專利名稱：一種用于擴(kuò)增hsv-1堿性核酸酶基因的試劑盒和表達(dá)hsv-1堿性核酸酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得病毒蛋白的方法，具體涉及一種用PCR技術(shù)擴(kuò)增HSV-I堿性核酸酶基因，通過(guò)基因表達(dá)得到HSV-I堿性核酸酶的方法。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒I型(HSV-I)為有包膜的DNA病毒，是危害人類健康的常見(jiàn)病原體， 且容易導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染和潛伏感染。HSV-I感染部位廣泛，能引起口唇皰疹、生殖器皰疹、腦炎、角膜炎等，并與宮頸癌和唇癌有關(guān)。HSV-I具有神經(jīng)毒性，可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)、破壞神經(jīng)細(xì)胞。
堿性核酸酶是由HSV-I基因組中UL12基因編碼的，其具有5' 3'的核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶活性，因其反應(yīng)最適PH值較高，所以被認(rèn)為是堿性核酸酶。其在HSV-I的復(fù)制中起著重要作用，有研究證實(shí)堿性核酸酶能正確修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中的斷裂和缺口， 并能使處于復(fù)制狀態(tài)的病毒基因組易于包裝。該編碼基因被敲除后HSV-I突變體復(fù)制幾乎停止，說(shuō)明堿性核酸酶為病毒體內(nèi)繁殖所必需。還有實(shí)驗(yàn)證明，在非容納細(xì)胞中產(chǎn)生的UL12 基因缺陷病毒，由于基因異常而很難感染新的細(xì)胞。上述研究證明堿性核酸酶在病毒復(fù)制及感染過(guò)程中非常關(guān)鍵，對(duì)于闡述抗HSV-I藥物作用機(jī)理以及建立一種新的干預(yù)手段提供了思路，也為堿性核酸酶成為一種新的抗HSV-I藥物篩選靶點(diǎn)提供了證據(jù)。因此，純化得到大量堿性核酸酶非常重要。
然而，因UL12基因片段長(zhǎng)，GC含量高，難以通過(guò)常規(guī)的PCR方法方便、準(zhǔn)確地獲得全序列的UL12基因片段，進(jìn)而獲得大量純化且有活性的堿性核酸酶。文獻(xiàn)Purification and Characterization of Herpes Simplex Virus Type 1 Alkaline Exonuclease Expressed in Escherichia coli. JOURNAL OF VIROLOGY. 1996 (3) :2008-2013 中，報(bào)道了以基因工程方法獲得堿性核酸酶的方法從HSV-I基因組中分離4. 3kb的HindIII-PstI片段；將該片段克隆到PUC19中構(gòu)建pHP-AE ；通過(guò)三次亞克隆最終將目的基因片段插入表達(dá)質(zhì)粒pET-25b(+)中；將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)；變性復(fù)性獲得活性蛋白。該方法的技術(shù)方案復(fù)雜，且難以獲得大量堿性核酸酶，成本高，工業(yè)化應(yīng)用困難。也未見(jiàn)有堿性核酸酶的市售品。發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了用基因工程技術(shù)大量獲得HSV-I堿性核酸酶的方法。
因此，本發(fā)明目的之一是提供一種用于擴(kuò)增UL12基因片段的試劑盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物對(duì)1和其他相關(guān)試劑。該試劑盒優(yōu)選還包含T載體。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)獲得有活性的堿性核酸酶的方法，其步驟如下
(1)擴(kuò)增目的基因提取HSV-I病毒基因組作為模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-I的UL12基因片段，擴(kuò)增程序?yàn)?6°C預(yù)變性3min，95°C變性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ；膠回收擴(kuò)增的UL12基因片段；
(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒將獲得的UL12基因片段與表達(dá)質(zhì)粒連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒；
(3)誘導(dǎo)表達(dá)將步驟( 獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌；培養(yǎng)含有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌使其復(fù)制至處于對(duì)數(shù)期；加入異丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)；離心收集菌體；
(4)變性破碎步驟C3)獲得的菌體，離心收集沉淀，用包含變性劑的洗滌液洗滌沉淀，獲得蛋白溶液；
(5)復(fù)性用復(fù)性液復(fù)性步驟(4)獲得的蛋白溶液，獲得活性蛋白。
上述步驟(1)所述擴(kuò)增目的基因的方法優(yōu)選為提取HSV-I病毒基因組作為模板， 以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-I的UL12基因片段，擴(kuò)增程序?yàn)?6°C預(yù)變性3min，95°C變性40s, 68 72°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin ；膠回收擴(kuò)增的UL12基因片段；將擴(kuò)增得到的UL12基因片段與T載體連接形成重組 T載體，再以該重組T載體為模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作為引物進(jìn)一步擴(kuò)增得到核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示的UL12目的基因片段，擴(kuò)增條件不變。所述退火、延伸溫度均優(yōu)選為68 °C。
上述步驟(2)中表達(dá)質(zhì)粒為pET系列質(zhì)粒，優(yōu)選為pET3^i-UL12或者pET28a-UL12 質(zhì)粒。
上述步驟(3)中大腸桿菌為E. coli BL12菌株，或者為E. coli Rosetta菌株。
上述步驟中變性采用的方法為
用洗滌液A兩次洗滌步驟C3)獲得的菌體；冷凍超聲破碎菌體，離心收集沉淀；用洗滌液B、C、D依次洗滌、離心、收集沉淀；用洗滌液E洗滌沉淀，獲得蛋白溶液；
所述的洗滌液A 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA, IOOmM NaCl 的溶液；
洗滌液B:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、1 % NP40 (乳化劑 NP40系列)的溶液；
洗滌液C:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、3% TritonX-100、 ImM苯甲基磺酰氟的溶液；
洗滌液D:包含 50mM Tris-HCl [pH8.0]、2mM EDTA、100mM NaCl、0· 5 % TritonX-lOOU. 5M鹽酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；
洗滌液E 包含 IOOmM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、10mM β -巰基乙醇、ImM苯甲基磺酰氟和4 6Μ鹽酸胍的溶液。其中鹽酸胍濃度優(yōu)選為4Μ。
上述步驟(5)中復(fù)性液為包含50mMTris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、50mMNaCl、5%甘油甘氨酸和鹽酸胍濃度逐步減小的溶液，所述鹽酸胍濃度依次為4M、3M、2M、1M和0M。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)克服了現(xiàn)有技術(shù)的障礙，準(zhǔn)確擴(kuò)增了片段長(zhǎng)度達(dá)1881bp，GC含量高于71%的UL12基因片段，得到序列與GeneBank已公布序列同源性高達(dá)99. 2%。通過(guò)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒、誘導(dǎo)表達(dá)、變性和復(fù)性一系列步驟得到具有較高核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶活性的堿性核酸酶。這為進(jìn)一步闡明藥物作用機(jī)制有十分重要的意義，且為體外構(gòu)建堿性核 酸酶的藥物篩選分子模型奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
圖1 實(shí)施例1中擴(kuò)增得到的UL12基因片段凝膠電泳結(jié)果。泳道M =DNA Marker DL2000;泳道1 :UL12基因；泳道2 :UL12基因。
圖2 進(jìn)一步擴(kuò)增得到的UL12基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1為DL2，000 DNA Marker,作為標(biāo)記；泳道2為用I/ Hiη III切割純化重組pMD19 T載體；泳道3為 用I/ Hiη III切割純化pEI^8a_UL12 ；泳道4是空載質(zhì)粒pED8a ( + )，用I/ Hiη III處理后作為對(duì)照；泳道5為沒(méi)有酶切處理的pET28a-UL12 ；泳道6為λ -Hiη III digest DNA Marker,作為標(biāo)記。
圖3a-l中第廣80個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 259 180個(gè)堿基。
圖3a-2中第8廣160個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 179 100個(gè)堿基。
圖3a-3中第16廣240個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 99 20個(gè)堿基，圖3a-4中第對(duì)廣259個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17毒株基因 序列中第Ifl個(gè)堿基。
圖3a-4中第259 320個(gè)堿基為測(cè)序時(shí)目標(biāo)基因周邊的序列。 圖3a-5中第32廣400個(gè)堿基為測(cè)序時(shí)目標(biāo)基因周邊的序列。 圖3a-6中第40廣464個(gè)堿基為測(cè)序時(shí)目標(biāo)基因周邊的序列。
圖3b-1中第廣80個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 835 756個(gè)堿基。
圖3b-2中第8廣160個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 755 676個(gè)堿基。
圖3b-3中第16廣240個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 675 596個(gè)堿基。
圖3b-4中第對(duì)廣320個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 595 516個(gè)堿基。
圖3b-5中第32廣400個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 515 436個(gè)堿基。
圖3b-6中第40廣480個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 435^356個(gè)堿基。
圖3b-7中第48廣560個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 355 276個(gè)堿基。
圖3b-8中第56廣640個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第CN 102533726 A275 196個(gè)堿基。圖北-9中第64廣663個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 195 173個(gè)堿基。圖3c-l中第廣80個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第774 853個(gè)堿基。圖3c-2中第8廣160個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 854 933個(gè)堿基。圖3c-3中第16廣240個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第 934 1013個(gè)堿基。圖3c-4中第對(duì)廣320個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17毒株基因序列中第1014 1093個(gè)堿基。圖3c-5中第321 400個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-1 17 1094 1173個(gè)堿基。圖3c-6中第401 480個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-1 17 1174 1253個(gè)堿基。圖3c-7中第481 560個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-1 17 1254 1333個(gè)堿基。圖3c-8中第561 640個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-1 17 1334 1413個(gè)堿基。圖3c-9中第641 703個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-1 17 1414 1476個(gè)堿基。圖3d-l中第廣80個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :4所示的HSV-I 17 S 1446 1525個(gè)堿基。圖3d-2中第81 160個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID N0:4所示的HSV-1 17 i 1526 1605個(gè)堿基圖。圖3d-3中第161 240個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-1 17 1606 1685個(gè)喊基。圖3d-4中第Ml 320個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-1 17 1686 1765個(gè)喊基。圖3d-5中第321 400個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-1 17 1766 1845個(gè)堿基，其437 480個(gè)堿基為測(cè)序時(shí)目標(biāo)基因周邊的序列。圖3d-6中第401 436個(gè)堿基對(duì)應(yīng)SEQ ID NO 4所示的HSV-1 17 1846 1881個(gè)堿基，其第48廣538個(gè)堿基為測(cè)序時(shí)目標(biāo)基因周邊的序列。 圖3d-7中第48廣538個(gè)堿基為測(cè)序時(shí)目標(biāo)基因周邊的序列。 圖4-1為UL12基因片段第1-400個(gè)堿基。 圖4-2為UL12基因片段第401-800個(gè)堿基。 圖4-3為UL12基因片段第801-1200個(gè)堿基。 圖4-4為UL12基因片段第1201-1600個(gè)堿基。 圖4-5為UL12基因片段第1601-1881個(gè)堿基。圖5不同誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量的影響結(jié)果圖。泳道3至泳道8對(duì)應(yīng)誘導(dǎo)時(shí)間為 IOh，8h，6h, 4h, 3h, Oh。泳道2和泳道10作為對(duì)照，未添加IPTG，表達(dá)時(shí)間10h。蛋白_株基因序列中第 _株基因序列中第 _株基因序列中第 _株基因序列中第 _株基因序列中第株基因序列中第 _株基因序列中第 _株基因序列中第 _株基因序列中第 _株基因序列中第 _株基因序列中第質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)，在泳道1和泳道9，作為標(biāo)記。圖6pET3^i-UL12的五coli BL21轉(zhuǎn)化子表達(dá)結(jié)果圖。泳道1為pET32a_UL12的萬(wàn).coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白；泳道2為ρΕΤ3^ι的萬(wàn).co/i BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白；泳道3為pET3h-UL12的萬(wàn).coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌培養(yǎng)液上清；泳道4為pET3h的. coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌培養(yǎng)液上清；泳道 5為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)，作為標(biāo)記；泳道6為IPTG誘導(dǎo)后pET3h-UL12的萬(wàn).coli BL21 轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后的上清；泳道7為IPTG誘導(dǎo)后pET3h的A . coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后的上清；泳道8為pET3h-UL12的萬(wàn).coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀；泳道9為pET3h的萬(wàn).coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀。 圖7pEI^8a-UL12的五coli BL21轉(zhuǎn)化子表達(dá)結(jié)果圖。泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)， 作為標(biāo)記；泳道2為pET28a的萬(wàn).coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白；泳道3為 pET28a-UL12的萬(wàn).coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白；泳道4為pED8a的萬(wàn) -coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀；泳道5為pET28a_UL12的萬(wàn).coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀；泳道6為IPTG誘導(dǎo)后pET28a的萬(wàn).coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后的上清；泳道7為IPTG誘導(dǎo)后pET28a_UL12的萬(wàn).coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后的上清。圖8不同洗滌液變性處理后，目標(biāo)蛋白存在形式鑒定圖。泳道1是用變性劑A和變性劑C處理后的上清液；泳道2是經(jīng)過(guò)變性劑A和變性劑B處理后的上清液；泳道3是用變性劑A、B、C、D和E處理后的沉淀，且變性劑E中鹽酸胍的濃度為4M ；泳道4是用變性劑A、 B、C、D和E處理后的沉淀，且變性劑E中鹽酸胍的濃度為6M ；泳道5是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) (低)，作為標(biāo)記；泳道6是經(jīng)過(guò)變性劑A和變性劑B處理后的沉淀；泳道7是用變性劑A和變性劑C處理后的沉淀。圖9蛋白活力測(cè)定的結(jié)果圖。五coli BL21和五coli Rosetta產(chǎn)生的復(fù)性后的重組蛋白對(duì)pcDNA3. O質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)的結(jié)果泳道Mj歷III digest DNA Marker ；泳道1 pcDNA3. O對(duì)照；復(fù)性后的萬(wàn).coli Rosetta表達(dá)的重組蛋白與pcDNA3. O反應(yīng)于37°C孵育 5min (泳道 2)，20 min (泳道 4)，40 min (泳道 6)，60 min (泳道 8)；復(fù)性后的 E . coli BL21表達(dá)的重組蛋白與pcDNA3. O反應(yīng)于37°C孵育5min (泳道3)，20 min (泳道5)，40 min (泳道 7)，60 min (泳道 9)。圖10蛋白活力測(cè)定的結(jié)果圖，蛋白為五cWi Rosetta產(chǎn)生的復(fù)性后的重組蛋白。 M Marker λ -Hind III ；泳道1 4 分別為pcDNA3. 1質(zhì)粒用復(fù)性后的重組蛋白液處理 60min,40min,20min,5min ；泳道5 8 分別為線性UL12基因用復(fù)性后的重組蛋白液處理 5min,20min,40min,60min。
具體實(shí)施方式
實(shí)驗(yàn)材料和儀器
以下實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)材料和儀器，除特別說(shuō)明，均為市售購(gòu)買。
(1)材料
標(biāo)準(zhǔn)單純皰疹病毒I型(HSV-I) SM44株，購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所；
Vero細(xì)胞購(gòu)于四川大學(xué)華西醫(yī)院衛(wèi)生部移植工程與移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；
E.coli BL12(DE3)plysS 菌株、Ε· coli Rosetta (DE3)、原核表達(dá)載體 pET32a (+)、 pET28a (+)，購(gòu)自 Novagen 公司；
高保真Taq 酶、T4 DNA 連接酶、DL2, 000 DNA Marker、λ -Hind III digest DNAMarker、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III、E. coli JM109菌株、pMD 19-T 載體、dNTPs、LA Taq 酶、GC buffer、EDTA、NP-40、TritonX-100，購(gòu)于大連 TaKaRa 公司；
核酸測(cè)序由大連TaKaRa公司完成；
鹽酸胍、異丙基硫代-β -D半乳糖苷(IPTG)為美國(guó)AMRESC0產(chǎn)品；
質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；
核苷酸序列如SEQ ID NO 1 2所示的引物或者核苷酸序列，由上海 SangonBiotech 公司合成；
RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)hvitrogen公司、LB培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；
苯甲基磺酰氟(PMSF)，購(gòu)自Sigma公司；
ddH20、MgCl2,乙醇、PBS 緩沖液、Tris-HCl 緩沖液、NaCl、甘油、甘氨酸、SDS-PAGE 和瓊脂糖凝膠電泳的各種常規(guī)試劑。
(2)儀器
PCR儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；
紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；
電熱恒溫培養(yǎng)箱為青島海爾的產(chǎn)品；
超濾管，購(gòu)自美國(guó)MILLIP0RE公司；
離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；
超聲細(xì)胞破碎儀。
實(shí)施例1擴(kuò)增UL12基因片段
(1)提取病毒基因組用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)vero細(xì)胞，接種HSV-I待細(xì)胞病變，即CPE達(dá)到+++ ++++，收獲細(xì)胞，用病毒DNA抽提試劑盒抽提HSV-I 全基因組；
(2)依據(jù)GenBank公布的UL12基因片段的核苷酸序列，用PRIMER5. O軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列如SEQ ID NO :1 2所示；
(3)擴(kuò)增目的基因以提取得到的HSV-I全基因組為模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示引物對(duì)1為引物，擴(kuò)增目的基因UL12基因片段1所示引物 2所示引物Ιμ Ιμ Ιμ 12.5μ1 2μ1 0.25μ1 7.25μ1
反應(yīng)體系
模板核苷酸序列如SEQ ID NO: 核苷酸序列如SEQ ID NO: GC buffer dNTP LAtaq 酶 ddH20
反應(yīng)條件96°C預(yù)變性3min，95°C變性40s，68°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)， 72°C延伸 IOmin0
(4)產(chǎn)物回收0. 8%常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，以膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物。
凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的DNA片段為1881bp，與已知UL12基因片段大小相同。(結(jié)果見(jiàn)圖1)
實(shí)施例2進(jìn)一步擴(kuò)增UL12基因片段
(1)制備模板在T4 DNA連接酶作用下將實(shí)施例1得到的UL12基因片段與 PMD-19T載體連接，構(gòu)建成重組PMD19T載體。
(2)擴(kuò)增目的基因以步驟(1)得到的連接有UL12基因片段的重組pMD19T載體為模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示引物對(duì)為引物擴(kuò)增目的基因UL12基因片段
反應(yīng)體系
模板
核苷酸序列如SEQ ID NO 核苷酸序列如SEQ ID NO: GC buffer dNTP 為 LA taq 為 ddH20 為
反應(yīng)條件96°C預(yù)變性3min，95°C變性40s，68°C退火延伸anin30s，31個(gè)循環(huán)， 72°C延伸 IOmin0
(3)產(chǎn)物回收0. 8%常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，以膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物。
(4)結(jié)果檢測(cè)將膠回收得到的UL12基因片段與pMD_19T載體連接，構(gòu)建成重組 PMD19T載體，瓊脂糖凝膠電泳并測(cè)序檢驗(yàn)擴(kuò)增得到的UL12基因片段。
結(jié)果如圖2、圖3和圖4。圖2顯示凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的DNA片段大約為1.9kb，與已知UL12基因片段大小相同。圖3為核苷酸序列測(cè)序的彩色波形圖，證明通過(guò)1所示引物 2所示引物Ιμ Ιμ Ιμ 12.5μ1 2μ1 0.25μ1 7.25μ1本發(fā)明方法擴(kuò)增得到了核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12基因片段。圖4為本發(fā)明擴(kuò)增得到的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12基因片段序列與標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際株UL12基因片段序列對(duì)比結(jié)果，從圖4可知，核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12實(shí)測(cè)序列與核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的UL12標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際株序列的同源性為1866/1881 = 99. 20%，證明本發(fā)明準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增了 UL12目的基因片段。
實(shí)施例3堿性核酸酶的表達(dá)
(1)重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
將實(shí)施例1或者實(shí)施例2得到的UL12基因片段在EcoRI、HindIII內(nèi)切酶作用下與pET28a(+)質(zhì)?；蛘遬ET3h(+)連接形成pET28a_UL12重組表達(dá)質(zhì)?；蛘遬ET3h_UL12 重組表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，控制蛋白的表達(dá)，并包含有2個(gè) His標(biāo)簽，可以用來(lái)純化蛋白。
(2)重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)
將步驟(1)得到的pET28a_UL12重組表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至E. coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)于含有50 μ g/ml卡拉霉素的LB培養(yǎng)板上，220r/min振搖過(guò)夜；
挑取獲得重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌克??；
將大腸桿菌克隆直接接種到50ml含有50 μ g/ml卡拉霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C 搖瓶培養(yǎng)，直到0D600值為0. 4 0. 6 ；
加入終濃度為0. 5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在37°C搖瓶1 10小時(shí)后，離心收集菌體。
(3)重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)
將步驟(1)得到的pET3h_UL12重組表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至 E. coliRosetta感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)于含有30 μ g/ml氨芐青霉素和34 μ g/ml的氯霉素 LB培養(yǎng)板上，220r/min振搖過(guò)夜培養(yǎng)；
挑取獲得重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌克?。?br>
將大腸桿菌克隆直接接種到50ml含有30 μ g/ml氨芐青霉素和34 μ g/ml的氯霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C搖瓶培養(yǎng)，直到OD6tltl值為0. 4 0. 6 ；
加入終濃度為0. 5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在37°C搖瓶1 10小時(shí)后，離心收集菌體。
將誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5顯示，泳道3 8中目的蛋白條帶依次減弱，也就是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的減少，其蛋白表達(dá)量逐漸降低。因此，確定最優(yōu)的誘導(dǎo)時(shí)間為 IOh0
蛋白存在形式的鑒定
將步驟( 或者C3)所得菌體，加500 μ 1 PBS溶液重懸，50 μ 1菌液留樣，其余菌液進(jìn)行超聲破碎(3min，400w)，冷凍離心，12000rmp, 15min)，分別收集上清和沉淀，沉淀用PBS重懸。菌液留樣、上清和沉淀各加等體積2XSDS加樣緩沖液，100°C加熱5min變性，取樣用12% SDS-PAGE檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白存在于包涵體中。結(jié)果如圖6和圖7所示。 已知堿性核酸酶大小為86kDa，圖6顯示pET3h-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子表達(dá)結(jié)果；圖 7顯示pEI^8a-UL12的E. coliBL21轉(zhuǎn)化子表達(dá)結(jié)果。
圖6泳道1顯示pET3^i-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白； 泳道6顯示IPTG誘導(dǎo)后pET3h-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后的上清；泳道8 顯示pET3h-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀(包涵體)。泳道1和泳道8中有大小為86kD的目的條帶，而在其他泳道則沒(méi)有。結(jié)果證明，目的蛋白存在于重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌液和經(jīng)超聲裂解后的沉淀中，也就是說(shuō)，目的蛋白以包涵體的形式存在，用Bio-Rad公司提供的Quantity One圖像分析軟件對(duì)圖6第1泳道的目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析，目標(biāo)蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的17.4% .
圖7泳道3顯示pET28a_UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白； 泳道5顯示pET28a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀(包涵體)；泳道7顯示pET28a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的上清。泳道3和泳道5中有大小為86kD的目的條帶，而在其他泳道則沒(méi)有。結(jié)果證明，目的蛋白存在于重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌液和經(jīng)超聲裂解后的沉淀中，也就是說(shuō)，目的蛋白以包涵體的形式存在，用Bio-Rad公司提供的Quantity One圖像分析軟件對(duì)圖7第3泳道的目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析，目標(biāo)蛋白表達(dá)量占總表達(dá)量以上。
(4)變性
1)將步驟(2)或者(3)所得菌體用 5ml 洗滌液 A(50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl)洗兩次；
2) 4°C下，收集細(xì)菌在冰浴上經(jīng)過(guò)^iin超聲處理，破碎細(xì)胞，得到菌液；
3)4°C 下，用 5ml 洗滌液 B(50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaClU % NP40,即乳化劑NP40系列)的超聲洗滌菌液；
4)4°C下，12000rpm 離心 15min，收集沉淀；
5)4 °C 下，用 5ml 洗滌液 C(50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmMNaCl,3 % TritonX-IOOUmM PMSF，即甲基磺酰氟)超聲洗滌沉淀；
6) 12000rpm 離心 15min，收集沉淀；
7)4°C 下，用 5ml 洗滌液 D(50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmMNaCl.O. 5 % TritonX-lOOU. 5M鹽酸胍和ImM PMSF)超聲洗滌沉淀；
8) 12000rpm 離心 15min，收集沉淀；
9)用 5ml 洗滌液 E(4M 或者 6M 鹽酸胍、IOOmM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mMEDTA、IOOmM NaCl、10mM β巰基乙醇、和ImM PMSF)洗滌沉淀；
10)收集上清在_80°C保存，蛋白質(zhì)濃度用Bio-Rad分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。
變性最優(yōu)條件如圖8所示，當(dāng)洗滌液E中的鹽酸胍濃度為4M時(shí)，處理后的沉淀幾乎沒(méi)有目標(biāo)蛋白，目標(biāo)蛋白溶于洗滌液，非常有利于復(fù)性。
(5)復(fù)性
取ImL步驟(4)變性得到的目標(biāo)蛋白的溶液，用復(fù)性液(50mMTris-HCl [pH8. 0]、 2mM EDTA、50Mm NaCl、5%甘油、1 %甘氨酸和濃度遞減的鹽酸胍，鹽酸胍的濃度依次為4M、 3M、2M、1M和0M)將其稀釋到0. l_lmg/ml，在透析袋中復(fù)性，復(fù)性時(shí)間為Mh，最后用超濾管 (4500rpm, IOmin,4°C )離心收集復(fù)性蛋白溶液，放置_20°C冰箱保存。
二、蛋白檢驗(yàn)
1、氨基酸序列比對(duì)
通過(guò)計(jì)算，上述目標(biāo)蛋白的氨基酸序列與GenBank公布的HSV-I堿性核酸酶的氨基酸序列比對(duì)如下(上面一排為標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際株序列，下面一排為目標(biāo)蛋白的氨基酸序列，下劃線部分表示氨基酸變異部分)
1 MESTVGPACPPGRTVTKRPWALAEDTPRGPDSPPKRPRPNSLPLTTTFRPLPPPPQTTSAllllllllllllllllll. IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII1 MESTVGPACPPGRTVTKRSWALAEDTPRGPDSPPKRPRPNSLPLTTTFRPLPPPPQTTSA61 VDPSSHSPDNPPRDQHATDTADEKPRAASPALSDASGPPTPDIPLSPGGTHARDPDADPDIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII61 VDPSSHSPDNPPRDQHATDTADEKPRAASPALSDASGPPTPDIPLSPGGTHARDPDADPD121 SPDLDSMWSASVIPNALPSHILAETFERHLRGLLRGVRAPLAIGPLWARLDYLCSLDVVLlllllllll. Illlllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll. Il121 SPDLDSMWSTSVIPNALPSHILAETFERHLRGLLRGVRAPLAIGPLWARLDYLCSLAVVL181 EEAGMVDRGLGRHLWRLTRRGPPAAADAVAPRPLMGFYEAATQNQADCQLWALLRRGLTTI I I I I I I I I I I ι ι ι ι I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I181 EEAGMVDRGLGRHLWRLTRRGPPAAADAVAPRPLMGFYEAATQNQADCQLWALLRRGLTT241 ASTLRWGPQGPCFSPQWLKHNASLRPDVQSSAVMFGRVNEPTARSLLFRYCVGRADDGGEI I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I241 ASTLRWGPQGPCFSPQWLKHNASLRPDVQSSAVMFGRVNEPTARSLLFRYCVGRADDGGE301 AGADTRRFIFHEPSDLAEENVHTCGVLMDGHTGMVGASLDILVCPRDIHGYLAPVPKTPLIlllllllllllhllllllllllllllllllllllll :||||||. IIIIIIIIIII301 AGADTRRFIFHEPGDLAEENVHTCGVLMDGHTGMVGASLGILVCPRDTHGYLAPVPKTPL361 AFYEVKCRAKYAFDPMDPSDPTASAYEDLMAHRSPEAFRAFIRSIPKPSVRYFAPGRVPGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII :llllllllllllllllllll361 AFYEVKCRAKYAFDPMDPSDPTASAYEDLMAHRSPEALRAFIRSIPKPSVRYFAPGRVPG421 PEEALVTQDQAffSEAHASGEKRRCSAADRALVELNSGVVSEVLLFGAPDLGRHTISPVSffIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII =IIIII421 PEEALVTQDQAffSEAHASGEKRRCSAADRALVELNSGVVSEVLLFGAPDLGRQTISPVSff481 SSGDLVRREPVFANPRHPNFKQILVQGYVLDSHFPDCPPHPHLVTFIGRHRTSAEEGVTFI I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I481 SSGDLVRREPVFANPRHPNFKQILVQGYVLDSHFPDCPPHPHLVTFIGRHRTSAEEGVTF541 RLEDGAGALGAAGPSKASILPNQAVPIALIITPVRIDPEIYKAIQRSSRLAFDDTLAELffI I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I541 RLEDGAGALGAAGPSKASILPNQAVPIAL11TPVRIDPEIYKAIQRSSRLAFDDTLAELff601 ASRSPGSGPAAAETTSSSPTTGRSSRMINI, llllllllllllllllll601 ASRSPGPGPAAAETTSSSPTTGRSSR目標(biāo)蛋白的氨基酸序列與GenBank公布的HSV-I堿性核酸酶氨基酸序列相似度為 98. 56%(617/6 )，變異程度為1.44% (9/6 )，經(jīng)進(jìn)一歩計(jì)算，上述變異不在蛋白結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位點(diǎn)，對(duì)蛋白活性影響不大。2、活力檢測(cè)取制備得到的復(fù)性蛋白溶液稀釋到0. 12mg/ml，用pcDNA3. 0質(zhì)粒、pcDNA3. 1質(zhì)?；蛘呔€性UL12基因片段作為底物，進(jìn)行酶活性測(cè)定。
反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增單純皰疹病毒I型堿性核酸酶基因片段UL12的試劑盒，其特征在于 它包含核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物對(duì)和其他相關(guān)試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于還包含T載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述T載體為pMD19-T載體。
4.一種制備單純皰疹病毒I型堿性核酸酶的方法，其特征在于包括如下步驟(1)擴(kuò)增目的基因提取單純皰疹病毒I型病毒基因組作為模板，以SEQID NO :1 2 所示的核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-I的UL12基因片段，擴(kuò)增程序?yàn)?6°C預(yù)變性3min， 95°C變性40s，68°C 72°C退火延伸anin30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ；膠回收擴(kuò)增的 UL12基因片段；(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒將獲得的UL12基因片段與表達(dá)質(zhì)粒連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒；(3)誘導(dǎo)表達(dá)將步驟( 獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌；培養(yǎng)含有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌使其復(fù)制至處于對(duì)數(shù)期；加入異丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)；離心收集菌體；(4)變性破碎步驟C3)獲得的菌體，離心收集沉淀，用包含變性劑的洗滌液洗滌沉淀， 獲得蛋白溶液；(5)復(fù)性用復(fù)性液復(fù)性步驟(4)獲得的蛋白溶液，獲得活性蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟⑴所述擴(kuò)增目的基因的方法為提取單純皰疹病毒I型病毒基因組作為模板，以SEQ IDNO 1 2所示的核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-I的UL12基因片段，擴(kuò)增程序?yàn)?6°C預(yù)變性3min，95°C變性40s，68°C 72°C 退火延伸anin30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ；膠回收擴(kuò)增的UL12基因片段；將擴(kuò)增得到的UL12基因片段與T載體連接形成重組T載體，再以該重組T載體為模板，以SEQ ID NO 1 2所示的核苷酸序列作為引物進(jìn)一步擴(kuò)增得到核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12 目的基因片段，擴(kuò)增條件不變。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或者5所述的方法，其特征在于所述步驟(1)所述退火、延伸溫度均為680C ο
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟O)中表達(dá)質(zhì)粒為pET系列質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述表達(dá)質(zhì)粒為pET3h-UL12或者 pET28a-UL12 質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中大腸桿菌為E.coli BL12 菌株，或者為E.coli Rosetta菌株。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟中變性采用的方法為用洗滌液A兩次洗滌步驟C3)獲得的菌體；冷凍超聲破碎菌體，離心收集沉淀；用洗滌液B、C、D依次洗滌、離心、收集沉淀；用洗滌液E洗滌沉淀，獲得蛋白溶液；所述的洗滌液 A 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmMNaCl 的溶液；洗滌液 B 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl U % NP40 的溶液；洗滌液 C:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl,3% TritonX-IOOUmM 苯甲基磺酰氟的溶液；洗滌液 D:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、0. 5 % TritonX-100、·1. 5M鹽酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗滌液E 包含 IOOmM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、IOmM β -巰基乙醇、ImM 苯甲基磺酰氟和4 6Μ鹽酸胍的溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述洗滌液E中鹽酸胍濃度為4Μ。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟(5)中復(fù)性液為包含50mM Tris-HCl [pH8.0]、2mM EDTA、50mM NaCl、5%甘油、1 %甘氨酸和鹽酸胍濃度逐步減小的溶液，所述鹽酸胍濃度依次為4M、3M、2M、1M和0M。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增單純皰疹病毒I型堿性核酸酶基因片段UL12的試劑盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO1～2所示的引物對(duì)和其他相關(guān)試劑。本發(fā)明還提供一種使用前述試劑盒制備的HSV-1堿性核酸酶的方法。本發(fā)明以基因工程的方法獲得大量生物性活性較高的HSV-1堿性核酸酶，為進(jìn)一步尋找抗病毒藥物以及闡明藥物作用機(jī)制有十分重要的意義，也體外構(gòu)建HSV-1堿性核酸酶的藥物篩選分子模型奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102533726SQ20111031615
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者代富英, 張磊, 曹康, 郭洪秀, 陳恬 申請(qǐng)人:成都醫(yī)學(xué)院