專利名稱：多菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用細(xì)胞固定化技術(shù)連續(xù)制醋的方法。
背景技術(shù)：
食醋是我國(guó)傳統(tǒng)的重要釀造調(diào)味品，大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)均采用傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵法釀造食醋，固態(tài)發(fā)酵工藝的產(chǎn)品風(fēng)味、口感、品質(zhì)較好，但存在衛(wèi)生條件差、原料利用率較低、勞動(dòng)強(qiáng)度大等缺點(diǎn)，生產(chǎn)工藝中淀粉轉(zhuǎn)化率、糖酸轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)酸率均相對(duì)較低。與傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)相比較，細(xì)胞固定化發(fā)酵具有以下特出優(yōu)點(diǎn)
①方法簡(jiǎn)便，將細(xì)胞與單體或聚合物一起聚凝，細(xì)胞被包埋在形成的聚合物之中；② 條件溫和，可選用不同的聚合物載體，不同的包埋系統(tǒng)和條件，以保持細(xì)胞的酶催化活性； ③細(xì)胞不易滲漏，穩(wěn)定性好；④細(xì)胞密度高，有較高的細(xì)胞容量，聚合體中的細(xì)胞含量可達(dá)50% 70% ；⑤固定化的細(xì)胞可以多批次使用。現(xiàn)有的細(xì)胞固定化技術(shù)在理論方面研究的多、生產(chǎn)實(shí)踐中用的少；很多研究也是局限于單一菌種的固定化。食醋釀造工藝涉及3種主要的微生物類群和相關(guān)技術(shù)過程黑曲霉將淀粉轉(zhuǎn)化為糖類，酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為酒精，醋酸桿菌將酒精轉(zhuǎn)化為醋酸。在食醋釀造行業(yè)只有零星的研究涉及醋酸桿菌細(xì)胞固定化，這不能改變傳統(tǒng)食醋釀造的面貌。因?yàn)椴捎霉潭ɑ姿釛U菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵，還需要采用傳統(tǒng)的工藝將糧食等淀粉類原材料轉(zhuǎn)化為糖類，再采用酵母菌將糖類轉(zhuǎn)化為酒精，只有獲得酒精，才能進(jìn)入固定化醋酸桿菌發(fā)酵階段。 因此將食醋釀造相關(guān)微生物分別固定化，進(jìn)而構(gòu)建固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵技術(shù)，為釀造行業(yè)提供先進(jìn)的發(fā)酵技術(shù)，將會(huì)改變食醋行業(yè)的生產(chǎn)面貌，提高企業(yè)生產(chǎn)效率，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模， 增加企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)釀造行業(yè)的技術(shù)進(jìn)步。

發(fā)明內(nèi)容
為改變傳統(tǒng)食醋釀造的落后面貌，采用細(xì)胞固定化技術(shù)將食醋釀造相關(guān)微生物菌株固定，構(gòu)建固定化細(xì)胞發(fā)酵器，將固定化細(xì)胞發(fā)酵器串聯(lián)形成固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵技術(shù)。具體操作方法如下
1、二個(gè)菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法，具體操作步驟如下 1.1、菌株培養(yǎng)
所用菌株為A菌株和B菌株；
A菌株為釀酒酵母feccAarofflj^^s cerevisiae 1001菌株，可將糖類轉(zhuǎn)化為酒精； B 菌株為巴氏醋桿菌巴氏亞禾中Jcetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可將酒精轉(zhuǎn)化為醋酸；
1. 1. 1、A菌株的培養(yǎng)，將釀酒酵母斜面菌種接種至釀酒酵母培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速 80 150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)M 48h，使釀酒酵母培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞濃度達(dá)到5. OX IO7/ mL 1. 0 X IOVmL,得到A菌株菌液；
釀酒酵母培養(yǎng)基配方5° Β 麥芽汁，121°C高壓滅菌20分鐘；1. 1.2、B菌株的培養(yǎng)，將巴氏醋桿菌巴氏亞種斜面菌種接種至醋桿菌培養(yǎng)基，溫度 30°C、轉(zhuǎn)速8(Γ150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24、8h，使醋桿菌培養(yǎng)基中的巴氏醋桿菌細(xì)胞濃度達(dá)到 5. OX 107/mL 5. 0 X lOVmL,得到 B 菌株菌液；
醋桿菌培養(yǎng)基配方3° Β 麥芽汁，硫酸鎂0. 2%，酵母膏0. 5%，磷酸二氫鉀0. 3%，葡萄糖2%，121°C高壓滅菌20分鐘，滅菌后加95%酒精2 3%混勻；
1.2、菌株的固定化
1. 2. 1、細(xì)胞的離心洗滌取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分別在轉(zhuǎn)速為5000 10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心分離10 15分鐘，傾去上清液，用0. 85%生理鹽水懸浮細(xì)胞， 完成一次細(xì)胞的離心洗滌；再重復(fù)2次細(xì)胞的離心洗滌，制得A菌株細(xì)胞懸液和B菌株細(xì)胞懸液；
1. 2. 2、取A菌株細(xì)胞懸液50mL和B菌株細(xì)胞懸液50mL，與濃度 5%的固定化載體溶液按體積比1: 1 4的比例混合均勻，成型造粒，固定化細(xì)胞顆粒直徑2 5mm，室溫固化2 6小時(shí)，置于4°C冰箱中，12小時(shí)平衡，傾去上清液，加入無菌水洗滌3次；分別制得A菌株固定化細(xì)胞顆粒和B菌株固定化細(xì)胞顆粒，置于冰箱中備用；
所述固定化載體溶液中載體為瓊脂或殼聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶劑為水；
1.3、固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵制醋
1. 3. 1、取IOOg 500g的A菌株固定化細(xì)胞顆粒和IOOg 500g的B菌株固定化細(xì)胞顆粒，分別置于容器中，盛有A菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為A容器，盛有B菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為B容器；A容器的進(jìn)口和B容器的進(jìn)口均位于容器上部，A容器的出口和B 容器的出口均位于容器下部；
1.3. 2、A容器的出口連通著B容器的進(jìn)口 ；常溫下，通過進(jìn)口向A容器中連續(xù)注入 2% 6%的蔗糖溶液，控制流速為10 IOOmL/小時(shí)，收集B容器出口流出的發(fā)酵液；1 3天平衡后即可由B容器出口連續(xù)得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量為1. 0 4. 0%。
2、三個(gè)菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法，具體操作步驟如下
2.1、菌株培養(yǎng)
所用菌株為A菌株、B菌株和C菌株；
A菌株為釀酒酵母feccAarofflj^M cerevisiae 1001菌株，可將糖類轉(zhuǎn)化為酒精； B 菌株為巴氏醋桿菌巴氏亞禾中Jcetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可將酒精轉(zhuǎn)化為醋酸；
C菌株為黑曲霉變種Aspar識(shí)7ΛΛ5 niger var 2244菌株，可將淀粉轉(zhuǎn)化為糖類； 2. 1. 1、A菌株的培養(yǎng)，將釀酒酵母斜面菌種接種至釀酒酵母培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速 80 150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24 48h，使釀酒酵母培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞濃度達(dá)到5. OX IO7/ mL 1. 0 X IOVmL,得到A菌株菌液；
釀酒酵母培養(yǎng)基配方5° Β 麥芽汁，121°C高壓滅菌20分鐘； 2. 1.2、B菌株的培養(yǎng)，將巴氏醋桿菌巴氏亞種斜面菌種接種至醋桿菌培養(yǎng)基，溫度 30°C、轉(zhuǎn)速80 150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24 48h，使醋桿菌培養(yǎng)基中的巴氏醋桿菌細(xì)胞濃度達(dá)到5. 0 X 107/mL 5. 0 X lOVmL,得到B菌株菌液；
醋桿菌培養(yǎng)基配方3° Β 麥芽汁，硫酸鎂0. 2%，酵母膏0. 5%，磷酸二氫鉀0. 3%，葡萄糖2%，121°C高壓滅菌20分鐘，滅菌后加95%酒精2 3%混勻；2. 1.3、C菌株的培養(yǎng)，將黑曲霉變種接種至黑曲霉培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速80 150 轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)24 48他，使黑曲霉培養(yǎng)基中黑曲霉變種孢子濃度達(dá)到5. OX IO7AiL 5. 0X108/mL，得到C菌株菌液；
黑曲霉培養(yǎng)基配方蔗糖3%，硝酸鈉0. 2%，硫酸鎂0. 05%,氯化鉀0. 05%,磷酸氫二鉀
0.1%，硫酸亞鐵0. 001%, 121 °C高壓滅菌20分鐘；
2. 2、菌株的固定化
2. 2. 1、細(xì)胞的離心洗滌取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL、C菌株菌液50mL，分別在轉(zhuǎn)速為5000 10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心分離10 15分鐘，傾去上清液，用0. 85%生理鹽水懸浮細(xì)胞，完成一次細(xì)胞的離心洗滌；再重復(fù)2次細(xì)胞的離心洗滌，制得A菌株細(xì)胞懸液、B菌株細(xì)胞懸液和C菌株細(xì)胞懸液；
2. 2. 2、取A菌株細(xì)胞懸液50mL、B菌株細(xì)胞懸液50mL和C菌株細(xì)胞懸液50mL，與濃度 5%的固定化載體溶液按體積比1: 1 4的比例混合均勻后，成型造粒，固定化細(xì)胞顆粒直徑2 5mm，室溫固化2 6小時(shí)，置于4°C冰箱中，12小時(shí)平衡，傾去上清液，加入無菌水洗滌3次；分別制得A菌株固定化細(xì)胞顆粒、B菌株固定化細(xì)胞顆粒和C菌株固定化細(xì)胞顆粒，置于冰箱中備用；
所述的固定化載體溶液中載體為瓊脂或殼聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶劑為水； 2. 3、固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵制醋
2. 3. 1、取IOOg 500g的A菌株固定化細(xì)胞顆粒、IOOg 500g的B菌株固定化細(xì)胞顆粒和IOOg 500g的C菌株固定化細(xì)胞顆粒分別置于容器中，盛有A菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為A容器，盛有B菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為B容器，盛有C菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為C容器；A容器的進(jìn)口、B容器的進(jìn)口和C容器的進(jìn)口均位于容器的上部，A容器的出口、B容器的出口和C容器的出口均位于容器的下部；
2.3.2、C容器的出口連通著A容器的進(jìn)口 ；A容器的出口連通著B容器的進(jìn)口 ；常溫下，通過進(jìn)口向C容器中連續(xù)注入2% 6%的淀粉溶液，控制流速為10 IOOmL/小時(shí)，收集B容器出口流出的發(fā)酵液；10 18小時(shí)平衡后即可由B容器出口連續(xù)得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量為1.0 4.0%。在菌株的固定化步驟的第2步中取A菌株細(xì)胞懸液50mL和B菌株細(xì)胞懸液50mL， 與濃度1 % 5 %的海藻酸鈉溶液按體積比1 1 4的比例混合均勻，滴入濃度0. 5 %
1.5%的氯化鈣(CaCl2)溶液，自然成型造粒；所述海藻酸鈉溶液為固定化載體溶液。在菌株的固定化步驟的第2步中取A菌株細(xì)胞懸液50mL、B菌株細(xì)胞懸液50mL和 C菌株細(xì)胞懸液50mL，與濃度1 % 5 %的海藻酸鈉溶液按體積比1 1 4的比例混合均勻，滴入濃度0. 5% 1. 5%的氯化鈣(CaCl2)溶液，自然成型造粒；所述海藻酸鈉溶液為固定化載體溶液。本發(fā)明使用的菌種釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株、巴氏醋桿菌巴氏亞禾1IMeeic^aeier pasteurianus subsp. pasteurianus 7015 菌株禾口黑曲霄變種 Aspergillus niger var 2244菌株均自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心獲得。本發(fā)明的有益技術(shù)效果如下
1、采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)進(jìn)行食醋的生產(chǎn)，徹底改變傳統(tǒng)食醋釀造工藝，實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控生產(chǎn)工藝參數(shù)的目標(biāo)；2、改變傳統(tǒng)釀造工藝臟亂差的落后生產(chǎn)環(huán)境，降低工人勞動(dòng)強(qiáng)度；
3、提高原材料的利用率，提高生產(chǎn)效率。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。實(shí)施例1 固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋
本例采用二個(gè)菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法，具體操作步驟如下
1、菌株培養(yǎng)，所用菌株為A菌株和B菌株；
A菌株為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株，可將糖類轉(zhuǎn)化為酒精； B 菌株為巴氏醋桿菌巴氏亞禾中Jcetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可將酒精轉(zhuǎn)化為醋酸；
A菌株的培養(yǎng)，將釀酒酵母斜面菌種接種至釀酒酵母培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/ 分鐘，培養(yǎng)Mh，使釀酒酵母培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞濃度達(dá)到5. OX 107mL，得到A菌株菌液； 釀酒酵母培養(yǎng)基配方5° Β 麥芽汁，121°C高壓滅菌20分鐘； B菌株的培養(yǎng)，將巴氏醋桿菌巴氏亞種斜面菌種接種至醋桿菌培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速 150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)Mh，使醋桿菌培養(yǎng)基中的巴氏醋桿菌細(xì)胞濃度達(dá)到5. OX 108/mL，得到 B菌株菌液；
醋桿菌培養(yǎng)基配方3° Β 麥芽汁，硫酸鎂0. 2%，酵母膏0. 5%，磷酸二氫鉀0. 3%，葡萄糖2%，121°C高壓滅菌20分鐘，滅菌后加95%酒精2. 5%混勻；
2、菌株的固定化
細(xì)胞的離心洗滌取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分別在轉(zhuǎn)速為6000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心分離12分鐘，傾去上清液，用0. 85%生理鹽水懸浮細(xì)胞，完成一次細(xì)胞的離心洗滌；再重復(fù)2次細(xì)胞的離心洗滌，制得A菌株細(xì)胞懸液和B菌株細(xì)胞懸液；
取A菌株細(xì)胞懸液50mL和B菌株細(xì)胞懸液50mL，與溫度50°C、濃度2. 7%的瓊脂IOOmL 混合均勻，冷卻至25°C凝固，切割成直徑4mm固定化細(xì)胞顆粒，室溫固化4小時(shí)，置于4°C冰箱中，12小時(shí)平衡，傾去上清液，加入無菌水洗滌3次；分別制得A菌株固定化細(xì)胞顆粒和B 菌株固定化細(xì)胞顆粒，置于冰箱中備用； 1.3、固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵制醋
取500g的A菌株固定化細(xì)胞顆粒和500g的B菌株固定化細(xì)胞顆粒，分別置于容器中， 盛有A菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為A容器，盛有B菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為B容器； A容器的進(jìn)口和B容器的進(jìn)口均位于容器上部，A容器的出口和B容器的出口均位于容器下部；
A容器的出口連通著B容器的進(jìn)口 ；25°C下，通過進(jìn)口向A容器中連續(xù)注入3%的蔗糖溶液，控制流速為35mL/小時(shí)，收集B容器出口流出的發(fā)酵液小時(shí)平衡后即可由B容器出口連續(xù)得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量為2. 5%。這套固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵裝置連續(xù)運(yùn)行性能穩(wěn)定。實(shí)施例2
二個(gè)菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法，具體操作步驟如下 1、菌株培養(yǎng)所用菌株為A菌株和B菌株；
A菌株為釀酒酵母feccAarofflj^M cerevisiae 1001菌株，可將糖類轉(zhuǎn)化為酒精； B 菌株為巴氏醋桿菌巴氏亞禾中 Jce tobac ter pas teurianus sub sp. pas teurianus 7015菌株，可將酒精轉(zhuǎn)化為醋酸；
A菌株的培養(yǎng)，將釀酒酵母斜面菌種接種至釀酒酵母培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/ 分鐘，培養(yǎng)30h，使釀酒酵母培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞濃度達(dá)到1. 0 X IOVmL,得到A菌株菌液； 釀酒酵母培養(yǎng)基配方5° Β 麥芽汁，121°C高壓滅菌20分鐘； B菌株的培養(yǎng)，將巴氏醋桿菌巴氏亞種斜面菌種接種至醋桿菌培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速 150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24h，使醋桿菌培養(yǎng)基中的巴氏醋桿菌細(xì)胞濃度達(dá)到5. OX 108/mL，得到 B菌株菌液；
醋桿菌培養(yǎng)基配方3° Β 麥芽汁，硫酸鎂0. 2%，酵母膏0. 5%，磷酸二氫鉀0. 3%，葡萄糖2%，121°C高壓滅菌20分鐘，滅菌后加95%酒精2. 5%混勻；
2、菌株的固定化
細(xì)胞的離心洗滌取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分別在轉(zhuǎn)速為6000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心分離15分鐘，傾去上清液，用0. 85%生理鹽水懸浮細(xì)胞，完成一次細(xì)胞的離心洗滌；再重復(fù)2次細(xì)胞的離心洗滌，制得A菌株細(xì)胞懸液和B菌株細(xì)胞懸液；
取A菌株細(xì)胞懸液50mL和B菌株細(xì)胞懸液50mL(分別取多少？)，與濃度2. 8%的海藻酸鈉溶液按體積比1 4的比例混合均勻，移入玻璃注射器中，適度加力，滴入濃度1. 2 %的氯化鈣(CaCl2)溶液，自然成型造粒，固定化細(xì)胞顆粒直徑4. 5mm，室溫固化3小時(shí)，置于4°C 冰箱中，12小時(shí)平衡，傾去溶液，加入無菌水洗滌3次；分別制得A菌株固定化細(xì)胞顆粒和B 菌株固定化細(xì)胞顆粒，置于冰箱中備用；
3、固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵制醋
3. 1、取500g的A菌株固定化細(xì)胞顆粒和B菌株固定化細(xì)胞顆粒，分別置于容器中，盛有A菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為A容器，盛有B菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為B容器；A 容器的進(jìn)口和B容器的進(jìn)口均位于容器上部，A容器的出口和B容器的出口均位于容器下部；
3. 2、A容器的出口連通著B容器的進(jìn)口 ；25°C下，通過進(jìn)口向A容器中連續(xù)注入3%的蔗糖溶液，控制流速為40mL/小時(shí)，收集B容器出口流出的發(fā)酵液；24小時(shí)平衡后即可由B 容器出口連續(xù)得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量為2. 8%。固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵裝置運(yùn)行穩(wěn)定。 實(shí)施例3:
三個(gè)菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法，具體操作步驟如下 1、菌株培養(yǎng)
所用菌株為A菌株、B菌株和C菌株；
A菌株為釀酒酵母feccAarofflj^M cerevisiae 1001菌株，可將糖類轉(zhuǎn)化為酒精； B 菌株為巴氏醋桿菌巴氏亞禾中 Jce tobac ter pas teurianus sub sp. pas teurianus 7015菌株，可將酒精轉(zhuǎn)化為醋酸；
C菌株為黑曲霉變種Aspar識(shí)7ΛΛ5 niger var 2244菌株，可將淀粉轉(zhuǎn)化為糖類； A菌株的培養(yǎng)，將釀酒酵母斜面菌種接種至釀酒酵母培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)30h，使釀酒酵母培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞濃度達(dá)到1. OX 108/mL，得到A菌株菌液； 釀酒酵母培養(yǎng)基配方5° Β 麥芽汁，121°C高壓滅菌20分鐘； B菌株的培養(yǎng)，將巴氏醋桿菌巴氏亞種斜面菌種接種至醋桿菌培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速 150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)Mh，使醋桿菌培養(yǎng)基中的巴氏醋桿菌細(xì)胞濃度達(dá)到5. OX 108/mL，得到 B菌株菌液；
醋桿菌培養(yǎng)基配方3° Β 麥芽汁，硫酸鎂0. 2%，酵母膏0. 5%，磷酸二氫鉀0. 3%，葡萄糖m, 121°C高壓滅菌20分鐘，滅菌后加95%酒精2. 5%混勻；
C菌株的培養(yǎng)，將黑曲霉變種接種至黑曲霉培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速140轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng) 28h,使黑曲霉培養(yǎng)基中黑曲霉變種孢子濃度達(dá)到5. 0 X IOVmL,得到C菌株菌液；
黑曲霉培養(yǎng)基配方蔗糖3%，硝酸鈉0. 2%，硫酸鎂0. 05%,氯化鉀0. 05%,磷酸氫二鉀
0.1%，硫酸亞鐵0. 001%, 121 °C高壓滅菌20分鐘；
2、菌株的固定化
細(xì)胞的離心洗滌取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL、C菌株菌液50mL，分別在轉(zhuǎn)速為6000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心分離15分鐘，傾去上清液，用0. 85%生理鹽水懸浮細(xì)胞，完成一次細(xì)胞的離心洗滌；再重復(fù)2次細(xì)胞的離心洗滌，制得A菌株細(xì)胞懸液、B菌株細(xì)胞懸液和C菌株細(xì)胞懸液；
取A菌株細(xì)胞懸液50mL、B菌株細(xì)胞懸液50mL和C菌株細(xì)胞懸液50mL，與濃度2. 5% 的海藻酸鈉溶液按體積比1:4的比例混合均勻，移入玻璃注射器中，適度加力，滴入濃度
1.2%的氯化鈣(CaCl2)溶液，自然成型造粒，固定化細(xì)胞顆粒直徑5mm，室溫固化4小時(shí)，置于4°C冰箱中，12小時(shí)平衡，傾去溶液，加入無菌水洗滌3次；分別制得A菌株固定化細(xì)胞顆粒和B菌株固定化細(xì)胞顆粒，置于冰箱中備用；
3、固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵制醋
3. 1、取400g的A菌株固定化細(xì)胞顆粒、400g的B菌株固定化細(xì)胞顆粒和400g的C菌株固定化細(xì)胞顆粒，分別置于容器中，盛有A菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為A容器，盛有B 菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為B容器，盛有C菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為C容器；A容器的進(jìn)口、B容器的進(jìn)口和C容器的進(jìn)口均位于容器上部，A容器的出口、B容器的出口和C容器的出口均位于容器下部；
3.2、C容器的出口連通著A容器的進(jìn)口，A容器的出口連通著B容器的進(jìn)口 ；25°C下， 通過進(jìn)口向C容器中連續(xù)注入3%的淀粉溶液，控制流速為32mL/小時(shí)，收集B容器出口流出的發(fā)酵液J4小時(shí)平衡后即可由B容器出口連續(xù)得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量為 3.4%。固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵裝置運(yùn)行性能仍穩(wěn)定。
權(quán)利要求
1.多菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法，其特征在于具體操作步驟如下1.1、菌株培養(yǎng)所用菌株為A菌株和B菌株；ASaccharomyces cerevisiae,BEiKStff lifEiKMft^ceio^acier pasteurianus subsp. pasteurianus ；1. 1. 1、A菌株的培養(yǎng)，將釀酒酵母斜面菌種接種至釀酒酵母培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速 80^150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24 48h，使釀酒酵母培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞濃度達(dá)到5. OX IO7AiL 1.0X109/mL，得到A菌株菌液；1. 1.2、B菌株的培養(yǎng)，將巴氏醋桿菌巴氏亞種斜面菌種接種至醋桿菌培養(yǎng)基，溫度 30°C、轉(zhuǎn)速8(Γ150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24 48h，使醋桿菌培養(yǎng)基中的巴氏醋桿菌細(xì)胞濃度達(dá)到 5. OX 107/mL 5. 0 X lOVmL,得到 B 菌株菌液；1.2、菌株的固定化1. 2. 1、細(xì)胞的離心洗滌取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分別在轉(zhuǎn)速為5000 10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心分離10 15分鐘，傾去上清液，用0. 85%生理鹽水懸浮細(xì)胞， 完成一次細(xì)胞的離心洗滌；再重復(fù)2次細(xì)胞的離心洗滌，制得A菌株細(xì)胞懸液和B菌株細(xì)胞懸液；1. 2. 2、取A菌株細(xì)胞懸液50mL和B菌株細(xì)胞懸液50mL，與濃度 5%的固定化載體溶液按體積比1 1 4的比例混合均勻，成型造粒，固定化細(xì)胞顆粒直徑2 5mm，室溫固化2 6小時(shí)，溫度4°C，12小時(shí)平衡，傾去上清液，加入無菌水洗滌3次；分別制得A菌株固定化細(xì)胞顆粒和B菌株固定化細(xì)胞顆粒；所述固定化載體溶液中載體為瓊脂或殼聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶劑為水；1.3、固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵制醋1. 3. 1、取IOOg 500g的A菌株固定化細(xì)胞顆粒和IOOg 500g的B菌株固定化細(xì)胞顆粒，分別置于容器中，盛有A菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為A容器，盛有B菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為B容器；A容器的進(jìn)口和B容器的進(jìn)口均位于容器上部，A容器的出口和B 容器的出口均位于容器下部；1.3. 2、A容器的出口連通著B容器的進(jìn)口 ；常溫下，通過進(jìn)口向A容器中連續(xù)注入 2 % 6 %的蔗糖溶液，控制流速為10 IOOmL/小時(shí)，收集B容器出口流出的發(fā)酵液；1 3天平衡后即可由B容器出口連續(xù)得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量為1. 0 4. 0%。2.多菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法，其特征在于具體操作步驟如下 2. 1、菌株培養(yǎng)所用菌株為A菌株、B菌株和C菌株； ASaccharomyces cerevisiae,BEiKStff lifEiKMft^ceio^acier pasteurianus subsp. pasteurianus ；C菌株為黑曲霉變種As/^r^iVAAs niger var ；
2. l.UA菌株的培養(yǎng)，將釀酒酵母斜面菌種接種至釀酒酵母培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速 80^150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24 48h，使釀酒酵母培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞濃度達(dá)到5. OX IO7AiL 1.0X109/mL，得到A菌株菌液；2. 1.2、B菌株的培養(yǎng)，將巴氏醋桿菌巴氏亞種斜面菌種接種至醋桿菌培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速8(Γ150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24 48h，使醋桿菌培養(yǎng)基中的巴氏醋桿菌細(xì)胞濃度達(dá)到 5. OX 107/mL 5. 0 X lOVmL,得到 B 菌株菌液；·2. 1. 3、C菌株的培養(yǎng)，將黑曲霉變種接種至黑曲霉培養(yǎng)基，溫度30°C、轉(zhuǎn)速8(Γ150 轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)24 48h，使黑曲霉培養(yǎng)基中黑曲霉變種孢子濃度達(dá)到5. OX IO7AiL 5. O X108/mL，得到C菌株菌液； 2. 2、菌株的固定化·2. 2. 1、細(xì)胞的離心洗滌取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL、C菌株菌液50mL，分別在轉(zhuǎn)速為5000 10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心分離10 15分鐘，傾去上清液，用0. 85%生理鹽水懸浮細(xì)胞，完成一次細(xì)胞的離心洗滌；再重復(fù)2次細(xì)胞的離心洗滌，制得A菌株細(xì)胞懸液、B菌株細(xì)胞懸液和C菌株細(xì)胞懸液；·2. 2. 2、取A菌株細(xì)胞懸液50mL、B菌株細(xì)胞懸液50mL和C菌株細(xì)胞懸液50mL，與濃度 1 % 5 %的固定化載體溶液按體積比1 1 4的比例混合均勻后，成型造粒，固定化細(xì)胞顆粒直徑2 5mm，室溫固化2 6小時(shí)，溫度4°C，12小時(shí)平衡，傾去上清液，加入無菌水洗滌 3次；分別制得A菌株固定化細(xì)胞顆粒、B菌株固定化細(xì)胞顆粒和C菌株固定化細(xì)胞顆粒； 所述的固定化載體溶液中載體為瓊脂或殼聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶劑為水； 2. 3、固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵制醋·2.3. 1、取IOOg 500g的A菌株固定化細(xì)胞顆粒、IOOg 500g的B菌株固定化細(xì)胞顆粒和IOOg 500g的C菌株固定化細(xì)胞顆粒分別置于容器中，盛有A菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為A容器，盛有B菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為B容器，盛有C菌株固定化細(xì)胞顆粒的容器為C容器；A容器的進(jìn)口、B容器的進(jìn)口和C容器的進(jìn)口均位于容器的上部，A容器的出口、B容器的出口和C容器的出口均位于容器的下部；·2.3.2、C容器的出口連通著A容器的進(jìn)口 ；A容器的出口連通著B容器的進(jìn)口 ；常溫下，通過進(jìn)口向C容器中連續(xù)注入2% 6%的淀粉溶液，控制流速為10 IOOmL/小時(shí)，收集B容器出口流出的發(fā)酵液；1 3天平衡后即可由B容器出口連續(xù)得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量為1.0 4.0%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法，其特征在于 在菌株的固定化步驟的第2步中取A菌株細(xì)胞懸液50mL和B菌株細(xì)胞懸液50mL，與濃度 1 % 5 %的海藻酸鈉溶液按體積比1 1 4的比例混合均勻，滴入濃度0. 5 % 1. 5 %的氯化鈣(CaCl2)溶液，自然成型造粒；所述海藻酸鈉溶液為固定化載體溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法，其特征在于 在菌株的固定化步驟的第2步中取A菌株細(xì)胞懸液50mL、B菌株細(xì)胞懸液50mL和C菌株細(xì)胞懸液50mL，與濃度1 % 5 %的海藻酸鈉溶液按體積比1 1 4的比例混合均勻，滴入濃度0.5% 1.5%的氯化鈣(CaCl2)溶液，自然成型造粒；所述海藻酸鈉溶液為固定化載體溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及多菌株固定化細(xì)胞組合物連續(xù)發(fā)酵制醋方法。該方法所用A菌株為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，B菌株為巴氏醋桿菌巴氏亞種Acetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus；具體操作步驟如下1、菌株培養(yǎng)；2、菌株的固定化，分別制得A菌株固定化細(xì)胞顆粒和B菌株固定化細(xì)胞顆粒；3、固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵制醋。本發(fā)明采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)進(jìn)行食醋的生產(chǎn)，徹底改變傳統(tǒng)食醋釀造工藝，實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控生產(chǎn)工藝參數(shù)的目標(biāo)；改變傳統(tǒng)釀造工藝臟亂差的落后生產(chǎn)環(huán)境，降低工人勞動(dòng)強(qiáng)度；提高原材料的利用率，提高生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12N11/08GK102329718SQ20111032070
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者倪敬田, 唐欣昀, 孫樂妮, 常艷, 張建, 曹媛媛, 沈玲, 甘旭華, 章琦, 陳曉琳, 韓國(guó)民 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)