專利名稱：諸葛菜染色體乙酸地衣紅顯帶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及諸葛菜染色體顯帶方法。
背景技術(shù)：
染色體分帶技術(shù)是鑒別染色體和研究染色體結(jié)構(gòu)變異的常規(guī)而經(jīng)典的技術(shù)。它是將染色體經(jīng)過(guò)一定程序的處理，并用特定的染料染色后，使染色體在其長(zhǎng)軸上顯示出一個(gè)個(gè)明暗交替或深淺不同的橫紋，這樣的橫紋就叫做染色體的帶。分帶技術(shù)能夠揭示染色體的 “解剖學(xué)”特征，可以顯示出真核生物每一條染色體的特異帶型，提供豐富的可用于識(shí)別的染色體的特殊標(biāo)記，這為識(shí)別和分析每條染色體提供了必要的條件，因而可以比常規(guī)核型分析方法更準(zhǔn)確地鑒別染色體。染色體帶紋的多樣性、雜合性等反映了染色體本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，以及種下變異、物種分化和形成的遺傳機(jī)制。通過(guò)對(duì)顯帶機(jī)理的深入研究，可以對(duì)染色體的成分、結(jié)構(gòu)、功能和行為等進(jìn)行更深入的了解，從而找出生物染色體帶型變化的規(guī)律，這對(duì)于從細(xì)胞和分子水平真正揭示生物進(jìn)化的遺傳機(jī)理具有重要意義，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)而達(dá)到人工控制和改造生物遺傳、變異的目的。染色體顯帶技術(shù)是用染料對(duì)染色體進(jìn)行分化染色的方法，將染色體經(jīng)酸、堿、溫度等處理后再以染料染色，或單用某些熒光染料染色就可以觀察到深淺不同或亮暗不同的帶紋的縱向結(jié)構(gòu)。在植物染色體顯帶上最常用的是Giemsa分帶技術(shù)，其中常用的有C 一帶、 G 一帶和N —帶等。C 一帶在植物中分布較廣，在染色體末端、中端、著絲點(diǎn)兩側(cè)、核仁縊痕處都可能出現(xiàn)，而且準(zhǔn)確性較高，是植物分帶的主要方法，已廣泛應(yīng)用與植物細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、植物分類(lèi)學(xué)、物種起源、染色體工程、植物育種等方面的研究。目前常用的方法如下
1.材料準(zhǔn)備待洋蔥鱗莖發(fā)根長(zhǎng)2cm左右，蠶豆種子浸種發(fā)芽，待幼根長(zhǎng)至3cm左右，切取根尖進(jìn)行預(yù)處理。蠶豆主根根尖切去后繼續(xù)長(zhǎng)出的次生根，可再切取次生根根尖進(jìn)行預(yù)處理。大麥種子發(fā)芽至幼根長(zhǎng)Icm左右，切取白色的幼根進(jìn)行預(yù)處理。2.預(yù)處理根尖在0。05%秋水仙堿溶液中預(yù)處理2 3h。處理溫度一般為 25°C。預(yù)處理后須用清水沖洗多次，洗去藥液。3.固定以上各材料經(jīng)預(yù)處理后，放入卡諾氏固定液中固定0.5 24h，轉(zhuǎn)換到 70%酒精，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?.解離根尖在0. IN鹽酸溶液中置于60°C恒溫下處理10 15min。大麥根尖在37°C下用果膠酶處理30min，然后在0. IN鹽酸溶液中置于60°C下處理5min。上述材料用酸處理后，須用蒸餾水沖洗多次，除去殘留酸液，否則將會(huì)影響染色體的顯帶效果。5.壓片與常規(guī)的植物染色體壓片方法相同。在45%醋酸中壓片，制成白片。 在相差顯微鏡下檢查染色體分散程度，挑選出分裂相多，染色體分散均勻的片子。選出的玻片經(jīng)液氮、C02干冰或半導(dǎo)體致冷器凍結(jié)，用刀片揭開(kāi)蓋玻片。置室溫下干燥。6.空氣干燥脫水后的染色體標(biāo)本一般需經(jīng)過(guò)4 7天的空氣干燥，再進(jìn)行分帶處理。不同的材料所需干燥的時(shí)間不一樣。洋蔥要求空氣干燥的時(shí)間較嚴(yán)，未經(jīng)空氣干燥的染色體不顯帶，干燥一周后經(jīng)顯帶處理顯示末端帶，干燥半個(gè)月后能同時(shí)顯示末端帶和著絲點(diǎn)帶。而蠶豆、黑麥、大麥則要求干燥時(shí)間不十分嚴(yán)格。7.顯帶處理空氣干燥后的染色體標(biāo)本即可進(jìn)行顯帶處理。處理方法不同，可顯示不同的帶型。(I)C 帶 HSG 法(Hydrochloric acid Saline Giemsa method)將空氣干燥后的染色體標(biāo)本浸入0. 2N鹽酸(25°C左右)分別處理30和60min。用蒸餾水沖洗多次后，在60°C的2XSSC溶液中保溫30min，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，室溫風(fēng)干，即可染色。BSG法(Barium Saline Giesa method):將空氣干燥后的染色體標(biāo)本浸入盛有新配制的5%氫氧化鋇飽和液的染色缸中，在室溫條件下處理5 lOmin，然后用蒸餾水小心地多次沖洗浮垢后，在60°C的2 X SSC溶液中保溫60min，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，室溫風(fēng)干，即可染色。2)N帶將黑麥、大麥種子發(fā)根Icm左右切取，在0°C冰水中預(yù)處理24h?？ㄖZ氏固定液中固定半小時(shí)以上，醋酸洋紅染色液中染色2h，然后在45%醋酸中壓片，冰凍法揭開(kāi)。爾后在45%醋酸60°C條件下脫色lOmin，再在95%酒精室溫下脫水lOmin，氣干過(guò)夜。最后在IM NaH2P04溶液中95°C恒溫下保溫2min，蒸餾水沖洗，氣干后即可染色。8.吉姆薩染色吉姆薩母液用1/15M磷酸緩沖液按一定的比例稀釋。例如，10 份磷酸緩沖液加1份吉姆薩母液稀釋即為10 :1，一般都采用扣染法染色。在一干凈的玻璃板上，對(duì)稱放置兩根牙簽或火柴棒，距離與載玻片上的材料范圍相等。將帶有材料的玻片翻轉(zhuǎn)向下，放在牙簽上，然后沿載玻片一邊向載玻片與玻璃板之間的空隙內(nèi)緩緩滴入染色液， 在室溫下染色。染色時(shí)間因材料而異，因吉姆薩染料批號(hào)不同、質(zhì)量上有差異，因此其染色液濃度和染色時(shí)間需作適當(dāng)調(diào)整。9.鏡檢和封片染色后的玻片標(biāo)本，用蒸餾水洗去多余染料，染色過(guò)深可用磷酸緩沖液脫色。室溫下風(fēng)干后即可鏡檢，挑選染色體帶型清晰的片子，用樹(shù)膠墊片。上述的方法取材步驟用于小染色體的諸葛菜不能滿足顯帶效果，顯帶成功率低， 預(yù)處理使用秋水仙素，有毒，污染環(huán)境。解離后壓片，然后進(jìn)行顯帶處理，才能染色呈現(xiàn)帶紋，操作步驟很多，不確定性增加，顯帶成功率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種程序簡(jiǎn)單，步驟少，所用試劑少，操作簡(jiǎn)便，顯帶成功率高，適用于小染色體植物諸葛菜染色體的乙酸地衣紅顯帶方法。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明諸葛菜染色體乙酸地衣紅顯帶方法，包括以下步驟
(1)取材將種子用溫水浸泡6 12h，然后換入600mg/L的赤霉素溶液中放入4°C冰箱中20—25小時(shí)，然后將種子在培養(yǎng)皿中22—23°C發(fā)芽，避光.種子萌動(dòng)后，再將種子放入4°C冰箱中20— 25小時(shí)，取出放回22— 23°C溫室發(fā)芽，待根長(zhǎng)至1 一2cm時(shí)，截取根尖分生組織；
(2)預(yù)處理將根尖分生組織經(jīng)冰水0—1°C處理23— 24小時(shí)；
(3)固定用卡諾氏液I對(duì)根尖分生組織在4°C固定23—25小時(shí)，卡諾氏液I配方無(wú)水酒精冰醋酸=3:1，體積比;
(4)解離將根尖分生組織放入預(yù)熱到60°C的lmol/LHCl解離，解離時(shí)間為8分鐘，(5)染色，將根尖分生組織放入乙酸地衣紅染色液中，地衣紅在乙酸溶液中的質(zhì)量百分濃度為0. 1%，20— 26°C保持12—24小時(shí)；
(6)將根尖分生組織用蒸餾水洗后用體積百分濃度為45%的乙酸壓片。本發(fā)明方法中的取材和預(yù)處理步驟；結(jié)合了各種浸種方法的優(yōu)點(diǎn)，使之適合于諸葛菜的種子萌發(fā)，并但不污染環(huán)境，染色體顯帶處理在染色過(guò)程中一并進(jìn)行，不用分開(kāi)處理，乙酸可以起到顯帶處理作用，而地衣紅染料也同時(shí)染色，程序得到簡(jiǎn)化，減少了在操作中的很多步驟；因此避免了許多的影響因素，如每一步的操作誤差，每一個(gè)步驟的溫度、時(shí)間等不確定性的影響，因而顯帶成功率提高。比如傳統(tǒng)方法中的空氣干燥，干燥時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)顯帶影響很大，有些植物對(duì)干燥時(shí)間要求很?chē)?yán)格，不好掌握。又如在壓片后冰凍揭蓋片時(shí)， 容易把染色體一同隨蓋片揭掉，造成染色體丟失。在顯帶處理中，所用的酸或堿等試劑的處理時(shí)間也很難撐握，長(zhǎng)了，短了都不能顯帶。因而傳統(tǒng)方法因步驟太多，所用試劑也多，要求嚴(yán)格，影響因素眾多，成功率太低。本發(fā)明程序簡(jiǎn)單，步驟和所用試劑少，受操作和試劑的影響較小，因而顯帶成功率高。傳統(tǒng)方法用吉姆薩染色的時(shí)間也因材料而異，染料批號(hào)不同、質(zhì)量上有差異，因此其染色液濃度和染色時(shí)間不好撐握。用乙酸地衣紅染色時(shí)間容易撐握，操作簡(jiǎn)單，易染色。本發(fā)明所用鹽酸與背景技術(shù)鹽酸無(wú)差異，只是解離時(shí)間的差別，因?yàn)橹参锓N類(lèi)不同，解離時(shí)間不同，本發(fā)明離解時(shí)間8分種只對(duì)諸葛菜合適，為最佳離解時(shí)間。本發(fā)明公開(kāi)的植物小染色體顯帶方法適用于諸葛菜等小染色體植物。在本發(fā)明中種子的取材和預(yù)處理方法在傳統(tǒng)方法上進(jìn)行了優(yōu)化，用溫水浸泡、GA3 (赤霉素)催芽，然后在4度冰箱中春化，當(dāng)種子萌動(dòng)露白時(shí)又春化一次，長(zhǎng)度種子根長(zhǎng)至1 2 c m時(shí)，截取根尖，過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)則根尖分生細(xì)胞較少。截取的根尖用冰水處理23— 24小時(shí)，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則染色體濃縮程度高，不容易顯帶，過(guò)短則處于有絲分裂中期的染色體較少且多數(shù)還未形成合適顯帶的染色體形狀。實(shí)驗(yàn)表明，按本發(fā)明的取材和預(yù)處理方法則種子的發(fā)芽時(shí)間較整齊，且出芽質(zhì)量好，根分裂旺盛，處于有絲分裂中期的細(xì)胞較多，染色體形狀較好，適于顯帶操作。在本發(fā)明的植物小染色體顯帶方法中，諸葛菜根尖細(xì)胞通過(guò)60°C的lmol/L HCl 中八分鐘的解離，使細(xì)胞壓片容易分開(kāi)，染色體分散程度好，易識(shí)別無(wú)重疊。如解離時(shí)間過(guò)短，則細(xì)胞不容易壓開(kāi)，染色體重疊無(wú)法識(shí)別；如解離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則細(xì)胞破裂，染色體易丟失。根尖細(xì)胞解離后用乙酸地衣紅中常溫染色過(guò)夜，方法簡(jiǎn)單，效果好，沒(méi)用傳統(tǒng)方法那么多復(fù)雜的程序，避免了諸多因素對(duì)染色體顯帶的影響。染色后用45%的乙酸常規(guī)壓片，用普通光學(xué)顯微鏡鏡檢即可觀察到紫紅色的帶紋。本發(fā)明的顯帶方法，操作容易，簡(jiǎn)便、高效、實(shí)用，是一種新穎的植物小染色體顯帶方法，并同樣適合于其他大染色體植物的顯帶分析，具有重要的科研價(jià)值。 本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，其優(yōu)點(diǎn)及效果可進(jìn)一步概括為
1、本發(fā)明提供的植物小染色體乙酸地衣紅顯帶方法，其取材和預(yù)處理方法使種子的發(fā)芽時(shí)間較整齊，且出芽質(zhì)量好，根分裂旺盛，處于有絲分裂中期的細(xì)胞較多，染色體形狀較好，適于諸葛菜等植物的顯帶操作。傳統(tǒng)方法對(duì)于諸葛菜的效果不理想。2、采用本發(fā)明提供的植物小染色體乙酸地衣紅顯帶方法，其解離時(shí)間對(duì)于諸葛菜恰到好處的掌握，使其細(xì)胞壓片容易分開(kāi)，染色體分散程度好，易識(shí)別無(wú)重疊。
3、本發(fā)明提供的植物小染色體乙酸地衣紅顯帶方法，用乙酸地衣紅常溫染色過(guò)夜，經(jīng)乙酸常規(guī)壓片，用普通光學(xué)顯微鏡鏡檢即可觀察到紫紅色的帶紋。該染色方法簡(jiǎn)單， 成功率高，顯帶效果好，沒(méi)用傳統(tǒng)方法那么多復(fù)雜的程序，避免了諸多因素對(duì)染色體顯帶的影響。4、本發(fā)明提供的植物小染色體乙酸地衣紅顯帶方法，適用性廣，既可適用于小染色體植物，如諸葛菜、油菜，也適用于大染色體植物，只需改變解離時(shí)間和取材方法即可，染色和其它方法不變。所用藥品都為常規(guī)試劑，價(jià)格便宜，易得。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的具體描述。有必要指出的是，以下的實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)熟悉人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容，對(duì)本發(fā)明做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，應(yīng)仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。發(fā)明人將本發(fā)明諸葛菜染色體顯帶的用于諸葛菜染色體顯帶的實(shí)驗(yàn)，目前都已經(jīng)取得了良好效果。具體實(shí)施方法
1 )取材。取種子在溫水中浸泡8h，然后換入600mg/L的赤霉素溶液中放于4°C冰箱中 24h。然后將種子在培養(yǎng)皿中22°C發(fā)芽，放于墊有蒸餾水潤(rùn)濕的濾紙上，避光。當(dāng)種子萌動(dòng)時(shí)再將種子放入4°C冰箱24h，然后再取出，放回22°C溫室。待根長(zhǎng)至1 2cm時(shí)，截取根尖分生組織。2)預(yù)處理。植物根尖分生組織經(jīng)0— 1°C冰水處理23h后，用卡諾氏液I (無(wú)水酒精冰醋酸=3 1)對(duì)材料4°C固定24h左右。3)解離。將材料放入預(yù)熱60°C的lmol/ L HCl中解離，解離時(shí)間為八分鐘。4)染色。將材料放入質(zhì)量百分濃度為0.1%的乙酸地衣紅染色液中常溫染色24h。5)染色體壓片。用蒸餾水水洗后用45%的乙酸常規(guī)壓片，鏡檢。2、顯帶效果
諸葛菜染色體分散良好，帶紋清晰，染色體特征易識(shí)別，有利于進(jìn)一步遺傳分析。
權(quán)利要求
1.諸葛菜染色體乙酸地衣紅顯帶方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取材將種子用溫水浸泡6 12h，然后換入600mg/L的赤霉素溶液中放入4°C冰箱中20—25小時(shí)，然后將種子在培養(yǎng)皿中22—23°C發(fā)芽，避光.種子萌動(dòng)后，再將種子放入4°C冰箱中20— 25小時(shí)，取出放回22— 23°C溫室發(fā)芽，待根長(zhǎng)至1 一2cm時(shí)，切取根尖分生組織，(2)預(yù)處理將根尖分生組織經(jīng)0—1°C冰水處理23—24小時(shí)；(3)固定用卡諾氏液I對(duì)根尖分生組織在4°C固定23—25小時(shí)，卡諾氏液I配方無(wú)水酒精冰醋酸=3:1，體積比;(4)解離將根尖分生組織放入預(yù)熱到60°C的lmol/LHCl解離，解離時(shí)間為8分鐘，(5)染色，將根尖分生組織放入乙酸地衣紅染色液中，地衣紅在乙酸溶液中的質(zhì)量百分濃度為0. 1%，20— 26°C保持12—24小時(shí)；(6)將根尖分生組織用蒸餾水洗后用體積百分濃度為45%的乙酸壓片。
全文摘要
本發(fā)明為諸葛菜染色體乙酸地衣紅顯帶方法，解決傳統(tǒng)染色體分離顯帶方法不適于小染色體植物諸葛菜，程序復(fù)雜，操作條件不易掌握，顯帶成功率低的問(wèn)題。本發(fā)明采用乙酸地衣紅進(jìn)行染色，結(jié)合染色體制備方法，可使細(xì)胞染色體容易分離，染色體經(jīng)輕壓后形態(tài)良好，帶型顯示清晰，利于目標(biāo)染色體的識(shí)別。采用本發(fā)明提供的植物染色體顯帶方法非常簡(jiǎn)便，操作容易，尤其適合染色體小的植物帶型分析，所顯帶型清晰，成功率高，便于植物的遺傳分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102329878SQ20111031152
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者馮雷, 周麗蓉, 陳文清 申請(qǐng)人:四川大學(xué)