專利名稱：一種使接穗品種獲得病毒抗性的方法及rna干擾載體與轉基因方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物轉基因技術及其應用，特別是一種使番茄接穗品種獲得病毒抗性的方法及RNA干擾載體與轉基因方法。
背景技術：
植物病毒是導致果樹、蔬菜、花卉等園藝植物產(chǎn)量下降和品質變劣的重要原因，在農業(yè)生產(chǎn)中病毒病是僅次于真菌的第二大類病害，由于防治困難，素有“植物癌癥”之稱。目前植物病毒常用的防治措施有消滅病毒源和傳統(tǒng)媒介、應用脫毒技術、藥劑防治與選育抗病品種等，其中選育抗病品種是防治病毒病害最有效、最經(jīng)濟的方法。RNA干擾技術為基礎的植物抗病技術因其高效性、特異性等特點，在植物抗病毒育種上展現(xiàn)了可觀的前景。

基因沉默或稱RNA干擾(RNA interference ；RNAi)是指由于轉基因序列或外侵病毒與被沉默的內源或外源基因序列具有高度的同源性，其轉錄產(chǎn)物形成雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)結構,從而特異性地降解同源祀基因mRNA,使之發(fā)生沉默(Fire A. ,Xu S. ,Montgomery Μ. Κ. ,et al. Potent and specific genetic interferenceby double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]. Nature,1998,391 (6669)806-811)。由于其干擾作用是發(fā)生在靶基因的轉錄后水平，因此，也成轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing ;PTGS)。植物 RNAi 具有特異性、高效性、系統(tǒng)性以及可遺傳性等特點?？衫肦NAi技術進行基因功能研究；或直接利用RNAi創(chuàng)造的特殊性狀變異體進行植物改良。其中RNAi技術在植物病毒抗性方面取得了很好的研究成果。RNAi是真核生物中普遍存在的外源核酸(如病毒)入侵的防御機制，同時現(xiàn)有研究進ー步表明病毒產(chǎn)生交叉保護是由于誘導病毒(弱株系)所產(chǎn)生的RNA沉默降解了具有致病性的同源病韋(強株系)的結果(Frank G. R. , Stuart A. M. and David C. B. Gene Silencingwithout DNA :RNA-Mediated Cross-Protection between Viruses[J]. Plant Cell,1999，
11:1207-1216)。利用RNAi抵抗病毒的常用策略是選擇一段植物病毒基因的序列，以反向重復序列的方式構建成轉錄后含發(fā)夾結構的雙鏈RNA(hairpin RNA, hpRNA)或含內含子的ihpRNA(intron-hairpin RNA)表達載體,通過基因槍、病毒載體轉染或者農桿菌介導轉化整合到植物基因上，體內表達dsRNA，直接或間接誘導RNAi的產(chǎn)生，起到抵抗病毒的目的。而在發(fā)夾結構研究中，認為ihpRNA表達載體比hpRNA表達載體沉默效率高(Helliwellし，Waterhouse P. Constructs and methods ior high—througnput gene silencing inplants [J] · Methods，2003，30(4) :289-295)。園藝植物種類與品種繁多，通過營養(yǎng)繁殖途徑繁衍的園藝植物后代普遍經(jīng)受著病毒的威脅。目前生產(chǎn)中栽培的眾多蔬菜，水果和花卉均有幾十到上百個品種，幾乎每個品種都有數(shù)種到數(shù)十種病毒病害，病毒病抑制了植物的生長、結果，降低了果品的產(chǎn)量、質量，甚至引起死樹，植物一旦被病毒侵染，將終生帶毒持久受害。利用基因工程技術針對每ー個品種進行改良，提高其抗病毒的能力，雖可行但需花費大量的人力與財力。嫁接是許多園藝植物繁殖的方法之一，絕大多數(shù)的果樹和部分蔬菜采用嫁接繁殖。嫁接既能保持接穗品種的優(yōu)良性狀，又能利用砧木的有利特性。在應用嫁接繁殖時，一般同一種類中的不同品種采用同一站木，甚至有些同屬中的不同種類也米用同一站木。這樣ー站多用的情況，使得改良石占木品種比單獨改良接穗品種要高效的多。所謂植物系統(tǒng)性基因沉默是指dsRNA、aberrant RNA或siRNA等基因沉默信號既可以通過胞間連絲進行的短距離傳遞，也可以通過植物中的維管系統(tǒng)長距離傳遞(BiOsnanC. A. , Mitter N. , Cnristie M. , et al. Nuclear gene silencing directs reception oflong-distance mRNA silencing in Arabidopsis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(37) 14741-14746), (Kalantidis K. , Schumacher H. T. , Alexiadis T., et al. RNAsilencing movement in plants [J]. Biol Cell, 2008,100 (I) : 13-26),并誘導整個植物產(chǎn)生系統(tǒng)沉默。Daniel H.等(Daniel H. C, Fabio T. S. ,Miya D. H, et al. Pattern formationvia small RNA mobility [J]. Genes & Dev, 2009, 23 :549-554)研究表明小分子 RNA 可以作為ー種移動的信號分子參與植物發(fā)育的調控。關于沉默信號在植物中的傳遞方向存在著不同的報道。Palauqui 等(Palauqui J. C. , Elmayan T. , Pollien J. M. , et al. Systemicacquired silencing transgene-speciiic post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non—silenced scionslJJ · EMBO J,1997,16(15) :4738-4745.)以煙草為試材，發(fā)現(xiàn)PTGS的傳導是單方向的，即只能從沉默的石占木傳向非沉默的接穗；而 Sonoda 等(Sonoda S. and Nishiguchi M. Graft transmissionof post-transcriptional gene silencing target specificity for RNA degradationis transmissible between silenced and non-silenced plants, but not betweensilenced plants [J]. Plant J, 2000, 21 (I) :1_8)研究表明，PTGS 的傳導是雙方向的，從砧木到接穗或從接穗到砧木都可傳導，但是PTGS從接穗到砧木的傳導效率明顯低于從砧木到接穗的傳導。李明等(李明，姜世玲，王幼群，等.轉錄后沉默信號可以在擬南芥嫁接體內快速雙向傳遞[J].科學通報，2006，51 (2) =142-147)的結果表明，無論用RNAi型植株作為砧木或接穗，基因沉默信號均能導致相應野生型接穗或砧木中靶基因mRNA的減少，說明基因轉錄后沉默信號可以通過嫁接面在擬南芥體內雙向傳遞。但miRNA(micro RNA)或amiRNA (artificial mi RNA)還未發(fā)現(xiàn)能在嫁接體間傳遞,據(jù)此,本發(fā)明人推測系統(tǒng)性基因沉默方向可能與物種或檢測水平或方法有夫，但可以肯定以轉基因方式獲得超表達的siRNA相關的沉默信號能從砧木向上傳遞給接穂。植物中，關于系統(tǒng)性基因沉默的最初線索來自煙草嫁接試驗。1997年PalauquiΦ (Palauqui J. C. , Elmayan T., Pollien J. Μ. , et al. Systemic acquired silencing transgene-speciiic post-transcriptional silencing is transmitted by graftingfrom silenced stocks to non-silenced scions [J]. EMBO J，1997，16(15) :4738-4745)把一個芽嫁接到另ー植株上時，先將該植株的硝酸鹽還原酶基因沉默，嫁接的幼芽上該基因也沉默。在幼芽中被沉默的基因與砧木中被沉默的基因相同，具有序列特異性。Sonoda等(bonoda b.and Nishigucni M. waft transmission of post-transcriptional genesilencing target specificity for RNA degradation is transmissible betweensilenced and non-silenced plants, but not between silenced plants lJ」· PlantJ, 2000, 21 (I) l-8)的研究也得出了相似的的結論，并同時證明經(jīng)嫁接后，接穗所獲得的PTGS即使在沉默的砧木不存在時也能保持。近年來，圍繞轉基因生物育種，我國在轉基因生物安全管理和安全性評價研究方面實現(xiàn)了與國際接軌，并取得了令人矚目的進展。但有關基因工程中所涉及的抗性選擇性標記基因對食品安全性的影響，部分人一直存有疑慮，而本項目研究巧妙的避開了這ー議題，因為接穗所獲得的系統(tǒng)性抗性，來源于砧木中的小分子RNA的沉默效應，因此理論上，嫁接轉基因沉默植株接穗品種中將不含抗性標記。為了提高接穗品種抗目標病毒的能力，若只需通過改良砧木，嫁接后達到增強接穗品種抗該目標病毒的目的，這將為園藝嫁接植物的品種改良開辟一條嶄新的途徑。但到目前為止，通過嫁接方式使接穗品種獲得基因沉默效應的研究中，靶標基因都為植物自身的ー些基因，未見到以致病菌或病毒基因為靶標的研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明根據(jù)上述領域的空白及需求，提供一種使番茄植株獲得抵御病毒能力的方法，以及該方法涉及到RNA干擾載體，改進的轉基因方法等，該方法獲得的抗病毒植株能夠有效規(guī)避轉基因食品的安全隱患，且能夠大大提高了獲得抗病毒轉基因品種的效率。 ー種使接穗品種獲得病毒抗性的方法，其步驟如下(I)制備抗病毒的轉基因砧木；(2)使接穗嫁接到所述轉基因砧木上生長發(fā)育；其特征在于所述抗病毒的轉基因砧木為轉入RNA干擾載體而獲得，所述RNA干擾載體的靶標序列為目標病毒基因組內的基因片段。所述目標病毒指黃瓜花葉病毒CMV，所述接穗品種和轉基因砧木都為番茄品種，所述RNA干擾載體的祀標序列如Seq ID No. I, 2, 3,4, 5或6所示。所述RNA 干擾載體為 pCAMBIA2300-lA、pCAMBIA2300_2A、pCAMBIA2300_2B、PCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300_CP 或 pCAMBIA2300_CMV5。所述制備抗病毒的轉基因砧木，轉基因包括如下步驟(I).番茄播種，(2).切子葉預培養(yǎng)，(3).抑菌篩選培養(yǎng)根瘤農桿菌工程菌侵染后的子葉，(4).促分化培養(yǎng)，(5).生根培養(yǎng)，其特征在于所述番茄的種子播種前經(jīng)無菌水浸潤5 8小時；20%次氯酸鈉滅菌lOmin，無菌水洗5次，毎次5min ;30°C培養(yǎng)箱催芽兩天；所述切子葉預培養(yǎng)，是在真葉未出現(xiàn)前切取子葉進行預培養(yǎng)；所述抑菌篩選培養(yǎng)被根瘤農桿菌侵染并暗培養(yǎng)2天的子葉，培養(yǎng)基C中pH6. O,Medium Base+2mg/L反式玉米素核苷+200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素，葉背朝上光照培養(yǎng)，IOd轉接一次，直至出現(xiàn)綠色愈傷或芽點；將帶芽點的外植體轉入培養(yǎng)基Cl中pH6. O,Medium Base+lmg/L反式玉米素核苷+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美汀中培養(yǎng)10 14d，待分化出芽；所述促分化培養(yǎng)抑菌培養(yǎng)中篩選到的抗性芽轉入到培養(yǎng)基C3中pH 6.0，Medium Base+0. 5mg/L反式玉米素核苷+1. 5mg/L 3-卩引哚こ酸+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美??；所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. O, Medium Base+2mg/LIBA+200mg/L特美汀。
ー種以黃瓜花葉病毒基因為靶標的的RNA干擾載體，其特征在于，所述RNA干擾載體的祀標序列如Seq ID No. I, 2, 3,4, 5或6所示。所述RNA 干擾載體為 pCAMBIA2300-lA、pCAMBIA2300_2A、pCAMBIA2300_2B、PCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300_CP 或 pCAMBIA2300_CMV5。轉化有上述RNA干擾載體的菌株或植物細胞。所述菌株指根癌農桿菌菌株EHA105。所述植物細胞指轉基因番茄砧木的外植體前體細胞。ー種制備轉基因番茄砧木的方法，包括如下步驟(I).番茄播種，(2).切子葉預培養(yǎng)，(3).抑菌篩選培養(yǎng)根瘤農桿菌工程菌侵染后的子葉，(4).促分化培養(yǎng)，(5).生根培養(yǎng)，其特征在于 所述番茄的種子播種前經(jīng)無菌水浸潤5 8小時；20%次氯酸鈉滅菌lOmin，無菌水洗5次，毎次5min ;30°C培養(yǎng)箱催芽兩天；所述切子葉預培養(yǎng)，是在真葉未出現(xiàn)前切取子葉進行預培養(yǎng)；所述抑菌篩選培養(yǎng)被根瘤農桿菌侵染并暗培養(yǎng)2天的子葉，培養(yǎng)基C中pH6. O,Medium Base+2mg/L反式玉米素核苷+200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素，葉背朝上光照培養(yǎng)，IOd轉接一次，直至出現(xiàn)綠色愈傷或芽點；將帶芽點的外植體轉入培養(yǎng)基Cl中pH6. O,Medium Base+lmg/L反式玉米素核苷+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美汀中培養(yǎng)10 14d，待分化出芽；所述促分化培養(yǎng)抑菌培養(yǎng)中篩選到的抗性芽轉入到培養(yǎng)基C3中pH 6.0，Medium Base+0. 5mg/L反式玉米素核苷+1. 5mg/L 3-卩引哚こ酸+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美?。凰錾囵B(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. O, Medium Base+2mg/LIBA+200mg/L特美汀。本發(fā)明目的在于，通過系統(tǒng)性基因沉默與嫁接技術的結合，先使砧木獲得對入侵病毒的抗性，然后砧木將其病毒抗性轉導至接穗中使嫁接于該砧木上的接穗品種獲得病毒抗性。本發(fā)明區(qū)別于現(xiàn)有技術的思路是構建的用于轉化砧木的RNA干擾載體的基因沉默對象是入侵病毒的基因，而非植物本身的基因。本發(fā)明中以番茄為砧木和接穗試材，以寄主較為廣泛的黃瓜花葉病毒CMV為靶標病毒進行具體試驗驗證，實驗數(shù)據(jù)顯示，接穗番茄獲得了良好的CMV病毒抗性?；诒景l(fā)明的構思，說明書中記載的實驗方法的指導以及本領域普通技術人員所具備的常規(guī)實驗技能，本領域技術人員可以將本發(fā)明的方法應用到很多種易于受病毒侵染的并且可以嫁接的植物中，這種應用都在本發(fā)明請求保護的范圍內。即，本發(fā)明的方法不限于應用到具體實施例中記載的番茄上。本發(fā)明以番爺為試材，以黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus ;CMV)為祀標對象，驗證本發(fā)明的構思。即通過分別選擇CMV 5個基因OPF片段以及I個融合了 5個基因片段的共6個ihpRNA植物表達載體，采用農桿菌介導轉化番茄，使轉化植株產(chǎn)生siRNA，接種CMV篩選出高抗病毒的轉基因植株。之后以抗性植株的TO或Tl代為砧木，嫁接未轉基因的番茄，砧木中的siRNA轉運到接穗中，以增強接穗對CMV的抗性。目前，在栽培番茄品種中還未發(fā)現(xiàn)有對CMV病毒的抗性基因，且栽培番茄品種也僅存在耐病性品種，利用常規(guī)雜交方法難以獲得CMV抗性番茄品種。因此通過RNA干擾轉基因的方法，是快速獲得CMV抗性材料的有效途徑。近年來，圍繞轉基因生物育種，我國在轉基因生物安全管理和安全性評價研究方面實現(xiàn)了與國際接軌，并取得了令人矚目的進展。但有關基因工程中所涉及的抗性選擇性標記基因對食品安全性的影響，部分人一直存有疑慮。而本發(fā)明巧妙的避開了這一議題，因為接穗所獲得的系統(tǒng)性抗性，來源于砧木中的小分子RNA的沉默效應。因此理論上，嫁接轉基因沉默植株接穗品種基因組以及所產(chǎn)生的雌/雄配子中將不含抗性標記基因，防止了抗生素抗性基因的漂移。本發(fā)明包括以下步驟a.針對黃瓜花葉病毒(CMV) 5個基因，通過比對番茄EST數(shù)據(jù)庫，選取CMV 5個基因ORF區(qū)間的片段，通過PCR和重疊PCR構建5個含CMV特異基因片段和I個融合了 5個基因片段的ihpRNA植物沉默表達載體；b.利用改良后的遺傳轉化體系，通過農桿菌介導轉化番茄植株，檢測獲得轉基因陽性植株，扦插繁殖轉基因植株(T0代)；

c.通過接種CMV病毒，比較不同載體轉基因株系的CMV抗性，篩選出高抗病毒的轉基因株系；d.利用抗性扦插苗(T0代)或Tl代植株為砧木，嫁接野生型植株(未轉基因植株)，接種CMV病毒，檢測獲得病毒抗性的嫁接植株；e.提取砧木與接穗總RNA，反轉為cDNA，RT-PCR檢測抗生素抗性基因的表達。


圖I :黃瓜花葉病毒(CMV)基因組結構特征圖2 :本發(fā)明采用的載體構建方案圖3 :5個含CMV基因特異片段載體的構建M2K/15K=Marker 2K/15K ；A :用Pstl/Sall酶切驗證克隆載體pUCCRNAi_lA CP，所切出小片段為構建入克隆載體的反向重復序列；B :將從pUCCRNAi-lA CP酶切后的反向重復序列，構建入表達載體得到PCAMBIA2300-1A CP 載體；C :1 3 :PstI/SalI酶切驗證表達載體pCAMBIA2300-lA CP，所切出小片段為構建入克隆載體的反向重復序列。圖4 :含5個CMV基因片段融合載體的構建A. I =Marker 為 2K，分別利用 R1AF/R1AR 和 R2AF/R2AR 引物擴增片段 IAF 和 2AF ；A. 2 :利用R1AF/R2AR引物，以IAF和2AF混合物為模板，擴增融合片段1A+2A ；B. I :分別利用R2BF/R RCPF/R引物擴增片段2BF、3AF和CPF ；B. 2 :利用R2BF/RCPR引物，以2BF、3AF和CPF混合物為模板，擴增融合片段2B+3A+CP ；C. CMV5為利用R1AF/RCP R引物，以1A+2A和2B+3A+CP混合物為模板，擴增融合片段CMV5 ；D. PstI, Pstl/Sall 酶切檢測 pCAMBIA2300_CMV5 載體。圖5 :本發(fā)明采用的改進后的番茄轉基因步驟
圖6 :轉基因番茄的PCR檢測(部分株系分批檢測)M =Marker 2K ；+ :質粒 pCAMBIA2300_lA 為模板；CK :未轉基因番茄 MoneyMaker 為模IA CMV5-1 9 :表示以ActinlPF/IntornR為引物，不同靶標載體對應轉基因株系為模板擴增的條帶圖7 :轉基因番爺部分株系的Southern雜交檢測M =Marker 15K ；+ :質粒pCAMBIA2300_lA為模板(未酶切完全);CK :未轉基因番爺MoneyMaker為模板；T01A CMV5. I 2 :表不不同祀標載體對應轉基因株系Southern雜交條帶圖8:轉基因番茄植株的RT-PCR檢測M =Marker 2K ；+ :質粒 pCAMBIA2300_lA 為模板；CK :未轉基因番茄 MoneyMaker 為模板；T01A CMV5. I 2 :表示分別以IAF CPF和RlAF(T0CMV5)為上游引物，IntronR為下游引物，擴增不同靶標載體對應轉基因株系的條帶 圖9 :轉基因番茄的扦插繁殖與CMV攻毒篩選抗病毒TO代株系CK :為未轉基因番茄植株MoneyMaker ;TO IA CP. I 2和T0CMV5. I 5 :表示不同轉基因株系扦插苗，接種CMV病毒后鑒定病毒抗性，圖中株系為篩選出的部分高抗株系圖10 :轉基因番茄Tl代的繁殖與CMV攻毒篩選抗病毒Tl代株系CK :為未轉基因番茄植株MoneyMaker ；T11A. I CMV5. I :表示不同轉基因株系Tl代，接種CMV病毒后鑒定病毒抗性圖11 :本發(fā)明采用的嫁接技術圖12 :嫁接后抗生素抗性基因NptII的RT-PCR檢測M =Marker 2K ；+ :質粒 pCAMBIA2300_lA 為模板；CK :未轉基因番茄 MoneyMaker 為模板；T01A CMV5. I 2 :表示以NptIIF/R為引物不同靶標載體對應轉基因株系為模板擴增的PCR條帶上圖表明接穗中無NptII基因的表達
具體實施例方式實施例I.針對黃瓜花葉病毒(CMV)基因，通過比對番茄EST數(shù)據(jù)庫，構建6個ihpRNA植物沉默表達載體；黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaic virus, CMV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirs)成員。CMV為單鏈正義RNA病毒。基因組分為RNA1、RNA2和RNA3，基因組大小分別為3389nt、3035nt和2197nt，分別包被于三顆病毒粒體之中，其中RNA3含亞基因組RNA4，全長lOOOnt。RNAl編碼核酸復制酶；RNA2編碼兩個蛋白RNA依賴的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)和 2b 蛋白，RdRP 與病毒的侵染有關，2b蛋白類似一種病毒運動蛋白，有實驗證明2b蛋白能夠減弱RNA介導的病毒基因的沉默；RNA3編碼一種運動蛋白3A蛋白，其具體功能不詳?shù)c病毒細胞間的傳遞有關；RNA4編碼病毒外殼蛋白CP蛋白。CMV基因組的具體特征如圖I。本發(fā)明針對黃瓜花葉病毒(CMV) 5個基因，通過比對番茄EST數(shù)據(jù)庫，選取CMV 5個基因ORF區(qū)間的片段如(Seq ID No. 1、2、3、4、5所示)，通過PCR和重疊PCR構建5個含CMV特異基因片段和I個融合了 5個基因片段的ihpRNA植物沉默表達載體，具體步驟如下擴增5個片段分別用到的引物，下劃線部分為引入的酶切位點
IAF :5' -ATTGTCGACTGGATGCGTCCTGTGC-3'IAR :5' -ATCGGATCCTTGGGCGGACTTCTTG-3'；2AF:5' ~AATGTCGACTGTCCAACGCCAACC~3'2AR : 5' ~AGGGGATCCTTCGTTGTACCTACTC~3'2BF:5' ~ATTGTCGACTGGCTCGTATGGTGGA~3'2BR:5' -GAGGGATCCGCGAACCAATCTGTAT-3'； 3AF : 5' -ATAGTCGACAGCCCTGAAGCCATTA-3'3AR:5' ~AGAGGATCCAAAGACCCTTCAGCAT~3'； CPF :5' -ATTGTCGACCTTTGTAGGGAGTGA-3'CPR :5' -ATCGGATCCTTTACGGACTGTCA-3'；擴增融合片段用到的重疊PCR引物RlAF :5' ~TATGTCGACTGTGCCCGAGGGTATTG~3'RlAR 5; -TCAGTAGCACGGTTTAAATTTACAGATCACGCATTCAC-3'R2AF 5/ -GTGAATGCGTGATCTGTAAATTTAAACCGTGCTACTGA-3'R2AR 5' -TTCTTCGCCTCCACCATACGCTTGATGAAAAGAGTCGTCGT-3'R2BF:5' -ACGACGACTCTTTTCATCAAGCGTATGGTGGAGGCGAAGAA-3'R2BR : 5' -TCCACTGATGCTGAAGGGTCTGATAGAACGGTAGGAAGCG-3'R3AF 5/ -CGCTTCCTACCGTTCTATCAGACCCTTCAGCATCAGTGGA-3'R3AR 5' -CGAGTTAATCCTTTGCCGAACACGGTCGTATTGCTTCCTT-3'RCPF :5' -AAGGAAGCAATACGACCGTGTTCGGCAAAGGATTAACTCG-3,RCPR 5' ~ATCGGATCCATCTATTACCCTAAAGCCAC~3'克隆載體檢測引物M13+ 5/ -AGGGTTTTCCCAGTCACG-3'M13- 5/ -GTGT GAAATTGTTA TCCGCTC-3'表達載體檢測引物ActinlPF :5' -CCTCAGCATTGTTCATCGGTAGTT-3'IntronR 5/ -TGTGTCACTCAAAACCAGATAAAC-3'克隆載體pUCCRNAi,記載在(Luo,A.，Qian, Q.，Yin, H. et al. (2006)EUII,encoding a putative cytochrome P450 monooxygenase, regulates internodeelongation by modulating gibberellin responses in rice.Plant Cell Physiol. 47,181-191.)中，本實驗室亦有保存，自申請日起二十年內可向公眾發(fā)放用于實驗研究。植物表達載體pCAMBIA2300-Actinl_ocs,記載在(Fang,J.，Chai, C.，Qian, Q.，Li, C. , Tang, J. , Sun, L. , Huang, Z. , Guo, X. , Sun, C. and Liu, M. 2008. Mutations of genesin synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to pre-harvest sproutingand photo-oxidation in rice. The Plant Journal. 2,177-189),本實驗室亦有保存，自申請日起二十年內可向公眾發(fā)放用于實驗研究。本發(fā)明中利用pUCCRNAi中兩組同尾酶切位點Xhol/Sall和Bglll/BamHI，將選取并經(jīng)PCR擴增得到的CMV 5個基因ORF區(qū)間的片段如Seq ID No. 1、2、3、4、5所示的片段的正、反向序列分別構建到pUCCRNAi的兩組酶切位點中，即每個片段的正反向序列分別構建到兩組酶切位點中得到具有反向重復序列的RNAi克隆載體pUCCRNAi-lA、2A、2B、3A、CP ；通過重疊PCR將Seq ID No. 1、2、3、4、5所示的5個片段內的部分片段連在一起得到SeqIDNo. 6所示的片段，將Seq ID No. 6所示的片段的正、反向序列構建到pUCCRNAi的兩組酶切位點中得到RNAi克隆載體pUCCRNAi-CMV5，引物為上面的重疊PCR引物。將克隆載體pUCCRNAi-lA、2A、2B、3A、CP、CMV5的反向重復區(qū)，用內切酶Sall/PstI酶切后連接到植物表達載體pCAMBIA2300-ACtinl-OCS中，載體構建方案如圖2所示，得到具有ihpRNA的植物表達載體pCAMBIA2300-lA、2A、2B、3A、CP、CMV5酶切，酶切驗證如圖3，4所示。測序結果也顯示所選的正反向序列的構建位置正確。將構建得到的植物表達載體轉入到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，擴大培養(yǎng)，提取質粒用于農桿菌轉化。操作如下步驟I. pUCCRNAi載體片段酶切與回收提取大腸桿菌中pUCCRNAi質粒(質粒DNA的小量提取試劑盒)。取5ul質粒，利 用XhoI和BagII內切酶，采用50ul酶切體系，37°C酶切過夜，回收酶切產(chǎn)物中3K左右長度的質粒片段；采用DNA/RNA的紫外分光檢測瓊脂糖凝膠電泳分析判斷回收片段的濃度?；厥掌螛擞洖?XhoI/Bagll-pUCCRNAi。步驟2. CMV基因PCR片段酶切與回收利用引物1AF/R CPF/R，以含CMV全基因組的侵染性克隆載體上，通過如下PCR方法，分別獲得5個CMV基因片段，分別記錄為1A、2A、2B、3A和CP ;測序驗證其準確性；引物的稀釋將合成的引物直接加去離子水配制成終濃度為10umol/L。
PCR管中依次加以下成分50ul體系 25ul體系
~10XPCR Buffer with Mg2+5ul2. 5ul
模板 DNA2ul0.4-Iul
~IOmM dNTP(混合)4ul2ul
~IOuM 引物 F/引物 R2ulIul
Taq 酶Iul0.5ul
ddH20補至 50ul 補至 25ul(2)混勻后，稍離心至管底，將PCR管放入PCR儀，蓋上熱蓋。擴增前先預熱熱蓋。(3)以下擴增條件940C 3min 預變性，94°C 30sec 變性；50_68°C 30sec 退火；72°C Imin 延伸(目的片段大于500bp用I分鐘，小于500bp用40秒)，35個循環(huán)，72°C IOmin, 4°C保存分別純化回收PCR產(chǎn)物得5個CMV基因片段。各取20ul回收片段，利用SalI和BamHI內切酶，采用50ul酶切體系，37°C酶切6h，回收酶切產(chǎn)物中對應Seq ID No. I 5所示序列長度的質粒片段。取Iul回收片段，進行凝膠電泳判斷回收質量。CMV回收片段標記為 Sall/BamHI-lA、SalI/BamHI_2A、SalI/BamHI_2B、SalI/BamHI_3A、Sall/BamHI-CP。
步驟3. PUCCRNAi-IA CPF的連接與轉化大腸桿菌取4ul XhoI/Bagll-pUCCRNAi 和 8ul SalI/BamHI-lA、 SalI/BamHI_2A、 Sail/BamHI-2B, SalI/BamHI_3A、Sall/BamHI-CP 分別進行接連
反應體系反應體系
10XT4 DNA Ligation Buffer 2ul5ul
T4 DNA Ligase(lU/ul) 2ul5ul
酶切回收后PCR片段20 Π
載體(50-400ng) 4ulIOul
無菌去離子水補足到20ul補足到50ul輕彈，混勻，稍離心。16°C過夜連接20h反應得連接產(chǎn)物。65°C IOmin滅活。取IOul連接產(chǎn)物，按方法(8.大腸桿菌質粒DNA的轉化)轉化大腸桿菌感受態(tài)(感受態(tài)大腸桿菌Trans5a Chemically Competent Cell購自北京全式金生物技術有限公司)(I)在每管制備好的感受態(tài)大腸桿菌中(IOOul/管)，加入I-IOug質粒DNA 3ul，(連接產(chǎn)物不超過感受態(tài)的1/10)輕彈混勻。(2)將混合物置于冰水浴中保持30min期間輕彈混勻。(3)42°C水浴中熱擊轉化60sec，然后迅速轉入冰上放2min，注意不要搖動離心管。(4)在超凈工作臺上加入無菌無抗的37°C溫浴的500ul LB液體培養(yǎng)基，混勻。(5)37°C 200rpm振蕩預培養(yǎng)lh，得質粒DNA轉化菌液。(期間準備帶抗生素的平板)(6) 4000rpm離心5min去除上清400ul,剩下的取50ul涂平板做篩選,涂平板時，以終濃度50mg/L氨芐青霉素(Amp)為抗生素篩選陽性轉化子。(7)用20ul槍頭挑取陽性單菌落，加入到含Amp的Iml LB液體培養(yǎng)基中，250rpm 37°C搖床培養(yǎng)6h ;取2ul菌液，按步驟2的PCR方法和體系(利用克隆載體檢測引物M13+/-檢測轉化子，陽性結果為CMV基因片段長度加360bp，選擇PCR檢測為陽性轉化菌，測序驗證；得到為大腸桿菌陽性菌液，分別標記為pUCCRNAi-lAF、pUCCRNAi_2AF、pUCCRNAi-2BF、pUCCRNAi_3AF、pUCCRNAi-CPF0步驟4. pUCCRNAi-lA CPF載體片段酶切與回收分別提取大腸桿菌中pUCCRNAi-lAF、pUCCRNAi-2AF、pUCCRNAi-2BF、pUCCRNAi-3AF、pUCCRNAi-CPF 質粒。分別取5ul質粒，利用Sail和BamHI內切酶，采用50ul酶切體系，37 °C酶切過夜，回收酶切產(chǎn)物中3K左右長度的質粒片段；取Iul回收片段，利用方法DNA/RNA的紫外分光檢測和瓊脂糖凝膠電泳分析判斷回收片段的濃度。5個回收片段分別標記為Sall/BamHI-pUCCRNAilAF、SalI/BamHI_pUCCRNAi2AF、SalI/BamHI_pUCCRNAi2BF、Sail/BamHI-pUCCRNAi 3AF、Sa11/BamHI-pUCCRNAiCPF。 步驟5. pUCCRNAi-lA CP的連接與轉化大腸桿菌按步驟3中的載體與基因片段連接方法，取步驟4中得到載體酶切回收片段和步驟2中得到的5種CMV基因，分別按組合SalI/BamHI-pUCCRNAi1AF+SalI/BamHI-lA、SalI/BamHI_pUCCRNAi2AF+SalI/BamHI_2A、Sail/BamHI-pUCCRNAi 2BF+Sa11/BamHI_2B、SalI/BamHI_pUCCRNAi3AF+SalI/BamHI_3A、SalI/BamHI-pUCCRNAiCPF+SalI/BamHI-CP,進行連接，加入其他組分后采用 20ul 體系，16 °C連接過夜；取IOul連接產(chǎn)物，轉化大腸桿菌感受態(tài)(方法同步驟3)，取2ul陽性菌液按方法采用50ul體系，利用克隆載體檢測引物(M13+/-)進行PCR檢測轉化子陽性(陽性結果為2XCMV基因片段長度加360bp);選擇PCR陽性轉化菌，測序驗證；得到驗證結果為陽性的轉化菌，分別標記為 pUCCRNAi-lA、pUCCRNAi-2A、pUCCRNAi-2B、pUCCRNAi-3A、pUCCRNAi-CP。步驟6. pCAMBIA2300-Actinl-ocs載體片段酶切與回收提取大腸桿菌中pCAMBIA2300-Actinl_ocs質粒。取5ul質粒，，用SalI和PstI內切酶，采用50ul酶切體系，37°C酶切過夜，回收酶切產(chǎn)物中IOKb左右長度的質粒片段；取Iul回收片段，利用DNA/RNA的紫外分光檢測和瓊脂糖凝膠電泳分析判斷回收片段的濃度?；厥掌螛擞洖镾alI/PstI_pCAMBIA2300。步驟7. IA CP ihpRNA片段酶切與回收提取步驟5 中陽性轉化菌中 pUCCRNAi-lA、pUCCRNAi_2A、pUCCRNAi_2B、pUCCRNAi-3A、pUCCRNAi-CP質粒。取5ul質粒，用Sail和PstI內切酶，采用50ul酶切體系，37°C酶切過夜，回收酶切產(chǎn)物中700bp左右長度的小片段(ihpRNA片段含正反向的CMV基因特異片段加內含子片段)；取Iul回收片段，利用DNA/RNA的紫外分光檢測瓊脂糖凝膠電泳分析判斷回收片段的濃度。5個回收片段分別標記為Sall/PstI- Α、SalI/PstI_2A、SalI/PstI-2B、SalI/PstI_3A、Sall/Pstl-CP。步驟8. pCAMBIA2300-lA CP的連接與轉化大腸桿菌取4ul 步驟 6 得到的 SalI/PstI_pCAMBIA2300 和 8ul 步驟 7 得到的 Sall/Pstl-IA、SalI/PstI-2A、SalI/PstI-2B、SalI/PstI-3A、SalI/PstI-CP 分別進行載體與基因片段的連接，方法同步驟3.分別取IOul連接產(chǎn)物，轉化大腸桿菌感受態(tài)，操作同步驟3的記載；取2ul轉化菌液，采用50ul體系，利用表達載體檢測引物ActinlPF/IntronR(上游引物ActinlPF匹配于表達載體Actinl啟動子區(qū),下游引物IntronR匹配于ihpRNA結構中Intron中)進行PCR檢測轉化子陽性，(陽性結果為CMV基因片段長度加323bp左右);選擇PCR陽性轉化菌，按體積比I : 1000加入到50ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，250rpm37°C搖床培養(yǎng)12h ;提取質粒，所得質粒分別標記為pCAMBIA2300_lA、PCAMBIA2300-2A、pCAMBIA2300_2B、pCAMBIA2300_3A、pCAMBIA2300_CP。步驟9.構建 pCAMBIA2300_CMV5 載體分別以pUCCRNAi-lA和pUCCRNAi_2A質粒為模板，分別利用引物R1AF/R1AR和R2AF/R2AR擴增片段IAF和2AF，回收PCR產(chǎn)物得到純化的片段IAF和2AF ；以片段IAF和2AF等量混合物為模板，利用R1AF/R2AR引物，PCR擴增出片段1A+2A，回收PCR產(chǎn)物得到純化的片段1A+2A。分別以 pUCCRNAi-2B、pUCCRNAi_3A 和 pUCCRNAi-CP 質粒為模板，利用引物 R2BF/R2BR、R3AF/R3AR、RCPF/RCPR擴增片段2BF，3AF和CPF，回收PCR產(chǎn)物得到純化的片段2BF，3AF和CPF ；以片段2BF、3AF和CPF等量混合物為模板，利用R2BF/RCPR引物，PCR擴增出片段2B+3A+CP，回收純化。以片段1A+2A和2B+3A+CP等量混合物為模板，利用R1AF/RCPR引物，PCR擴增出片段CMV5，回收加以純化。按上3步驟的操作得到pUCCRNAi-CMV5，按步驟4的操作酶切pUCCRNAi_CMV5F得到SalI/BamHI-pUCCRNAiCMV5F，按步驟5得到克隆載體pUCCRNAi_CMV5和及按步驟7的方法得到 SalI/PstI—CMV5，將步驟 6 中的 SalI/PstI_pCAMBIA2300 與步驟 7 得到的 SalI/PstI-CMV5按照步驟8的操作得到表達載體pCAMBIA2300-CMV5。 實施例2. RNA干擾載體的功能驗證材料ZT (Trans-Zeatin-Riboside,反式玉米素核苷)、Tim(Timentin,特美汀)、葉酸、As (乙酰丁酮)、Kan (卡那霉素)、IAA(3_吲哚乙酸)、IBA(3_吲哚丁酸)、MS salt(M0404)均購自Sigma公司。番爺品種MoneyMaker,該品種為CMV易感品種。培養(yǎng)基配制(單位L)(I) 1/2MS pH 5. 8 1/2MS salt+15g 鹿糖+6. 5g 瓊脂(2)培養(yǎng)基 A:pH 5.8 MS salt+30g 蔗糖 (3)培養(yǎng)基 B pH 5. 8 MS salt+30g | 蔗糖 +6. 5g | 瓊脂 +Img | ZT(4)培養(yǎng)基 Base pH 6. 0 MS salt+20g 鹿糖 +6.5g| 瓊脂 +IOOmg | 肌醇+0. lmL| 10000 X 葉酸(5)培養(yǎng)基 C :pH 6. O Medium Base+2mg | ZT+200mg | Tim+100mg | Kan(6)培養(yǎng)基 Cl pH 6. 0 Medium Base+lmg | ZT+80mg | Kan+200mg | Tim(7)培養(yǎng)基 C3 :pH 6. 0 Medium Base+0. 5mg | ZT+1. 5mg | IAA+80mg | Kan+200mg | Tim(8)培養(yǎng)基 D :pH 6. 0 Medium Base+2mg | IBA+200mg | Tim方法實施例I得到并鑒定過的6種具有ihpRNA的植物表達載體pCAMBIA2300_lA、2A、2B、3A、CP、CMV5，其中的所有靶標片段Seq ID No. I 6，與番茄EST數(shù)據(jù)庫http://solgenomics. net/進行比對,所有片段與番爺EST均無連續(xù)20nt以上的完全互補區(qū)域,這樣保證了 RNAi載體在轉基因植物內形成的SiRNA不會靶向番茄植株重要基因。步驟I.制備轉基因植株本發(fā)明方法中，對現(xiàn)有番爺遺傳轉化體系(Frary, A. and Van Eck, J. 2005.Organogenesis From Transformed Tomato Explants. Transgenic plants methods andprotocols. 141-150.)進行了改進,縮短了轉化時間。其主要步驟如下:見(圖5)(I)播種6-7d :種子用無菌水浸潤5 8h ;20%次氯酸鈉滅菌IOmin ;無菌水洗5次，每次約5min ;30°C培養(yǎng)箱催芽兩天；待種子露白，點播于1/2MS培養(yǎng)基中，然后轉入26 28°C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)約5d，子葉便可開始展開。改進處浸泡后催芽可縮短出芽I周左右，且出芽整齊。(2)切子葉預培養(yǎng)2d:在真葉未出現(xiàn)前，子葉剛冒出種皮且未完全展開時，將子葉兩端切除l_2mm，再從中間橫切一刀，每個子葉切成兩塊，收集于含培養(yǎng)基A的培養(yǎng)皿中，每次約50 80片。倒掉培養(yǎng)基A，用解剖刀小心將葉盤(勿夾傷)撥于無菌濾紙上，吸干后接于覆蓋有濾紙的培養(yǎng)基B，子葉葉面朝上，弱光預培養(yǎng)2d。改進處按本發(fā)明所述時期收集的子葉，分化效率要遠遠高于真葉出現(xiàn)后。(3)工程菌的制備a.調節(jié)電擊儀，使其電脈沖為25uF，電壓為2. 5KV，電阻為400 Ω。b.從_70°C冰箱中取出農桿菌EHA105感受態(tài)細胞，置于冰上使其融化。

c.加Iul質粒于50ul EHA105感受態(tài)細胞中，輕輕混勻。d.將上述混合懸液加入電擊杯的底部，迅速將電擊杯放進電擊儀。e.按a中設定的參數(shù)，啟動對細胞的電脈沖。電擊以后，盡快取出樣品，加入Iml無抗YEB培養(yǎng)基。f.將e中得到的菌液轉入I. 5ml離心管中，28°C 200rpm振蕩預培養(yǎng)3h。g.取50_100ul菌液涂布在加有抗生素Kan和利福平(Rif)的YEB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2-3天，直至菌落長出。注意所有操作最好在冰上進行，電擊杯電擊之前在冰上預冷。h.微波爐熔化LB固體培養(yǎng)基，冷卻到50°C左右后，在超凈工作臺上加入相應抗生素(一般為Amp)。i.鋪板 20ml/ 塊后在平板表面加 16ul 的 IPTG (50mg/ml), 40ul 的 X_gal (20mg/ml)，用無菌彎頭玻璃棒均勻涂開，避光置于超凈工作臺lh，使溶解X-gal的二甲基酰胺盡量揮發(fā)干凈。j.在平板上加入轉化菌液，用無菌彎頭玻璃棒均勻涂開，(剩余菌液4°C保存)。k.平板正向放置lh，使菌液吸收。然后倒置放入培養(yǎng)箱中，37°C 12_16h培養(yǎng)至有清晰菌落出現(xiàn)。I.長出藍白斑后放置于4°C冰箱，使之充分顯色(白斑可能為陽性克隆，挑出做擴大培養(yǎng)之后做菌落PCR或質粒PCR/酶切檢測)。(4)工程菌侵染及共培養(yǎng)2d :工程菌提前2d劃線，然后挑單菌26°C黑暗條件下?lián)u菌16h左右至0D600 = O. 6 O. 8。5000rpm，離心5min收集菌液，用培養(yǎng)基A調至0D600=O. 5左右，加終濃度為300uM的AS。侵染預培養(yǎng)過的葉盤外植體lOmin，無菌濾紙吸干，葉背朝上置于(勿夾傷)覆蓋有濾紙的培養(yǎng)基B上，26°C暗培養(yǎng)2d。(5)抑菌篩選培養(yǎng)7-10d :轉入培養(yǎng)基C中，葉背朝上光照培養(yǎng)；10d轉接一次，正常情況下2周左右便可以出現(xiàn)綠色愈傷或芽點。待愈傷上芽點出現(xiàn)。則將帶芽點外植體轉入Cl培養(yǎng)10 14d，2 3周便會陸續(xù)分化出芽。改進處高濃度ZT(2mg/L)利于分裂，但分裂速度過快可能導致陰性再生芽逃避抗生素，本發(fā)明Cl培養(yǎng)基中及時降低ZT并在C中用較高Kan濃度(100mg/L)可防止此情況。(6)促分化培養(yǎng)10 20d :待再生芽長出約O. 5cm。切去白化外植體部分將抗性芽轉入新鮮C3。未出芽的葉盤，一部分會白化，切口端褐化且無出愈跡象，此類葉盤應及時除去。具有長出再生芽能力的葉盤，一般切口會出現(xiàn)小團愈傷，繼而分化出芽。改進處長期處于ZT中容易形成畸形芽，本發(fā)明改進培養(yǎng)基C3含低濃度ZT并增加了生長素IAA，能有效促進正常芽的分化與生長。(7)生根培養(yǎng)15 30d :待抗性芽莖部長至Icm后，剔除愈傷組織，切下置入培養(yǎng)基D生根培養(yǎng)。改進處抗生素Kan對植株生根影響顯著，本發(fā)明在生根培養(yǎng)基中不加抗生素Kan,能有效提聞生根率。(8)田間培養(yǎng)移栽前3天慢慢打開瓶蓋，轉入滅菌培養(yǎng)土后用透明塑料袋包好，I周后逐步揭開塑料袋，移栽至大田。PCR檢測前2d用次氯酸鈉擦拭待檢測葉片，葉片用無菌水洗凈后再進行后續(xù)檢測。本發(fā)明上述操作方法與現(xiàn)有常用方法的效果比較(I):浸泡后催芽可縮短出芽I周左右，且出芽整齊。

(2):按本發(fā)明所述時期收集的子葉，分化效率要遠遠高于真葉出現(xiàn)后。采用本發(fā)明所述時期收集的子葉即“在真葉未出現(xiàn)前，子葉剛冒出種皮且未完全展開時”分化效率達100% (出現(xiàn)分化芽數(shù)/葉盤數(shù))且每個葉盤都能分化出2個以上的芽體；真葉出現(xiàn)后2d，調查分化效率為50% ;真葉出現(xiàn)后5d，調查分化效率為10%以下。(3):本發(fā)明Cl培養(yǎng)基中及時降低ZT并在C中用較高Kan濃度可有效防止假陽性。采用本發(fā)明方法獲得的抗性芽假陽性率(假陽性芽數(shù)/分化芽數(shù))平均為24% ；若利用2mgZT則假陽性率在40%。注意本發(fā)明采用Kan濃度適合MoneyMaker品種,而我們試驗了番爺品種麗春和mic-Tom,其適宜濃度分別為50mg/L和75mg/L。(4):本發(fā)明改進培養(yǎng)基C3含低濃度ZT并增加了生長素IAA，能有效促進正常芽的分化與生長。本發(fā)明方法抗性芽畸形率(畸形芽數(shù)/抗性芽數(shù))為5%，而不加IAA且分化后的芽一直置于lmg/L ZT中芽的畸形率高達22%。(5) :Kan對生根的影響。本發(fā)明試驗了不同濃度對生根的影響，由于轉基因陽性芽數(shù)量有限，所選取的芽是未侵染的子葉分化出的芽，各20棵。100mg/L濃度Kan植株生根率(2周后生根的植株數(shù)/芽體數(shù))10% (2株)；75mg/L濃度Kan植株生根率40% (8株)；75mg/L濃度Kan植株生根率60% (12株)；0mg/L濃度Kan植株生根率90% (18株)。2周后至I個月內，IOOmg/L濃度Kan下未生根植株一直未生根，并且葉片發(fā)黃或變白；75mg/L和50mg/L濃度Kan下分別增加了 3株和2株長根；0mg/L濃度Kan下剩余2株也出現(xiàn)了根。步驟2.快速PCR檢測。利用GenStar快速植物PCR試劑盒及說明書進行轉基因植物的PCR檢測，使用引物為ActinlPF 5/ CCTCAGCATTGTTCATCGGTAGTT 3'，IntronR 5/ TGTGTCACTCAAAACCAGATAAAC 3'，和NptIIF 5/ GATACCGTAAAGCACGAGGAA 3'NptIIR 5/ TGACTGGGCACAACAGACAAT 3'
應用特異引物對抗性植株進行病毒基因的PCR檢測。以NptIIF和NptIIR為引物，進行NptII抗性標記基因的檢測，擴增目的片段應為673bp片段。以載體啟動子區(qū)設計上游引物ActinlPF和載體中內含子IntronR為下游引物,擴增目的片段來檢測插入片段，根據(jù)如圖6的檢測結果確定陽性轉基因植株。步驟3.轉基因植株Southern雜交分析對經(jīng)PCR檢測的陽性植株，取其嫩葉，用CTAB法提取總DNA，用EcoR I酶切，進行Southern雜交分析，進一步確定外源目的片段在不同轉基因植株中的整合情況。操作如下探針標記

以對經(jīng)PCR檢測的陽性植株的DNA為模板，用dUTP (Roche)混合物進行二次PCR擴增得dUTP地高辛標記的探針?；蚪M大量酶切(I)酶切體系基因組DNA60ug 約 IOOulIOXBuffer H 60ul內切酶(EcoRI)30ul終體積600ul(2) 37°C溫浴過夜；取5ul酶切產(chǎn)物電泳分析，檢測酶切效果；(3)酶切完全后，加入O. I倍體積(60ul) 3mol/L NaAc和2倍(1200ul)體積的無水乙醇(_20°C )，混勻后于_20°C放置2h ；(4) 12000rpm, 4°C離心IOmin,小心棄上清；加入Iml 75%乙醇洗一遍,于超凈臺吹干沉淀，溶于30ul ddH20中備用。(5)用O. 5 X TBE配制I %的瓊脂糖凝膠，凝膠厚度約為O. 5cm左右；加入檢測樣品30ul (約IOug) DNA酶切濃縮液加6 X溴酚蘭溶液；120V電壓(約為6V/cm)電泳5min，待溴酚蘭進入膠中以后，將電壓降至IOOV(約為4V/cm)，電泳2h。DNA 變性(I)溴酚蘭遷移至距膠孔8-10cm(3/4)左右停止電泳，從膠槽中取出膠塊，將膠塊泳道以外多余部分切去，準確量出膠的長和寬，切去凝膠一角作為記號；(2)膠盛于大培養(yǎng)皿,浸漫Denaturation溶液,搖床上溫和搖動15minX2次,使DNA變性；(3)將膠用ddH20稍微洗漆,放入Nenutralization溶液中沒過膠15minX2次(不
搖動)。轉膜/固定膜(I)利用whatman磨具(TurboBlotter 轉印器)，按要求疊好,放好4層大吸水紙，再放5層4*7cm吸水紙，頂層放2層光滑吸水紙；光滑吸水紙上方放好一張略微大于下方吸水紙的尼龍膜(2*SSC預泡5min)用玻棒小心趕走尼龍膜與光滑吸水紙之間的氣泡；取出凝膠，用刀片小心地將膠孔處突出的凝膠切平，膠孔向上放在吸水布正中。用玻棒趕走凝膠與濾紙之間氣泡；剪一條3倍于膠寬的鹽橋紙，覆蓋在膠上，并折疊兩端溝通磨具溝中20 X SSC，其上覆蓋一張吸水紙；
(2)轉膜4h后取出尼龍膜，放于一張濾紙上，用鉛筆在尼龍膜上標明點樣孔的位置和樣品號；(3)取出尼龍膜，結合DNA的一面向上，平放于一張10 X SSC浸泡的濾紙上，紫外交聯(lián)1200*100uj/cm2交聯(lián)兩次。預雜交、雜交(I)預雜交將尼龍膜放入雜交管，加入適量30ml 42°C預熱的雜交液，于雜交爐中42°C預雜交30min ；(2)探針變性取適量探針(在Iml的雜交液中加入約25ng探針)，加入ddH20到IOOul，95°C 5min，迅速置于冰上；(3)將變性的探針加入到42°C預熱的雜交液，輕輕混勻，防止泡泡使背景變深；

(4)倒出預雜交液，加入雜交液，輕搖，41°C (NptII)雜交4h或過夜。洗膜與顯色檢測(I)將雜交好的膜取出放入大小合適、干凈的塑料盒中，室溫下用低嚴謹洗膜液漂洗2次(漂洗時輕輕搖動)，每次5min ；(2)用68 °C預熱的高嚴謹洗膜液68 °C漂洗兩次，每次15min ；(3) Washing buffer 輕輕漂洗 3min ；(4)加入 50ml I Xblocking solution 室溫撫育 30min ；(5)加入 20ml Anti-body solution 室溫反應 30min ；(6)用 Washing buffer 洗膜 2 次，每次 Ιδη η ；(7)加入 2Oml Detection buffer 平衡 2_5min ；(8)將膜置于一個干凈的培養(yǎng)皿中，加入適量Color substrate solution,避光顯色16h,不要搖動；倒掉顯色液,加入TE buffer漂洗5min停止顯色反應。主要試劑及配制(I) 20 X SSC :稱取175. 3g NaCl和88. 2g檸檬酸鈉，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調pH至7. 0，用蒸餾水定容至1L，高壓滅菌，室溫保存；(2) IM Tris-HCl (pH8. 0):稱取 12. 114g Tris-base，溶于 80ml 蒸餾水中，用 HCl 調pH至8. O后，用蒸餾水定容至100ml，高壓滅菌，室溫保存；(3)0. 5M EDTA (pH 8. 0):稱取 18. 61g EDTA，溶于 80ml 蒸餾水中，用 NaOH 調 pH 至
8.O后，用蒸餾水定容至100ml，高壓滅菌，室溫保存；(4) TE Buffer:取 IM Tris-HCl(pH 8. 0)5ml,0. 5M EDTA (pH 8. 0) lml，用蒸餾水定容至500ml，調PH至8.0，高壓滅菌，室溫保存；(5) 10% SDS :稱取IOg SDS，溶于90ml蒸餾水中，加熱至68°C溶解，用鹽酸調pH至7. 2，定容至 IOOml ；(6) Maleic Acid Buffer :稱取 11. 067g 馬來酸和 8. 766g NaCl 溶于 800ml 蒸餾水中，用NaOH(固)調pH至7. 5，用蒸餾水定容至1L，高壓滅菌，室溫保存；(7)Washing Buffer Maleic Acid Buffer 滅菌后加入 0· 3% (ν/ν)吐溫 20 ;(8)Detection Buffer 稱取 11688g NaCl 溶于 100ml 蒸懼水中，加 20ml IMTris-HCl (pH8. 0),用NaOH調pH至9. 5后,用蒸懼水定容至200ml,高壓滅菌,室溫保存；(9)變性液 I (Denaturation 溶液)l6g Na0H>58. 43g NaCl 定容至 1L,高壓滅菌，室溫保存；(10)變性液 II (Nenutralization 溶液):58. 43g NaCl、O. 5M Tris-HCl (pH7. 2) 500ml定容至1L，高壓滅菌，室溫保存。(11)低嚴謹洗膜液將20XSSC用蒸餾水稀釋成2XSSC，并按100 I (2 X SSC 10% SDS)加入 10% SDS，配成 2XSSC/0. 1% SDS ;(12)高嚴謹洗膜液將20XSSC用蒸餾水稀釋成O. 5XSSC,并按100 I (2 X SSC 10% SDS)加入 10% SDS，配成 O. 5XSSC/0. 1% SDS ;(13) Blocking Solution :用 Maleic Acid Buffer 將 IOXBlocking solution 稀釋10倍(新鮮配制)；(14)Antibody Solution 將 Anti-Digoxigenin-AP IOOOOrpm 離心 5min,按
I: 5000 用 BlockingSolution 稀釋；(15)Color substrate solution 將 NBT/BCIP 按 I : 50(200ul 10ml)用Detection Buffer稀釋，避光保存；本發(fā)明共獲得63PCR陽性轉化植株(其中1A9個、2A11個、2B12個、3A8個、CP 13個、CMV510個)，部分southern雜交結果如圖7，發(fā)現(xiàn)陽性植株多以多拷貝形式存在。步驟4.轉基因植株SiRNA前體的RT-PCR檢測對經(jīng)過步驟2分子檢測為陽性的番茄轉基因株系，提取RNA，反轉錄合成cDNA，利用IAF CMV5和IntronR為引物，RT-PCR檢測siRNA前體的表達，結果如圖8，顯示各陽性株系的前體都有表達，證明所構建植物表達載體已成功轉化到番茄中并獲得了表達。實施例3.扦插繁殖轉基因植株確定各靶標基因轉基因株系的抗性。由于轉基因陽性植株TO代從無菌室轉到大田成活后需要留種，不適合直接接種病毒。因此本發(fā)明采用扦插的方式進行營養(yǎng)擴繁，能解決這一問題。同時，由于是營養(yǎng)繁殖，扦插擴繁能為后續(xù)嫁接提供更多的同遺傳背景的砧木材料。步驟I.待植株長至一定高度，母株用于獲取種子，取葉腋部生長出的側芽，或取帶一個結的莖段，將側芽或莖段收集于干凈的三角瓶中，加入含0.2mg/L IBA的無菌水50ml, I 2周后側芽底部會發(fā)出新根(莖段稍遲)。將生根后的植株轉入滅菌后的培養(yǎng)基中，置于溫室中培養(yǎng)?？焖貾CR檢測扦插苗都為陽性。等扦插苗4葉展開時用于后續(xù)病毒接種檢測。步驟2.扦插苗CMV病毒的接種體系的確定按以下國標操作法對扦插苗(對照MoneyMaker ;MM)接種病毒,21天后很多扦插苗并無明顯癥狀產(chǎn)生，而在50 60天后才出現(xiàn)典型癥狀。認為這是由于扦插苗相對于實生苗，已度過童期進入成熟期，其耐病能力有了一定提高。為縮短鑒定時間和獲得可靠的抗病性結果，本發(fā)明將摩擦接種(兩次)改為連續(xù)三次(間隔I周)，觀察發(fā)現(xiàn)所有對照扦插苗均在30天左右出現(xiàn)癥狀。因此確定，扦插苗從母株上分離成活后，待扦插植株4葉展開開始接種CMV病毒，隔一周復接一次，共3次，生長30后調查CMV病毒抗性。操作步驟(I)配制0. 03mol/L、pH 8. O磷酸緩沖液。A 0. 03mol/L磷酸氫二鈉溶液稱取10. 74克Na2HP04溶于IOOOmL水中，搖勻。B :0. 03mol/L磷酸二氫鉀溶液稱取4. 08克磷酸二氫鉀溶于IOOOmL水中搖勻。用B液調配A液pH值為8. O。(2)病毒的制備番茄CMV病毒在普通煙“枯斑三生”上繁殖，病毒發(fā)病后采下稱重，按I : 5的比例加磷酸緩沖液，搗碎，雙層紗布過濾后立即使用。(3)接種方法在番茄長至2片真葉時進行第一次接種，摩擦接種(用噴粉器將金剛砂出00目)撒至待接種植株的表面；采用摩擦接種法，即充分洗凈的手指蘸取接種懸浮液，在葉面輕度摩擦造成微傷，每株接種第I 2片真葉，接種后立即用清水沖洗葉面上多余的病毒汁液。接種兩次，間隔3d 5d。接種在溫室內進行，接種當天的室內溫度為26°C 30°C，以后白天溫度盡量控制在24°C 30°C，夜間不低于20°C，常規(guī)光照，正常栽培管理。(4)病情調查與分級標準表I黃瓜花葉病毒引起的番茄病毒病病情級別的劃分

癥狀描述
O無病癥。
"I心葉的葉脈為明脈，I 2片真葉呈現(xiàn)花葉。
~3中上部葉片花葉。
~5多數(shù)葉片花葉，少數(shù)葉片畸形或明顯皺縮。
~多數(shù)葉片重花葉，部分葉片畸形、細長，植株明顯矮化。
~9幾乎所有葉片重花葉，多數(shù)葉片畸形、蕨葉。植株嚴重矮化，甚至枯死。(5)調查時間在接種后約21d進行。(6)病情記載調查記載每一鑒定植株的病情級別，并計算病情指數(shù)。病情指數(shù)按下列公式計算
X (sxn)
DI =- X 100
NxS式中DI——病情指數(shù)；Σ—各病情級別代表數(shù)值與相對應的各病情級別植株數(shù)乘積的總和；s—各病情級別的代表數(shù)值；η——各病情級別的植株數(shù)；N—調查總植株數(shù)；S——最高病情級別的代表數(shù)值。(7)抗性評價當感病對照材料達到其相應感病程度(DI ^ 50)，該批次鑒定視為有效。依據(jù)鑒定材料3次重復的病情指數(shù)平均值確定其抗性水平，劃分標準見下表。番茄對黃瓜花葉病毒病抗性的評價標準
權利要求
1.一種使接穗品種獲得病毒抗性的方法，其步驟如下 (1)制備抗病毒的轉基因砧木； (2)使接穗嫁接到所述轉基因砧木上生長發(fā)育； 其特征在于所述抗病毒的轉基因砧木為轉入RNA干擾載體而獲得，所述RNA干擾載體的靶標序列為目標病毒基因組內的基因片段。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，所述目標病毒指黃瓜花葉病毒CMV，所述接穗品種和轉基因砧木都為番茄品種，所述RNA干擾載體的靶標序列如Seq ID No. 1，2，3，4，5或6所示。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，所述RNA干擾載體為PCAMBIA2300-1A、PCAMBIA2300-2A、pCAMBIA2300-2B、pCAMBIA2300_3A、pCAMBIA2300_CP 或PCAMBIA2300-CMV5。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，所述制備抗病毒的轉基因砧木，包括如下步驟 (1).番茄播種， (2).切子葉預培養(yǎng)， (3).抑菌篩選培養(yǎng)根癌農桿菌工程菌侵染后的子葉， (4).促分化培養(yǎng)， (5).生根培養(yǎng)， 其特征在于 所述番爺?shù)姆N子播種前經(jīng)無菌水浸潤5 8小時；20%次氯酸鈉滅菌IOmin,無菌水洗5次，每次5min ;30°C培養(yǎng)箱催芽兩天； 所述切子葉預培養(yǎng)，是在真葉未出現(xiàn)前切取子葉進行預培養(yǎng)； 所述抑菌篩選培養(yǎng)被根癌農桿菌侵染并暗培養(yǎng)2天的子葉，培養(yǎng)基C中pH 6. 0，Medium Base+2mg/L反式玉米素核苷+200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素，葉背朝上光照培養(yǎng)，IOd轉接一次，直至出現(xiàn)綠色愈傷或芽點；將帶芽點的外植體轉入培養(yǎng)基Cl中pH 6.0，Medium Base+lmg/L反式玉米素核苷+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美汀中培養(yǎng)10 14d,待分化出芽； 所述促分化培養(yǎng)抑菌培養(yǎng)中篩選到的抗性芽轉入到培養(yǎng)基C3中pH 6. 0，MediumBase+0. 5mg/L反式玉米素核苷+1. 5mg/L 3-卩引哚乙酸+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美?。? 所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6.0, Medium Base+2mg/LIBA+200mg/L特美汀。
5.一種以黃瓜花葉病毒基因為靶標的RNA干擾載體，其特征在于，所述RNA干擾載體的革巴標序列如Seq ID No. 1,2,3,4,5或6所示。
6.根據(jù)權利要求5所述的RNA干擾載體，為pCAMBIA2300-lA、pCAMBIA2300_2A、PCAMBIA2300-2B、pCAMBIA2300_3A、pCAMBIA2300-CP 或 pCAMBIA2300_CMV5。
7.轉化有權利要求5或6任一所述RNA干擾載體的菌株或植物細胞。
8.根據(jù)權利要求7所述的菌株，指轉基因根癌農桿菌菌株EHA105。
9.根據(jù)權利要求7所述的植物細胞，指轉基因番茄砧木的外植體前體細胞。
10.一種制備轉基因番茄砧木的方法，包括如下步驟 (1).番茄播種， (2).切子葉預培養(yǎng)， (3).抑菌篩選培養(yǎng)根癌農桿菌工程菌侵染后的子葉，(4).促分化培養(yǎng)， (5).生根培養(yǎng)， 其特征在于 所述番爺?shù)姆N子播種前經(jīng)無菌水浸潤5 8小時；20%次氯酸鈉滅菌IOmin,無菌水洗.5次，毎次5min ;30°C培養(yǎng)箱催芽兩天； 所述切子葉預培養(yǎng)，是在真葉未出現(xiàn)前切取子葉進行預培養(yǎng)； 所述抑菌篩選培養(yǎng)被根瘤農桿菌侵染并暗培養(yǎng)2天的子葉，培養(yǎng)基C中pH 6. O,Medium Base+2mg/L反式玉米素核苷+200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素，葉背朝上光照培養(yǎng)，IOd轉接一次，直至出現(xiàn)綠色愈傷或芽點；將帶芽點的外植體轉入培養(yǎng)基Cl中pH 6.0，Medium Base+lmg/L反式玉米素核苷+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美汀中培養(yǎng)10 14d,待分化出芽； 所述促分化培養(yǎng)抑菌培養(yǎng)中篩選到的抗性芽轉入到培養(yǎng)基C3中pH 6. O, MediumBase+0. 5mg/L反式玉米素核苷+1. 5mg/L 3-卩引哚こ酸+80mg/L卡那霉素+200mg/L特美?。凰錾囵B(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. O, Medium Base+2mg/LIBA+200mg/L特美汀。
全文摘要
本發(fā)明“一種使接穗品種獲得病毒抗性的方法及RNA干擾載體與轉基因方法”屬于植物轉基因技術及其應用。(1)制備抗病毒的轉基因砧木；(2)使接穗嫁接到所述轉基因砧木上生長發(fā)育；其特征在于所述抗病毒的轉基因砧木為轉入RNA干擾載體而獲得，所述RNA干擾載體的靶標序列為目標病毒基因組內的基因片段。本發(fā)明的方法用于番茄接穗品種獲得病毒抗性的試驗獲得了良好的效果，針對番茄的具體實施例中，構建的RNA干擾載體為為pCAMBIA2300-1A、pCAMBIA2300-2A、pCAMBIA2300-2B、pCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP或pCAMBIA2300-CMV5。本發(fā)明還提供了一種改進的轉基因方法。上述方法獲得的抗病毒植株能夠有效規(guī)避轉基因食品的安全隱患，且能夠大大提高了獲得抗病毒轉基因品種的效率。
文檔編號C12N5/10GK102676564SQ201110315208
公開日2012年9月19日 申請日期2011年10月17日 優(yōu)先權日2011年10月17日
發(fā)明者周敏, 楊國順, 熊興耀, 白描, 石雪暉, 鄧子牛, 鐘曉紅, 陳文婷 申請人:湖南農業(yè)大學