專利名稱：一種制備(r)-苯基乙二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物催化手性化合物不對(duì)稱合成的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種疏水離子液體介質(zhì)中綠豆環(huán)氧化物水解酶催化水解制備(R)-苯基乙二醇的方法。
背景技術(shù)：
由手性環(huán)氧化物立體選擇性開環(huán)水解得到的具有光學(xué)活性的環(huán)氧化合物和相對(duì)應(yīng)的鄰位二醇是精細(xì)有機(jī)合成中極為重要的手性中間體，經(jīng)過進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，可生成白三烯、 昆蟲信息素、留類物質(zhì)、愛滋病病毒蛋白酶抑制劑等眾多具有生物活性的化合物，在醫(yī)藥和農(nóng)藥等行業(yè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。用傳統(tǒng)的化學(xué)法合成具有光學(xué)活性的環(huán)氧化合物和鄰位二醇的反應(yīng)條件較為苛亥|J，難以得到高對(duì)映體純度的目的產(chǎn)物，而生物合成法是利用來源于動(dòng)物、植物及微生物的環(huán)氧化物水解酶(EHs)催化外消旋環(huán)氧化物立體選擇性水解來制得，因具有高效性、高對(duì)映體選擇性、反應(yīng)條件溫和及環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)而漸受青睞。近年來，來源于不同微生物(Bacillus alcalophilus， Sphingomonas echinoides， Acinetobacter baumannii， Fusarium proliferatum, Novosphingobium aromaticivorans 等)、植物(水序、大豆、土豆等)或動(dòng)物組織(老鼠、鴨肝臟等)的環(huán)氧化物水解酶催化外消旋環(huán)氧化合物不對(duì)稱水解的研究取得了較大的進(jìn)展。研究表明，利用來源于Rhodobacterales bacterium HTCC2654 和Botryosphaeria dothidea ZJUZQ007的環(huán)氧化物水解酶，可高立體選擇性地催化環(huán)氧化合物水解，產(chǎn)物的ee值可達(dá)到91% 99%，但產(chǎn)率低于43% (ffooj. H. , Kang J. H.， Hwang Y. 0.，et al. J. Biosci. Bioeng.，2010，109 539 ；Sheng Y. M.，Wei C.，Zhang Z. F.， et al. Appl. Biochem. Biotechnol. ,2011,164 125)。近年來，來源廣泛、價(jià)格低廉的綠豆環(huán)氧化物水解酶被用于合成對(duì)映體純手性鄰位二醇，表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，但只在水相中進(jìn)行該水解反應(yīng)，由于當(dāng)反應(yīng)在水相體系中進(jìn)行時(shí)，環(huán)氧化合物易發(fā)生非酶水解反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物的ee值下降；此外，一般情況下環(huán)氧化物在水相中的溶解性較差，反應(yīng)底物的濃度偏低，也會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)效率較低。水相中最適底物濃度僅為5mM，此時(shí)獲得(R)-苯基乙二醇的產(chǎn)率為47. 6%，對(duì)映體純度為92. 6%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種離子液中酶促制備 (R)-苯基乙二醇的方法。本發(fā)明利用綠豆環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧苯乙烯的高效不對(duì)稱水解制備高對(duì)映體純度的(R)-苯基乙二醇，該方法使用疏水離子液體和磷酸緩沖液的雙相體系作反應(yīng)介質(zhì)，對(duì)環(huán)境污染小，易從反應(yīng)混合體系中方便地分離出產(chǎn)物，能有效提高反應(yīng)底物濃度，抑制環(huán)氧化物的非酶水解并提高產(chǎn)物的對(duì)映體純度。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案如下一種制備(R)-苯基乙二醇的方法，包括如下步驟(1)配制疏水離子液體與磷酸緩沖液的雙相體系，所述磷酸緩沖液的濃度為50 lOOmol/L，所述離子液 體與磷酸緩沖液體積比2 1 1 10 ；在上述雙相體系中加入反應(yīng)底物環(huán)氧苯乙烯，使環(huán)氧苯乙烯在雙相體系中的濃度為5-250mol/L ；(2)在上述體系中加入酶量為0. 263 1. 053U/mL的綠豆環(huán)氧化物水解酶，調(diào)節(jié)體系PH值至6. 0 8. 0，在溫度為20 45°C，振蕩速度為160 260r/min條件下，進(jìn)行酶催化的水解反應(yīng)；(3)超濾除掉反應(yīng)混合物中的懸浮顆粒和酶，分離離子液體與磷酸緩沖液，在磷酸緩沖液中加入氯化鈉至飽和后用乙酸乙酯萃取，將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯后得到產(chǎn)物(R)-苯基乙二醇。優(yōu)選地，步驟(1)所述離子液體是1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(C4MIM -PF6)， 1-戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(C5MIM · PF6)，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽 (C6MIM -PF6)，1-庚基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(C7MIM -PF6)，1-乙基-3-甲基咪唑雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽(C2MIM · Tf2N)，1- 丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽(C4MIM · Tf2N)， N- 丁基-N-甲基吡咯烷雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽(Pyli4 -Tf2N)，N- 丁基-N-甲基哌啶雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽(PPli4 · Tf2N)和己基三丁基膦雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽(P6,4,4,4 · Tf2N)。優(yōu)選地，步驟(1)所述離子液體與磷酸緩沖液體積比1 4 1 8。優(yōu)選地，步驟(1)所述環(huán)氧苯乙烯在雙相體系中的濃度為lOmmol/L 120mmol/L。優(yōu)選地，所述反應(yīng)溫度為25 35°C，振蕩速度為200 240r/min，反應(yīng)時(shí)間8 40h。優(yōu)選地，所述pH為6. 5，溫度為35°C，振蕩速度為220r/min。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、反應(yīng)過程簡單易控、產(chǎn)物易分離；在反應(yīng)體系中，綠豆環(huán)氧化物水解酶能高效、高立體選擇性地催化環(huán)氧苯乙烯水解制備(R)-苯基乙二醇，有效地提高反應(yīng)體系中的底物濃度，并抑制底物的非酶水解，從而大大提高了產(chǎn)物的ee值；在最優(yōu)反應(yīng)條件下，底物濃度為IOOmM,獲得的(R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度97%以上，反應(yīng)效率遠(yuǎn)高于水單相體系(5mM，ee值92. 6% )。


圖1為實(shí)施例1制得產(chǎn)物的氣相色譜圖。圖2為實(shí)施例1制得產(chǎn)物的液相相色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，本發(fā)明的實(shí)施例不限如此。1、綠豆環(huán)氧化物水解酶的粗酶制備將IOOg綠豆，加到IL水中，浸泡12h，去皮晾干，加入液氮凍脆后，用粉碎機(jī)粉碎， 隨后在研缽中與少量石英砂一起研磨；在磨細(xì)的綠豆粉末中，緩慢加入300ml Tris-HCl緩沖液(50mmol/L,pH 7. 0)提取酶，攪拌(Ih)，離心(10000r/min, 4°C, 15min)取上清液，緩慢加入49. 2g預(yù)先磨細(xì)的硫酸銨，置于冰浴中攪拌(20min)，靜置30min后離心(15000r/min， 4°C,15min)，于上清液中繼續(xù)加入33. 2g硫酸銨，再次靜置30min后，離心(15000r/min, 4°C，15min)，得到淺黃色沉淀，將沉淀于_20°C預(yù)冷0. 5h后，抽真空至約0. 42Pa,冷凍12h，得到綠豆環(huán)氧化物水解酶的粗酶粉，置于4°C冰箱中保存待用。2、綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶中的蛋白質(zhì)含量及酶活力的測定采用考馬 斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量。測定酶活力時(shí)，取少量綠豆環(huán)氧化物水解酶的粗酶粉加入2ml含lOmmol/L底物環(huán)氧苯乙烯的磷酸鹽緩沖液(lOOmmol/L，pH 6. 5)中， 置于恒溫水浴振蕩器(35°C，220r/min)開始反應(yīng)，2min后取樣供高效液相色譜(HPLC)分析。根據(jù)HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)初速度，即可知酶的催化活力。在上述條件下，每分鐘催化環(huán)氧苯乙烯水解為1. 0 μ mol苯基乙二醇所需的酶量定義為一個(gè)活力單位(U)。實(shí)施例1在20mL具塞三角瓶中加入ImL C4MIM .PF6和6mL磷酸緩沖液(100mmol/L，pH 6. 5) 配成體積比為1 6的雙相體系，再加入79.8 4 1^環(huán)氧苯乙烯(10011111101/1)，和4.7仙的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)36h后，離心分離出離子液體與磷酸緩沖液，在磷酸緩沖液中加入氯化鈉至飽和后用乙酸乙酯萃取，將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯后得到產(chǎn)物(R)-苯基乙二醇。產(chǎn)物的檢測從緩沖液中取樣兩份，于其中一份加入2倍體積乙酸乙酯(含7. 7mmol/L對(duì)氯苯乙酮)以萃取產(chǎn)物，供GC分析產(chǎn)物ee值；另一樣品用甲醇/水(30 70, ν/ν)稀釋5倍，離心(10000r/min，IOmin)，取上清液供HPLC分析水相中產(chǎn)物苯基乙二醇的濃度。GC分析采用日本島津GC-2010型氣相色譜儀和 FID 檢測器，HP-Chiral 手性柱(0. 25mmX30m, 10% permethylatedβ -cyclodextrin, 美國惠普公司)。汽化室和檢測室溫度均為280°C，柱溫140°C，N2為載氣，流速1. 2mL/min ； 分流比1 50;進(jìn)樣量14 1。在上述條件下，環(huán)氧苯乙烯，對(duì)氯苯乙酮，(S)-苯基乙二醇和 (R)-苯基乙二醇的保留時(shí)間分別為3. 74，7. 17，19. 89和20. 46min。該分析結(jié)果的最大相對(duì)誤差小于1.0%。HPLC分析采用美國Agilent 1100型高效液相色譜儀，配備G1311A四元泵、可變波長紫外檢測器，ZORBAX Extend-C18分析型色譜柱(φ 4. 6mmX 1250mmX δ 5 μ m, Agilent)。流動(dòng)相為甲醇/水(30 70，ν/ν)，流速為0. 5mL/min ；檢測波長256nm ；進(jìn)樣量 20 μ L0在上述條件下，苯基乙二醇的保留時(shí)間為14. 4min，得到(R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為97%以上對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為49. 4%。實(shí)施例2在20mL具塞三角瓶中加入ImL C4MIM .PF6和6mL磷酸緩沖液(100mmol/L，pH 6. 5) 配成體積比為1 6的雙相體系，再加入15.96 4 1^環(huán)氧苯乙烯(20讓01/1)，和4.7仙的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)12h后，得到 (R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為96. 6%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為49. 5%。實(shí)施例3在20mL具塞三角瓶中加入ImL C4MIM .PF6和6mL磷酸緩沖液(100mmol/L，pH 7. 0) 配成體積比為1 6的雙相體系，再加入15.96 4 1^環(huán)氧苯乙烯(20讓01/1)，和4.7仙的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)12h后，得到 (R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為96. 3%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為49. 2%。實(shí)施例4在20mL具塞三角瓶中加入ImL C4MIM .PF6和8mL磷酸緩沖液(100mmol/L，pH 6. 5) 配成體積比為1 8的雙相體系，再加入20.52μL環(huán)氧苯乙烯(20mmol/L)，和6.32U的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)8h后，得到(R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為92. 4%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為48. 6%。實(shí)施例5
在IOOOmL具塞三角瓶中加入IOOmL C4MIM · PF6和600mL磷酸緩沖液(IOOmmol/ L，pH 6.5)配成體積比為1 6的雙相體系，再加入7980 μ L環(huán)氧苯乙烯(100mmol/L)，和 474U的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)14h 后，得到(R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為96%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為48. 9%。實(shí)施例6在20mL具塞三角瓶中加入ImL C5MIM .PF6和6mL磷酸緩沖液(100mmol/L，pH 6. 5) 配成體積比為1 6的雙相體系，再加入15.96 4 1^環(huán)氧苯乙烯(20讓01/1)，和4.7仙的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)12h后，得到 (R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為94. 3%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為49. 1%。實(shí)施例7在20mL具塞三角瓶中加入ImL C6MIM .PF6和6mL磷酸緩沖液(100mmol/L，pH 6. 5) 配成體積比為1 6的雙相體系，再加入15.96 4 1^環(huán)氧苯乙烯(20讓01/1)，和4.7仙的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)12h后，得到 (R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為92. 2%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為48. 3%。實(shí)施例8在20mL具塞三角瓶中加入含ImL C7MIM · PF6和6mL磷酸緩沖液(1 OOmmol/L，pH 6. 5)配成體積比為1 6的雙相體系，再加入15. 96 μ L環(huán)氧苯乙烯(20mmol/L)，和4. 74U 的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)12h后， 得到(R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為90. 的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為48%。實(shí)施例9在20mL具塞三角瓶中加入ImL C2MIM · Tf2N和6mL磷酸緩沖液(1 OOmmol/L，pH 6. 5)配成體積比為1 6的雙相體系，再加入15. 96 μ L環(huán)氧苯乙烯(20mmol/L)，和4. 74U 的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)8h后，得到(R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為92. 4%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為44. 3%。實(shí)施例10在20mL具塞三角瓶中加入ImL C4MIM · Tf2N和6mL磷酸緩沖液(1 OOmmol/L，pH 6. 5)配成體積比為1 6的雙相體系，再加入15. 96 μ L環(huán)氧苯乙烯(20mmol/L)，和4. 74U 的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)12h后， 得到(R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為90. 6%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為49. 2%。實(shí)施例11在20mL具塞三角瓶中加入 ImL Pylj4 .Tf2N* 6mL磷酸緩沖液(100mmol/L，pH 6. 5) 配成體積比為1 6的雙相體系，再加入15.96 4 1^環(huán)氧苯乙烯(20讓01/1)，和4.7仙的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)8h后，得到 (R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為94. 7%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為45. 5%。實(shí)施例12在20mL具塞三角瓶中加入 ImL PP1,46mL磷酸緩沖液(100mmol/L，pH 6. 5) 配成體積比為1 6的雙相體系，再加入15.96 4 1^環(huán)氧苯乙烯(20讓01/1)，和4.7仙的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)8h后，得到 (R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為90. 8%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為43. 9%。實(shí)施例13在20mL具塞三角瓶中 加入ImL P6j4j4j4. Tf2N和6mL磷酸緩沖液(100mmol/L，pH 6. 5)配成體積比為1 6的雙相體系，再加入15. 96 μ L環(huán)氧苯乙烯(20mmol/L)，和4. 74U 的綠豆環(huán)氧化物水解酶粗酶粉，置于35°C的水浴振蕩器(220r/min)中反應(yīng)。反應(yīng)8h后，得到(R)-苯基乙二醇對(duì)映體純度為90. 2%的對(duì)映體過量值ee，產(chǎn)率為34. 7%。
權(quán)利要求
1.一種制備(R)-苯基乙二醇的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)配制疏水離子液體與磷酸緩沖液的雙相體系，所述磷酸緩沖液的濃度為50 lOOmol/L，所述離子液體與磷酸緩沖液體積比2 1 1 10 ；在上述雙相體系中加入反應(yīng)底物環(huán)氧苯乙烯，使環(huán)氧苯乙烯在雙相體系中的濃度為5-250mol/L ；(2)在上述體系中加入酶量為0.263 1. 053U/mL的綠豆環(huán)氧化物水解酶，調(diào)節(jié)體系 PH值至6. 0 8. 0，在溫度為20 45°C，振蕩速度為160 260r/min條件下，進(jìn)行酶催化的水解反應(yīng)；(3)超濾除掉反應(yīng)混合物中的懸浮顆粒和酶，分離離子液體與磷酸緩沖液，在磷酸緩沖液中加入氯化鈉至飽和后用乙酸乙酯萃取，將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯后得到產(chǎn)物 (R)-苯基乙二醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，1-戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽， 1-庚基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，1-乙基-3-甲基咪唑雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽，1- 丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽，N- 丁基-N-甲基吡咯烷雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽， N- 丁基-N-甲基哌啶雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽或己基三丁基膦雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述離子液體與磷酸緩沖液體積比1 4 1 8。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述環(huán)氧苯乙烯在雙相體系中的濃度為 10mmol/L 120mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)溫度為25 35°C，振蕩速度為 200 240r/min,反應(yīng)時(shí)間8 40h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述pH為6.5，溫度為35°C，振蕩速度為 220r/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備(R)-苯基乙二醇的方法，包括如下步驟(1)配制疏水離子液體與磷酸緩沖液的雙相體系，在雙相體系中加入反應(yīng)底物環(huán)氧苯乙烯；(2)在上述體系中加入綠豆環(huán)氧化物水解酶，調(diào)節(jié)體系pH值至6.0～8.0，在溫度為20～45℃，振蕩速度為160～260r/min條件下，進(jìn)行酶催化的水解反應(yīng)；(3)超濾除掉反應(yīng)混合物中的懸浮顆粒和酶，分離離子液體與磷酸緩沖液，在磷酸緩沖液中分離得到產(chǎn)物(R)-苯基乙二醇。本發(fā)明中反應(yīng)的底物濃度高達(dá)100mM，得到(R)-苯基乙二醇產(chǎn)物的對(duì)映體純度為90％以上ee，其產(chǎn)物的對(duì)映體純和收率均得到提高。
文檔編號(hào)C12P7/22GK102329823SQ20111031122
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者吳虹, 婁文勇, 宗敏華, 陳文靜 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)