專利名稱：大豆胞囊線蟲rna解旋酶cgh-1及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大豆胞囊線蟲RNA解旋酶CGH-I及其編碼基因與應用。
背景技術(shù)：
大豆起源于中國，是人類蛋白和食用油的重要來源，全世界食用油的31%來自大豆。我國是大豆消費大國，年消費總量超過4000萬噸，而國內(nèi)大豆年總產(chǎn)量卻只有不足 1700萬噸。因此，必須依靠大量進口來填補空缺。我國大豆生產(chǎn)的主要問題是單產(chǎn)低，2008 年平均單產(chǎn)只有114公斤/畝，僅為世界平均單產(chǎn)的70%，與美國等先進國家相比差距更大。造成我國大豆產(chǎn)量低的原因除了品種和種植等問題外，病蟲害是重要原因。大豆胞囊線蟲病是世界范圍內(nèi)對大豆生產(chǎn)危害最為嚴重的病蟲害之一。在我國， 大豆胞囊線蟲病是僅次于大豆花葉病毒病的第二大病害，它主要分布于東北和黃淮兩個大豆主產(chǎn)區(qū)。其中尤以多年連作區(qū)和干旱及沙堿老豆區(qū)最為嚴重。大豆受胞囊線蟲病侵害后， 輕者減產(chǎn)20 % 30 %，嚴重者減產(chǎn)達70 % 80 %，更為甚者會發(fā)生大面積種植地的絕收。 大豆胞囊線蟲病由胞囊線蟲(Heterodera glycines, Soybean cyst nematode, SCN)弓丨起， 在大豆整個生長過程中均可發(fā)生。胞囊線蟲寄生于大豆根上，導致主根和側(cè)根發(fā)育不良，須根增多，整個根系呈須發(fā)狀。須根上著生白色至黃白色的大小約0.5毫米的凸起，為線蟲的胞囊。受害植株病根的根瘤很少或不結(jié)瘤；地上部分生長遲緩，幼苗期子葉及真葉變黃大； 重病苗生長停止，乃至死亡。受害植株一般表現(xiàn)為矮小，葉片發(fā)黃，花芽簇生，節(jié)間縮短，開花期延遲，結(jié)莢少或不能結(jié)莢。有鑒于此，胞囊線蟲病的防治是大豆生產(chǎn)所長期面臨的艱巨任務。使用高毒性的殺蟲劑如DDT、呋喃丹、涕滅威等雖然可以殺死線蟲，但會造成嚴重的環(huán)境污染，因而已被禁用或限制使用。利用傳統(tǒng)的育種程序培育大豆抗性品種遇到的問題是回交程序煩瑣，抗性鑒定復雜。通過回交育種方法選育一個品種，至少需要十年時間，大大地限制了抗大豆胞囊線蟲新品種的選育。RNA干擾技術(shù)(RNAi)的出現(xiàn)使通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得具有廣譜抗胞囊線蟲的高產(chǎn)大豆品種及其它作物品種成為可能。RNAi現(xiàn)象最先發(fā)現(xiàn)于植物中并在非寄生性線蟲-秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)中得以揭示，隨后在植物、果蠅和脊椎動物中動物中被進一步證實。秀麗線蟲在攝入含dsRNA的大腸桿菌后，在其腸道中消化，其中的dsRNA可被吸收并在細胞間傳遞，到達大部分組織和細胞中，造成靶基因所編碼mRNA的特異性降解，從而影響目的基因的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆胞囊線蟲RNA解旋酶CGH-I及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines, Soybean cyst nematode),是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與大豆胞囊線蟲發(fā)育相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與大豆胞囊線蟲發(fā)育相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)至4)中任一所述的DNA 分子1)序列表的序列2自5，末端第499至1839核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼大豆胞囊線蟲發(fā)育相關(guān)蛋白的 DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼大豆胞囊線蟲發(fā)育相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.含有雙鏈DNA片段A和雙鏈DNA片段B的重組質(zhì)粒；所述雙鏈DNA片段B與所述雙鏈DNA片段A為反向互補序列；所述雙鏈DNA片段A如序列2的序列2自5’末端523至 1090位核苷酸所示。
6.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒是在載體pZHOl的不同多克隆位點分別插入所述雙鏈DNA片段A和所述DNA片段B得到的重組質(zhì)粒。
7.如權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒為在骨架載體pZHOl的 Xba I和Sal I酶切位點之間插入所述雙鏈DNA片段A、Kpn I和Sac I酶切位點之間插入所述雙鏈DNA片段B得到的重組質(zhì)粒。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求5至7中任一所述重組質(zhì)粒導入目的植物中，得到大豆胞囊線蟲抗性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物； 所述雙子葉植物優(yōu)選為大豆。
10.權(quán)利要求1所述蛋白，或權(quán)利要求2或3所述基因，或權(quán)利要求4所述重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌，或權(quán)利要求5至7中任一所述重組質(zhì)粒在培育抗大豆胞囊線蟲植物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆胞囊線蟲RNA解旋酶CGH-1及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與大豆胞囊線蟲發(fā)育相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了大豆胞囊線蟲RNA解旋酶CGH-1及其編碼基因，并基于該編碼基因設(shè)計了RNAi表達載體，將該RNAi表達載體導入植物，可在植物中所述基因的dsRNA，當病蟲在攝入轉(zhuǎn)基因植物后，生殖或發(fā)育產(chǎn)生嚴重障礙，從而抑制病蟲的侵染和傳播。通過本發(fā)明的方法可以獲得具有很強抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因植物，為進一步培育廣譜抗蟲性的大豆新品種奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/52GK102382804SQ20111031755
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者張勁松, 李海潮, 李金英, 李錦錦, 楊崇林, 王昉, 荊玉棟, 蹇友理, 陳受宜 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所