37°C，各20-30分鐘；
12)用0.2x SSC孵育步驟11)中處理過的切片2次，37°C，各20-30分鐘；
13)用TS7.5孵育步驟12)中處理過的切片1次，室溫，5-10分鐘；所述的TS7. 5是由摩爾濃度為0.1 mol /L Tris-HCl, PH 7.5，摩爾濃度為0.15 mol /L NaCl溶液用超純水配制而成；
14)用TBS封閉將步驟13)中處理過的片子封閉，室溫孵育1-2小時；所述的TBS:是由TS7. 5和體積百分比為1%的Blocking Reagent配制而成；
15)按1:200的抗體效價，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步驟14) 中處理過的切片，室溫，過夜；
16)用TNT于室溫洗滌步驟15)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；所述的 TNT:是由TS7. 5和體積百分比為0. 05% Tween20配制而成;
17)用摩爾濃度為0.1 mol/L的PB洗滌步驟16)中處理過的切片1次，室溫，10-15 分鐘；
18)TSA-Biotin反應，放大雜交信號①將步驟17)中處理過的切片加入反應液中，室溫，孵育10-15分鐘；
②在上述反應液中加入50ul的濃度為200mg/mlβ-D葡萄糖，于室溫孵育30分鐘；
19)用0.1 mol /L的PB洗滌步驟18)中處理過的切片，室溫，10-20分鐘；
20)在NaN3的終濃度為21的0.1 mol/L的PB中孵育步驟19)處理過的切片，室溫， 10-15分鐘；
21)用TNT洗滌步驟20)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；
22)按1 2000的抗體效價，用TBS稀釋Anti-Fluorescein-POD抗體，室溫孵育步驟21) 中處理過的切片，過夜；
23)用TNT洗滌步驟22)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；
24)TSA-DNP反應根據(jù)試劑盒的說明書操作，按照1 :50比例將TSA-DNP稀釋后孵育步驟23)中處理過的切片；
25)用TNT洗滌步驟中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；
26)用TNT 按照 2 種熒光抗體Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效價 1 :200 同時稀釋這兩種熒光抗體，室溫孵育步驟25)中處理過的切片2-4小時；
27)用TNT洗滌步驟沈)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；
28)將步驟27)中處理過的切片表片，封片。實施例1
1)用含有H2O2終濃度為H的摩爾濃度為0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育模型后的數(shù)張大鼠切片1次，室溫，10分鐘；所述的H2A終濃度為m，所述的0. lmol/L DEPC-PB 是用磷酸氫二鈉(Nei2HPO4. 12H20)四· 0克，磷酸二氫鈉(NaH2PO4. 2Η20) 2. 9克，用超純水定容至IL 后，再加入體積百分比為0. 1%的DEPC Iml過夜放置后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述的切片也可以是其它的生物組織切片；
2)用摩爾濃度為0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步驟1)中處理過的切片1次，室溫，10
分鐘；
3)用含有iTritonX-100終濃度為0. 3%的摩爾濃度為0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步驟2)中處理過的切片1次，室溫，10分鐘；所述的Triton X-100終濃度為0. 3% ；
4) 50 ml的乙?；悍跤襟E3)中處理過的切片1次，室溫，10分鐘；所述的50. 0 ml乙?；菏怯杉尤?摩爾濃度的pH值為8. 0的三乙醇胺5. 0 ml ；再加入體積百分比為 0. 25%的純冰醋酸0. 125 ml用DEPC-Water定容到50. 0 ml即得，上述試劑的配制，能按比例擴大。所述DEPC-Water是用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為0. 1%的DEPC Iml 過夜放置后，高壓滅菌制成的溶液。5)摩爾濃度為0. 1 mol/L DEPC-PB孵育步驟4)中處理過的切片2次，室溫，各10 分鐘；
6)在雜交液中孵育步驟5)中處理過的切片，此過程稱為預雜交，溫度為60°C，所需時間1小時；此過程在雜交爐中進行；
7)在雜交液中加入DIG標記的探針A，同時再加入FITC標記的探針B，DIG標記的探針和FITC標記的探針的終濃度為lug/ml，雜交過夜16-20小時，所述A和B探針所需的雜交溫度為58°C ；所述的A、B探針購自第四軍醫(yī)大學人體解剖與組織胚胎學教研室；所述的雜交液是由以下5種試劑混合配成加入體積百分比為25%的20 χ SSC;再加入體積百分比為20%的濃度為10%的Blocking Reagent試劑；再加入體積百分比為50%的濃度為 100%的去離子甲酰胺；再加入體積百分比為5%的濃度為的N-Lauroylsarcosine溶液； 再加入體積百分比為0. 1%的濃度為10%的SDS溶液。如配制IOml的雜交液需要加入20 χ SSC溶液2. 5 ml，加入10%的Blocking Reagent溶液2 ml，加入100%的去離子甲酰胺 5 ml，加入2%的N-Lauroylsarcosine溶液0. 5 ml最后再加入10%的SDS溶液10 ul共同混合配成雜交液，上述試劑的配制，能按比例擴大。所述溶液20 X SSC為一種緩沖液，購自 invitrogen公司；所述SDS為十二烷基硫酸鈉。8)從步驟7)所述的雜交液中取出切片用洗滌液清洗2次，60 °C，各20分鐘；所述的洗滌液由以下3種試劑組成分別是終濃度為2X SSC，終體積百分比為50%的100% 離子甲酰胺和終濃度為0. 1%的l-Lauroylsarcosine溶液；在配制洗滌液的過程中使用超純水將上述試劑稀釋到終濃度。如配制50 ml的洗滌液；需要加入20x SSC溶液5ml，加入 100%去離子甲酰胺25 ml，加入2%的N-Lauroylsarcosine溶液2. 5 ml最后加入12. 5 ml 的超純水定容至50ml。9)用RNA緩沖液孵育步驟8)中處理過的切片1次，37°C，20分鐘；所述的RNA緩沖液由以下3種試劑組成分別是終濃度為10 m mol/L的pH值為8. 0的Tris-HCl ；終濃度為Im mol/L的EDTA ；終濃度為0. 5 mol/L的NaCl組成；在配制RNA緩沖液的過程中使用超純水將上述試劑稀釋到終濃度。如配置50 ml的RNA緩沖液需要加入1 mol/L，pH值為 8. 0 的 iTris-HCl 溶液 0. 5 ml，加入 0.5 mol/L 的 EDTA 溶液 0. 1 ml，加入 1 mol/L 的 NaCl溶液25 ml最后加入24. 4 ml的超純水定容至50 ml。10)用加入RNA酶的RNA緩沖液孵育步驟9)中處理過的切片，條件37°C，30分鐘；所述的RNA酶終濃度為20ug/ml ；
11)用2X SSC孵育步驟10)中處理過的切片2次，37°C，各20-30分鐘；
12)用0.2x SSC孵育步驟11)中處理過的切片2次，37°C，各20-30分鐘；
13)用TS7.5孵育步驟12)中處理過的切片1次，室溫，5-10分鐘；所述的TS7. 5是由摩爾濃度為0. 1 mol /L Tris-HCl, PH 7.5，摩爾濃度為0. 15 mol /L NaCl溶液組成；如配制100 ml的TS7. 5 需要加入1 mol /L，PH值為7. 5的Tris-HCl溶液10 ml，加入1 mol/L的NaCl溶液15 ml最后加入75 ml的超純水定容至100ml。14)用TBS封閉將步驟13)中處理過的片子封閉，室溫孵育1_2小時；所述的TBS: 是由TS7. 5和體積百分比為1%的Blocking Reagent組成；如配制10 ml的TBS 需要加入已配好的 TS7.5 溶液 9 ml 和 10%Blocking Reagent 溶液 1ml。15)按1:200的抗體效價，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步驟 14)中處理過的切片，室溫，過夜；
16)用TNT于室溫洗滌步驟15)中處理過的切片2次，室溫，各10分鐘；所述的TNT: 是由TS7. 5和體積百分比為0. 05% Tween20用超純水配制而成；如配制100 ml的TNT 需要加入100%的Tween20試劑50 μ 1再加入已配好的TS7. 5 99. 95 ml定容至100 ml。17)用摩爾濃度為0. 1 mol/L的PB洗滌步驟16)中處理過的切片1次，室溫，10 分鐘；
18) TSA-Biotin反應，放大雜交信號①將步驟17)中處理過的切片加入反應液中，室溫，孵育10分鐘；
②在上述反應液中加入50ul的濃度為200mg/mlβ-D葡萄糖，于室溫孵育30分鐘； 所述的反應液是由以下試劑混合配成在5 ml的0.1 mol/L PB溶液中加入牛血
清粉末0. 005g,再按1 :1000的終濃度加入TSA-Biotin試劑5 μ 1，再按;3ug/ml的終濃度加入1. Omg/ml的葡萄糖氧化酶15 μ 1 ；上述試劑的配制，能按比例擴大；其中，所述的TSA-Biotin是一種絡氨酸和生物素結合的放大系統(tǒng)，其制備方法是首先溶解15mg Tyramine hydrochloride ψ 300 ul 白勺 DMSO ψ 角軍 3. 5mg Biotin-NHS ψ 36. 5 ul 白勺 DMSO中；然后將上述36. 5 ul的Tyramine溶液加入Biotin-NHS中，室溫避光孵育過夜；再加入1 / 10體積的一乙醇胺至上述混合液中，室溫放置4-5小時；將以上液體放于-20°C 保存?zhèn)溆?；所述的DMSO為二甲基亞砜。19)用摩爾濃度為0. 1 mol /L的PB洗滌步驟18)中處理過的切片，室溫，10分鐘；
20)在NaN3的終濃度為m的0. 1 mol/L PB中孵育步驟19)處理過的切片，室溫，10 分鐘。21)用TNT洗滌步驟20)中處理過的切片2次，室溫，各10分鐘；
22)按1 2000的抗體效價，用TBS稀釋Anti-Fluorescein-POD抗體，室溫孵育步驟21) 中處理過的切片，過夜；
23)用TNT洗滌步驟22)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；
M)TSA-DNP反應根據(jù)試劑盒的說明書操作，按照1 :50比例將TSA-DNP稀釋后孵育步驟23)中處理過的切片；
25)用TNT洗滌步驟24)中處理過的切片2次，室溫，各10分鐘；
26)用TNT 按照 2 種熒光抗體Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效價 1 :200 同時稀釋這兩種熒光抗體，室溫孵育步驟25)中處理過的切片4小時；
27)用TNT洗滌步驟沈)中處理過的切片2次，室溫，各10分鐘；
28)將步驟27)中處理過的切片表片，封片。 上述實施例
抗體 Anti-Digoxigenin-POD 是 Roche 公司，地址瑞士，貨號11207733910 ； 抗體 Anti-Fluorescein-POD 是 Roche 公司，地址瑞士，貨號11426346910 ； 抗體Alexa488-DNP是invitrogen公司，地址美國，貨號:A11094 ； 抗體 Mi^ptavidin - Cy3 是 invitrogen 公司，地址美國，貨號434315 ； TSA-DNP 是 Ambion 公司，地址美國，貨號NEL746A001KT ； 20 χ SSC為一種緩沖液，是invitrogen公司，地址美國，貨號15557-044 ； Blocking Reagent 是 Roche 公司，地址瑞士，貨號1096176 ； yV-Lauroylsarcosine 是 sigma-aldrich 公司，地址美國，貨號61739 ； Tyramine hydrochloride 是 sigma-aldrich 公司，地址美國，貨號T2879 ； Biotin-NHS 是 CALBL0CHEM 公司，地址德國，貨號203112。結果如圖1的雜交效果對比圖所示，A為A探針的雜交信號，B為B探針的雜交信號，熒光原位雜交雙標可以同時顯示一個組織上的兩個不同基因的mRNA定位及表達差異； 從圖中可以看出，本發(fā)明方法的優(yōu)點是可以同時顯示一個組織上的兩個不同基因的mRNA定位及表達差異。實施例2
1)用含有H2O2終濃度為洲的摩爾濃度為0.1mol/L的DEPC-PB孵育模型后的數(shù)張大鼠切片1次，室溫，10分鐘；所述的H2A終濃度為1，所述的0. lmol/L DEPC-PB是用磷酸氫二鈉(Na2HPO4. 12H20)29. 0克，磷酸二氫鈉(NaH2PO4. 2H20)2. 9克，用超純水定容至 IL后，再加入體積百分比為0. 1%的DEPC Iml過夜放置后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液； 所述的切片也可以是其它的生物組織切片；
2)用摩爾濃度為0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步驟1)中處理過的切片1次，室溫，10
分鐘；
3)用含有TritonX-100終濃度為0. 3%的摩爾濃度為0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步驟2)中處理過的切片1次，室溫，10分鐘；所述的Triton X-100終濃度為0. 3% ；
4)50 ml的乙?；悍跤襟E3)中處理過的切片1次，室溫，10分鐘；所述的50. 0 ml乙?；菏怯杉尤?摩爾濃度的pH值為8. 0的三乙醇胺5. 0 ml ；再加入體積百分比為 0. 25%的冰醋酸0. 125 ml用DEPC-Water定容到50. 0 ml即得，上述試劑的配制，能按比例擴大。所述DEPC-Water是用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為0. 1%的DEPC Iml 過夜放置后，高壓滅菌制成的溶液。5)摩爾濃度為0. 1 mol/L DEPC-PB孵育步驟4)中處理過的切片2次，室溫，各10 分鐘；
6)在雜交液中孵育步驟5)中處理過的切片，此過程稱為預雜交，溫度為60°C，所需時間1小時；此過程在雜交爐中進行；
7)在雜交液中加入DIG標記的探針C，同時再加入FITC標記的探針B，DIG標記的探針和FITC標記的探針的終濃度為lug/ml，雜交過夜16-20小時，所述C和B探針所需的雜交溫度為60V;所述的C、B探針購自第四軍醫(yī)大學人體解剖與組織胚胎學教研室；所述的雜交液是由以下5種試劑混合配成加入體積百分比為25%的20 χ SSC;再加入體積百分比為20%的濃度為10%的Blocking Reagent試劑；再加入體積百分比為50%的濃度為100% 的去離子甲酰胺；再加入體積百分比為5%的濃度為1的N-Lauroylsarcosine溶液；再加入體積百分比為0. 1%的濃度為10%的SDS溶液；20 X SSC為一種緩沖液，購自invitrogen 公司；所述SDS為十二烷基硫酸鈉。8)從步驟7)所述的雜交液中取出切片用洗滌液清洗2次，60 °C，各20分鐘；所述的洗滌液由以下3種試劑組成分別是終濃度為2 χ SSC，終濃度為50%去離子甲酰胺和終濃度為0. 1% N-Lauroylsarcosine溶液；在配制洗滌液的過程中使用超純水將上述試劑稀釋到終濃度。配置方法如實施例1。9)用RNA緩沖液孵育步驟8)中處理過的切片1次，37°C，20分鐘；所述的RNA緩沖液由以下3種試劑組成分別是終濃度為10 m mol/L，pH值為8. 0的Tris-HCl ；終濃度為Im mol/L的EDTA ；終濃度為0. 5mol/L的NaCl組成；在配制RNA緩沖液的過程中使用超純水將上述試劑稀釋到終濃度。配置方法如實施例1。10)用加入RNA酶的RNA緩沖液孵育步驟9)中處理過的切片，條件37°C，30分鐘； 所述的RNA酶終濃度為20ug/ml ；11)用2X SSC孵育步驟10)中處理過的切片2次，37°C，各20-30分鐘；
12)用0.2x SSC孵育步驟11)中處理過的切片2次，37°C，各20-30分鐘；
13)用TS7.5孵育步驟12)中處理過的切片1次，室溫，5-10分鐘；所述的TS7. 5是由摩爾濃度為0. 1 mol /L Tris-HCl, PH 7. 5，摩爾濃度為0. 15 mol /L NaCl溶液組成； 用超純水配制而成。配置方法如實施例1。14)用TBS封閉將步驟13)中處理過的片子封閉，室溫孵育1_2小時；所述的TBS: 是由TS7. 5和體積百分比為1%的Blocking Reagent組成。配置方法如實施例1。15)按1:200的抗體效價，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步驟 14)中處理過的切片，室溫，過夜；
16)用TNT于室溫洗滌步驟15)中處理過的切片2次，室溫，各10分鐘；所述的TNT: 是由TS7. 5和體積百分比為0. 05%的Tween20用超純水配制而成，配置方法如實施例1。17)用摩爾濃度為0. 1 mol/L的PB洗滌步驟16)中處理過的切片1次，室溫，10 分鐘；
18) TSA-Biotin反應，放大雜交信號
①將步驟17)中處理過的切片加入反應液中，室溫，孵育10分鐘；
②在上述反應液中加入50ul的濃度為200mg/mlβ-D葡萄糖，于室溫孵育30分鐘； 所述的反應液是由以下試劑混合配成在5 ml的0.1 mol/L PB溶液中加入牛血
清粉末0. 005g，再按1 :1000的終濃度加入TSA-Biotin試劑5 μ 1，再按;3ug/ml的終濃度加入1. 0mg/ml的葡萄糖氧化酶15μ 1 ；上述試劑的配制，能按比例擴大；其中，所述的TSA-Biotin是一種絡氨酸和生物素結合的放大系統(tǒng)，其制備方法是首先溶解15mg Tyramine hydrochloride 于 300 ul 的 DMSO 中；再溶解 3. 5mg Biotin-NHS 于 36. 5 ul 的 DMSO中；然后將上述36. 5 ul的Tyramine溶液加入Biotin-NHS中，室溫避光孵育過夜；再加入1 / 10體積的一乙醇胺至上述混合液中，室溫放置4-5小時；將以上液體放于-20°C 保存?zhèn)溆?；所述的DMSO為二甲基亞砜。19)用摩爾濃度為0. 1 mol /L的PB洗滌步驟18)中處理過的切片，室溫，10分鐘；
20)在NaN3的終濃度為m的0. 1 mol/L的PB中孵育步驟19)處理過的切片，室溫， 10分鐘。21)用TNT洗滌步驟20)中處理過的切片2次，室溫，各10分鐘；
22)按1 2000的抗體效價，用TBS稀釋Anti-Fluorescein-POD抗體，室溫孵育步驟21) 中處理過的切片，過夜；
23)用TNT洗滌步驟22)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；
M)TSA-DNP反應根據(jù)試劑盒的說明書操作，按照1 :50比例將TSA-DNP稀釋后孵育步驟23)中處理過的切片；
25)用TNT洗滌步驟24)中處理過的切片2次，室溫，各10分鐘；
26)用TNT 按照 2 種熒光抗體Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效價 1 :200 同時稀釋這兩種熒光抗體，室溫孵育步驟25)中處理過的切片4小時；
27)用TNT洗滌步驟沈)中處理過的切片2次，室溫，各10分鐘；
28)將步驟27)中處理過的切片表片，封片。
上述實施例中的
抗體 Anti-Digoxigenin-POD 是 Roche 公司，地址瑞士，貨號11207733910 ； 抗體 Anti-Fluorescein-POD 是 Roche 公司，地址瑞士，貨號11426346910 ； 抗體Alexa488-DNP是invitrogen公司，地址美國，貨號:A11094 ； 抗體 Mi^ptavidin - Cy3 是 invitrogen 公司，地址美國，貨號434315 ； TSA-DNP 是 Ambion 公司，地址美國，貨號NEL746A001KT ；
20 χ SSC為一種緩沖液，20x SSC是invitrogen公司，地址美國，貨號15557-044 ； Blocking Reagent 是 Roche 公司，地址瑞士，貨號1096176 ；
yV-Lauroylsarcosine 是 sigma-aldrich 公司，地址美國，貨號61739 ； Tyramine hydrochloride 是 sigma-aldrich 公司，地址美國，貨號T2879 ； Biotin-NHS 是 CALBL0CHEM 公司，地址德國，貨號203112。結果如圖2的雜交效果對比圖所示，A熒光原位雜交技術單標，B熒光原位雜交技術雙標；A為C探針的雜交信號，B為B探針的雜交信號；熒光原位雜交雙標可以同時顯示一個組織上的兩個不同基因的mRNA定位及表達差異。從圖中可以看出，本發(fā)明方法優(yōu)點是可以同時顯示一個組織上的兩個不同基因的mRNA定位及表達差異。
權利要求
1. 一種熒光原位雙雜交方法，其特征是它包括以下具體步驟是1)用含有H2A終濃度為m的摩爾濃度為0.1 mol/L的DEPC-PB孵育切片1次，室溫， 10-15分鐘；所述的H2A終濃度為m，所述的0. lmol/L DEPC-PB是用磷酸氫二鈉29. 0 克，磷酸二氫鈉2. 9克，用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為0. 1%的DEPC Iml過夜放置后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述的切片為生物組織切片；2)用摩爾濃度為0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步驟1)中處理過的切片1次，室溫，10-20 分鐘；3)用含有TritonX-100終濃度為0. 3%的摩爾濃度為0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步驟2)中處理過的切片1次，室溫，10-15分鐘；所述的Triton X-100終濃度為0. 3% ；4)50 ml的乙?；悍跤襟E3)中處理過的切片1次，室溫，10-15分鐘；5)摩爾濃度為0.1 mol/L DEPC-PB孵育步驟4)中處理過的切片2次，室溫，各10 -15 分鐘；6)在雜交液中孵育步驟5)中處理過的切片，此過程稱為預雜交，溫度為60°C，所需時間1-2小時；7)在雜交液中加入DIG標記的探針，同時再加入FITC標記的探針，DIG標記的探針和 FITC標記的探針的終濃度為lug/ml，雜交過夜16-20小時，雜交溫度根據(jù)探針引物的退火溫度來確定；8)從步驟7)所述的雜交液中取出切片用洗滌液清洗2次，60°C，各20-30分鐘；9)用RNA緩沖液孵育步驟8)中處理過的切片1次，370C，20-30分鐘；10)用加入RNA酶的RNA緩沖液孵育步驟9)中處理過的切片，37°C，30-40分鐘；所述的RNA酶終濃度為20ug/ml ；11)用2X SSC孵育步驟10)中處理過的切片2次，37°C，各20-30分鐘；12)用0.2x SSC孵育步驟11)中處理過的切片2次，37°C，各20-30分鐘；13)用TS7.5孵育步驟12)中處理過的切片1次，室溫，5-10分鐘；所述的TS7. 5是由摩爾濃度為0.1 mol /L Tris-HCl, PH 7.5，摩爾濃度為0.15 mol /L NaCl溶液用超純水配制而成；14)用TBS封閉將步驟13)中處理過的片子封閉，室溫孵育1-2小時；所述的TBS:是由TS7. 5和體積百分比為1%的Blocking Reagent配制而成；15)按1:200的抗體效價，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步驟14) 中處理過的切片，室溫，過夜；16)用TNT于室溫洗滌步驟15)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；所述的 TNT:是由TS7. 5和體積百分比為0. 05% Tween20配制而成；17)用摩爾濃度為0.1 mol/L的PB洗滌步驟16)中處理過的切片1次，室溫，10-15分鐘；18)TSA-Biotin反應，放大雜交信號①將步驟17)中處理過的切片加入反應液中，室溫，孵育10-15分鐘；②在上述反應液中加入50ul的濃度為200mg/mlβ-D葡萄糖，于室溫孵育30分鐘；19)用0.1 mol /L的PB洗滌步驟18)中處理過的切片，室溫，10-20分鐘；20)在NaN3的終濃度為的0.1 mol/L的PB中孵育步驟19)處理過的切片，室溫， 10-15分鐘；21)用TNT洗滌步驟20)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；22)按1 2000的抗體效價，用TBS稀釋Anti-Fluorescein-POD抗體，室溫孵育步驟21) 中處理過的切片，過夜；23)用TNT洗滌步驟22)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；24)TSA-DNP反應根據(jù)試劑盒的說明書操作，按照1 :50比例將TSA-DNP稀釋后孵育步驟23)中處理過的切片；25)用TNT洗滌步驟中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；26)用TNT 按照 2 種熒光抗體Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效價 1 :200 同時稀釋這兩種熒光抗體，室溫孵育步驟25)中處理過的切片2-4小時；27)用TNT洗滌步驟沈)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；28)將步驟27)中處理過的切片表片，封片。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種熒光原位雙雜交方法，其特征是所述的步驟4)中的 50. 0 ml乙?；菏怯杉尤? mol/L，pH值為8. 0的三乙醇胺5. 0 ml ；再加入最終體積百分比為0. 25%的純冰醋酸0. 125 ml用DEPC-Water定容到50. 0 ml即得，上述試劑的配制， 能按比例擴大。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種熒光原位雙雜交方法，其特征是所述的步驟7)中的雜交液是由以下5種試劑混合配成加入體積百分比為25%的20 χ SSC;再加入體積百分比為20%的濃度為10%的Blocking Reagent試劑；再加入體積百分比為50%的濃度為100% 的去離子甲酰胺；再加入體積百分比為5%的濃度為1的Kauroylsarcosine溶液；再加入體積百分比為0.1%的濃度為10%的SDS溶液；所述的20 X SSC為一種緩沖液；所述的 SDS為十二烷基硫酸鈉。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種熒光原位雙雜交方法，其特征是所述的步驟8)中的洗滌液由以下3種試劑組成分別是終濃度為2 χ SSC，終體積百分比為50%的100%離子甲酰胺和終濃度為0. 1%的#-Lauroylsarcosine溶液；在配制洗滌液的過程中使用超純水將上述試劑稀釋到終濃度。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種熒光原位雙雜交方法，其特征是所述的步驟9)中的 RNA緩沖液由以下3種試劑組成分別是終濃度為10 m mol/L, pH值為8. 0的Tris-HCl ； 終濃度為Im mol/L的EDTA ；終濃度為0. 5摩爾濃度的NaCl組成；在配制RNA緩沖液的過程中使用超純水將上述試劑稀釋到終濃度。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種熒光原位雙雜交方法，其特征是所述的步驟18)中的反應液是由以下試劑混合配成在5 ml的0. 1 mol/L PB溶液中加入牛血清粉末0. 005g, 再按1 :1000的終濃度加入TSA-Biotin試劑5 μ 1，再按;3ug/ml的終濃度加入1. 0mg/ml的葡萄糖氧化酶15μ 1 ；上述試劑的配制，能按比例擴大；其中，所述的TSA-Biotin是一種絡氨酸和生物素結合的放大系統(tǒng)，其制備方法是首先溶解15mg Tyramine hydrochloride于 300 ul 的 DMSO 中；再溶解 3. 5mg Biotin-NHS 于 36. 5 ul 的 DMSO 中；然后將上述 36. 5 ul 的Tyramine溶液加入Biotin-NHS中，室溫避光孵育過夜；再加入1 / 10體積的一乙醇胺至上述混合液中，室溫放置4-5小時；將以上液體放于-20°C保存?zhèn)溆?；所述的DMSO為二甲基亞砜。
全文摘要
本發(fā)明公開一種熒光原位雙雜交方法，它對建立模型后的活體動物進行灌注、取材、切片，通過生物素標記的探針與組織中的mRNA發(fā)生特異性的結合，對組織中目標基因mRNA的定位、表達差異變化進行熒光顯示，從而方便、準確的觀察到組織中目標基因mRNA水平的變化。
文檔編號C12Q1/68GK102321766SQ201110306469
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權日2011年9月16日
發(fā)明者李云慶, 武勝昔, 王文, 陳晶, 魏燕燕, 黃靜 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學