專利名稱：一種用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器。
背景技術(shù)：
目前檢測銅離子的主要方法是光譜法，包括原子光譜法、分子吸收光譜法、熒光光譜法，還有電化學(xué)分析法和化學(xué)傳感方法等。原子光譜法應(yīng)用廣泛，檢測準(zhǔn)確，但需要大型儀器，需要專業(yè)技術(shù)人員的操作，前處理麻煩。近年來化學(xué)傳感方法因其極高的靈敏度被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，其中也包括了重金屬的檢測。但是目前使用的這些方法均涉及到熒光基團(tuán)的使用，熒光基團(tuán)容易淬滅，不易保存，且檢測時(shí)需要使用到熒光檢測儀，限制了其應(yīng) 用范圍。近年來，納米材料的發(fā)展為解決這一問題提供了新的思路。納米金顆粒具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)、電學(xué)性質(zhì)、化學(xué)活性和生物兼容性，在生物領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。研究表明，納米金溶液的顏色與納米金顆粒的間距以及納米金聚集體的大小有關(guān)。納米金顆粒的間距若明顯超過其平均直徑，納米金呈分散狀態(tài)，宏觀上表現(xiàn)為紅色；該間距若小于平均直徑，則納米金易團(tuán)聚，呈聚集態(tài)，宏觀上表現(xiàn)為紫色到藍(lán)色。利用納米金的這種性質(zhì)，可設(shè)計(jì)一系列生化反應(yīng)以改變納米金顆粒間的距離，從而實(shí)現(xiàn)對靶物質(zhì)的檢測。2007年，Lu等利用依賴銅離子的核酸酶，在核酸酶上標(biāo)記熒光基團(tuán)，在其互補(bǔ)的底物序列上標(biāo)記淬滅基團(tuán)，當(dāng)銅離子不存在時(shí)，沒有熒光；當(dāng)銅離子存在時(shí)，核酸酶切割其互補(bǔ)的底物序列，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，出現(xiàn)熒光，其靈敏度的線性范圍從35nM到20 PM。同年，White等合成了一段具有銅離子特異性的多肽片段(Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly)，同樣通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，來檢測銅離子的存在，其檢測靈敏度為32y g/L。但是這些方法均牽涉到熒光基團(tuán)的使用，熒光基團(tuán)容易淬滅，不易保存，且檢測時(shí)候需要使用到熒光檢測儀，檢測成本仍然較高，限制其應(yīng)用范圍。因此，一種能快速檢測、不需要儀器使用且靈敏度高的檢測方法會極大的滿足市場的需求。此發(fā)明正致力于此。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有Cu2+檢測技術(shù)存在的問題和不足，提供一種用于Cu2+快速檢測的新工具，即核酸納米金生物傳感器，利用Cu2+存在時(shí)，針對銅離子的特異的核酸酶能夠切斷與他互補(bǔ)的底物這一原理，配合膠體金放大系統(tǒng)，用來檢測溶液中Cu2+的存在。并提供該核酸納米金生物傳感器的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)原理是結(jié)合有第三段序列的膠體金噴布在金標(biāo)墊上，用鏈霉親和素和標(biāo)記有生物素的第四段序列反應(yīng)后，劃在硝酸纖維素膜上形成檢測線；用鏈霉親和素和標(biāo)記有生物素的第五段序列反應(yīng)后，劃在硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線。首先將核酸酶和底物以一定比例混合，然后將待測樣品加入其中，反應(yīng)。如果待測樣品中含有銅離子，則核酸酶會切斷與其互補(bǔ)的底物序列，釋放出圖I中綠色和紫紅色標(biāo)記的序列部分，這段序列首先經(jīng)過金標(biāo)墊，與膠體金顆粒上標(biāo)記的第三段核酸序列發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)，然后經(jīng)過檢測線，同樣與檢測線上標(biāo)記的第四段核酸序列發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)，膠體金顆粒停留在檢測線上，從而使得檢測線顯紅色；繼續(xù)經(jīng)過質(zhì)控線，剩余沒有反應(yīng)的膠體金顆粒，其上標(biāo)記的序列與質(zhì)控線上標(biāo)記的第五段核酸序列發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)，使得質(zhì)控線顯紅色，為陽性結(jié)果。(圖3)如果待測樣品中沒有銅離子，則核酸酶不會切斷其互補(bǔ)的底物序列，上樣后，由于底物序列被與其互補(bǔ)的酶序列所占據(jù)，則不會與膠體金顆粒上標(biāo)記的序列發(fā)生反應(yīng)，檢測線不顯色，但膠體金顆粒上標(biāo)記的序列仍然能與質(zhì)控線上的序列發(fā)生反應(yīng)，質(zhì)控線顯紅色，為陰性結(jié)果。如果質(zhì)控線不顯色，不管檢測線顯色與否，都說明生物傳感器本身出現(xiàn)了問題，結(jié)果不可信，無效結(jié)果。(圖3)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)原理，設(shè)計(jì)的五段核酸序列是
第一段為銅離子特異性的核酸酶序列，含有35個(gè)堿基(SEQ ID NO: I)，第14-35個(gè)堿基形成一個(gè)回文結(jié)構(gòu)；
第二段為其互補(bǔ)的底物序列，包含48個(gè)堿基(SEQ ID N0:2)，5’端與酶完全互補(bǔ)，3’端比酶序列長，為一段單鏈片段，互補(bǔ)序列含有一個(gè)脫氧核糖核苷酸G，它是酶活性的關(guān)鍵部位，酶切位點(diǎn)就位于其5’端；
第三和第四段序列為檢測序列，其中第三段序列用于膠體金標(biāo)記，序列為(5’ -SH-SEQID N0:3-3’)；第四段序列標(biāo)記在檢測線上，序列為(5，- biotin- SEQ ID NO:4 -3，)，底物在未酶切條件下不能與其它兩段序列形成夾心結(jié)構(gòu)，而酶切后互補(bǔ)片段變短則能被第三段序列置換形成夾心。這兩段序列分別與被酶切后長片段的兩端互補(bǔ)(即圖I中綠色和紫紅色部分)；
第五段序列為質(zhì)控序列。標(biāo)記在質(zhì)控線上，它與膠體金顆粒上標(biāo)記的第三段序列互補(bǔ)，用于檢測生物傳感器的穩(wěn)定性。其序列為(5’ - SEQ ID N0:5-biotin-3，)。本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記的核酸序列3，該核酸序列是由巰基修飾并與膠體金偶聯(lián)形成的，所述硝酸纖維素膜上有質(zhì)控線和檢測線，質(zhì)控線上固定有核酸序列5，該核酸序列與膠體金顆粒上標(biāo)記的第三段序列互補(bǔ)，用生物素標(biāo)記并與鏈霉親和素反應(yīng)后，固定與硝酸纖維素膜上的，用于檢測生物傳感器的穩(wěn)定性。檢測線上固定有核酸序列4，底物在未酶切條件下不能與其它兩端序列形成夾心結(jié)構(gòu)，而酶切后互補(bǔ)片段變短則能被第三段序列置換形成夾心。生物素標(biāo)記的核酸序列4與鏈霉親和素反應(yīng)后，固定在硝酸纖維素膜上形成檢測線。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明巧妙的把膠體金放大系統(tǒng)和針對銅離子的特異的核酸酶結(jié)合起來，設(shè)計(jì)出了一種高靈敏度、低費(fèi)用、不需要使用任何儀器的膠體金試紙條生物傳感器。既解決了以往檢測方法中需要大型儀器的缺陷，又能保證檢測靈敏度，而且制備簡便、檢測迅速，不需要專業(yè)的技術(shù)人員。


圖I銅離子特異性的核酸酶及其底物； 圖2試紙條整體結(jié)構(gòu)方案；
圖3試紙條檢測樣品效果圖；圖4本發(fā)明所述核酸納米金生物傳感器檢測銅離子的實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線 圖5本發(fā)明所述核酸納米金生物傳感器檢測銅離子的靈敏度結(jié)果圖； 圖6本發(fā)明所述核酸納米金生物傳感器檢測銅離子的特異性結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I核酸納米金生物傳感器的制備
I、五種核酸序列的設(shè)計(jì)
在已有Cu2+依賴酶活性DNAzyme的基礎(chǔ)上，對其互補(bǔ)鏈也就是底物的5’進(jìn)行延伸，以用于酶切后核酸夾心的檢測(見圖I)。具體設(shè)計(jì)序列SEQ ID N0:l 5。2.納米金(膠體金)的制備
向250ml的圓底燒瓶中稱取IOOg O. 01%的HAuCL4溶液，磁力攪拌加熱至沸騰；然后向上述溶液中迅速加入4ml 1%的檸檬酸三鈉，溶液變?yōu)榧t色后，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，停止加熱繼續(xù)攪拌直至冷卻；膠體金溶液4°C避光保存，納米金通過520nm最大吸光度值鑒定。3. 金標(biāo)核酸的制備
用ΙΟΟμΙ去離子水溶解IOD核酸序列3，加入到Iml 5倍體積濃縮的膠體金溶液中，40C 24小時(shí)；1%的牛血清白蛋白封閉30分鐘后，加入NaCl和1%的SDS’分別至終濃度為O. 15Μ和O. 01%, 40C過夜，11500轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄上清，沉底用500ul重懸液(20mM Na3PO4, 5% BSA, O. 25% Tween,和10%蔗糖)重懸，重復(fù)洗三遍后用200ul的重懸液重新懸浮，制成懸浮液。4.樣品墊的處理
玻璃纖維浸泡含有pH9. 0,4. 0% TritonX-100、IOOmM 硼酸、3%PEG4000、1%BSA、2%蔗糖，
0.1% SDS，50. OnM競爭 DNA 探針(SEQ ID NO:6), O. 5ug/ml 鮭魚精 DNA 的溶液后，37°C烘干備用。5.金標(biāo)墊的制備
將本發(fā)明制備的金標(biāo)核酸序列3涂于玻璃纖維上，37°C干燥2個(gè)小時(shí)，制成金標(biāo)墊，備用。6.硝酸纖維素膜上質(zhì)控線和檢測線的處理
用去離子水溶解IOD的核酸序列5，使其濃度為ΙΟΟμΜ，取15μ1 ΙΟΟμΜ的核酸序列5，加入15μ1 (lmg/ml)鏈和親霉素，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，采用劃膜噴金儀涂于硝酸纖維素膜質(zhì)控線上，37°C干燥兩個(gè)小時(shí)。用去離子水溶解10D的核酸序列4，使其濃度為ΙΟΟμΜ,取15μ1 ΙΟΟμΜ的核酸序列4，加入15μ1 (lmg/ml)鏈和親霉素，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，采用劃膜噴金儀涂于硝酸纖維素膜檢測線上，37°C干燥兩個(gè)小時(shí)。7.膠體金試紙條的組裝
將固定有寡核苷酸探針的硝酸纖維素膜、吸水紙、涂有納米微粒標(biāo)記寡核苷酸探針的玻璃纖維、樣品墊依次固定于膠板上，相鄰部分彼此重疊2mm，經(jīng)切割成寬4mm后即得到本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器。質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)
(I)C線(質(zhì)控線)出現(xiàn)紅色的線證明納米金生物傳感器有效。
(2) T線(檢測線)出現(xiàn)紅色的線與否，是陽性陰性判別的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
(1)C線出現(xiàn)紅色的線，同時(shí)T線出現(xiàn)紅色的線，說明被檢樣品中Cu2+含量超標(biāo)；
(2)C線出現(xiàn)紅色的線，同時(shí)T線沒有出現(xiàn)紅色的線，說明被檢樣品中Cu2+含量沒有超
標(biāo)；
(3)C線沒有出現(xiàn)紅色的線，說明納米金生物傳感器失效。實(shí)施例2前述核酸納米金生物傳感器的質(zhì)量控制與檢測效果
采用實(shí)施例I所制成的核酸納米金生物傳感器，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其檢測效果。
I.配制銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度，濃度分別為100. O μΜ, 10. O μ Μ, I. O μ Μ,100. O ηΜ, 50. O ηΜ, 10. O ηΜ, O. O ηΜ，室溫保存。2.配制 20. 0μ M 的 Hg2+, Mn2+, Cd2+, Pb2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ba2+, Ca2+,Ni2+，Co2+溶液。3. ￠(2. OyL 100.0 μ M 核酸酶、10. O μ L 100. O μ M 酶底物和 190. O μ L 4Χ SSC(ρΗ7. 4)于EP管中，混勻，70°C水浴鍋加熱2分鐘，置于溫水中緩慢冷卻，此時(shí)核酸酶和酶底物的濃度分別為I. O μ M和5. O μ M ;
然后取10. Oy L上述反應(yīng)溶液與90. Oy L 8 X SSC (ρΗ7. 4)混合，使得核酸酶和酶底物的終濃度分別為100. O ηΜ和500. O ηΜ。分別將15. O μ L工作液和15. O μ L不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合，使得核酸酶和酶底物的終濃度分別為50. O ηΜ和250. O ηΜ,緩沖液濃度為4X SSC (ρΗ7. 4)，室溫反應(yīng)30分鐘。4.將配置的上樣溶液滴在樣品墊上，室溫；10分鐘后觀察質(zhì)控線和檢測線的顏色變化。結(jié)果顯示最低檢測線可以達(dá)到10. O ηΜ，遠(yuǎn)超過美國環(huán)保署對于飲用水中銅離子的最高含量(20μΜ)的標(biāo)準(zhǔn)。在Cu2+存在的條件下，檢測線均顯出肉眼可見的紅色，并且，隨著Cu2+濃度的增加，檢測線的顏色也逐漸加深，用金標(biāo)試紙條讀數(shù)儀的結(jié)果也一致，隨著Cu2+濃度的增加，檢測線的曲線也逐漸增大，質(zhì)控線顯色。在Cu2+存在的條件下，核酸酶特異性的切開其互補(bǔ)的底物序列，產(chǎn)生待檢測的單鏈核酸序列，從而與膠體金上標(biāo)記的第三段序列和檢測線上劃的第四段序列形成夾心結(jié)構(gòu)，使檢測線顯紅色。并且，Cu2+的濃度越高，核酸酶的效率越快，切斷的底物序列也隨之增加，使得檢測線的顏色也逐漸加深。同時(shí)，質(zhì)控線也呈現(xiàn)均一的紅色，說明生物傳感器的體系正常，結(jié)果可信。5.分別將15. O μ L工作液和15. O μ L不同離子的標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合，使得核酸酶和酶底物的終濃度分別為50. O ηΜ和250. O ηΜ,緩沖液濃度為4X SSC (ρΗ7. 4)，室溫反應(yīng)30分鐘。上述反應(yīng)溶液滴在樣品墊上，室溫；10分鐘后觀察質(zhì)控線和檢測線的顏色變化。結(jié)果顯示在20. O μ M的條件下，只有Cu2+的檢測線顯出肉眼可見的紅色，Co2+有微弱的紅色，其它 Hg2+，Mn2+，Cd2+，Pb2+，Mg2+，Zn2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Ba2+，Ca2+，Ni2+均不顯色。圖中左邊是實(shí)物拍攝圖，右邊是用傳感器讀卡儀讀出來的相對應(yīng)的曲線圖。該結(jié)果顯示出了此生物傳感器有著良好的特異性。只有在Cu2+存在的條件下，核酸酶才能特異性的切開其互補(bǔ)的底物序列，產(chǎn)生待檢測的單鏈核酸序列，從而與膠體金上標(biāo)記的第三段序列和檢測線上劃的第四段序列形成夾心結(jié)構(gòu)，使檢測線顯紅色。同時(shí)，質(zhì)控線也呈現(xiàn)均一的紅色，說明生物傳感器的體系正常，結(jié)果可信。權(quán)利要求
1.一種用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于包括兩部分 (1)用于檢測銅離子的核酸納米金生物試紙條，由從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙組成； (2)上樣緩沖液體系，由核酸序列SEQID NO T2和核酸雜交液組成； 其中，所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記的核酸序列，如SEQ ID N0:3所示； 所述硝酸纖維素膜上有質(zhì)控線和檢測線，質(zhì)控線上固定有用生物素標(biāo)記并與鏈霉親和素反應(yīng)后的核酸序列，如SEQ ID NO :5所示；所述檢測線上固定有用生物素標(biāo)記并與鏈霉親和素反應(yīng)后的核酸序列，如SEQ ID NO 4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述SEQ ID NO :3的5’端用巰基修飾，所述SEQ ID NO :4的5’端和SEQ ID NO :5的3’端用生物素修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述質(zhì)控線和檢測線之間的距離為3 10mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙兩兩之間的相鄰部分彼此重疊f5mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述膠體金的粒徑為8 lOOnm。
6.權(quán)利要求f5中任意一條權(quán)利要求所述用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器的制備方法，其特征在于所述納米金標(biāo)記核酸序列的方法是 (1)納米金的制備選用粒徑為flOOnm的膠體金顆粒，膠體金采用常規(guī)的氯金酸煮沸還原法制備，通過控制還原劑的量在0. oro. 05%以及攪拌速度在100(T50000rpm之間來控制顆粒粒徑； (2)納米金與核酸序列的偶聯(lián)與封閉老化將巰基修飾的核酸序列加入到1-10倍體積濃縮的納米金溶液中，混合標(biāo)記l_48h，用牛血清白蛋白或PEG封閉多余的活性位點(diǎn)，其后加入氯化鈉和SDS使其終濃度分別至0. 15M和0. 01%，老化5 30h后，800(Tl6000rpm離心.2(T60min,棄上清，即獲得納米金標(biāo)記的核酸探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的中任意一條權(quán)利要求所述用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器的制備方法，其特征在于所述樣品墊是經(jīng)過以下處理的采用含表面活性劑、電中性或堿性緩沖液、PEG4000、BSA和蔗糖的混合液浸泡玻璃纖維4h后，37°C烘干過夜。
8.權(quán)利要求1飛中任意一條權(quán)利要求所述核酸納米金生物傳感器的使用方法，其特征在于是將上樣緩沖液體系滴在樣品墊上，如果待測樣品中含有銅離子，則核酸酶會切斷與其互補(bǔ)的底物序列，釋放出相應(yīng)的序列，這序列首先會經(jīng)過樣品墊，與膠體金顆粒上標(biāo)記的核酸序列發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)，然后經(jīng)過檢測線，同樣與檢測線上標(biāo)記的第四段核酸序列發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)，膠體金顆粒停留在檢測線上，從而使得檢測線顯紅色；反應(yīng)物繼續(xù)經(jīng)過質(zhì)控線，剩余沒有反應(yīng)的膠體金顆粒，其上標(biāo)記的序列與質(zhì)控線上標(biāo)記的核酸序列發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)，使得質(zhì)控線顯紅色，為陽性結(jié)果； 如果待測樣品中沒有銅離子，則核酸酶不會切斷其互補(bǔ)的底物序列，上樣后，由于底物序列被與其互補(bǔ)的酶序列占據(jù)，不會與膠體金顆粒上標(biāo)記的序列發(fā)生反應(yīng)，檢測線不顯色，但膠體金顆粒上標(biāo)記的序列仍然能與質(zhì)控線上的序列發(fā)生反應(yīng)，質(zhì)控線顯紅色，為陰性結(jié)果; 如果質(zhì)控線不顯色，不管檢測線顯色與否，為無效結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器。本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器是通過銅離子存在時(shí)，針對銅離子的特異的核酸酶能夠切斷與它互補(bǔ)的底物這一原理，配合膠體金放大系統(tǒng)，用于檢測銅離子。本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器具有高靈敏度、低費(fèi)用、不需要使用任何儀器的優(yōu)點(diǎn)，既解決了以往檢測方法中需要大型儀器的缺陷，又能保證檢測靈敏度，而且制備簡便，檢測迅速，不需要專業(yè)的技術(shù)人員。
文檔編號C12Q1/68GK102634571SQ20111031411
公開日2012年8月15日 申請日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者張文娟, 方志遠(yuǎn), 曾令文, 黃婧 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院