專利名稱：轉(zhuǎn)基因小麥B72-8-11b的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因小麥品系的鑒定方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)抢没蚬こ碳夹g(shù)，將外源基因?qū)胄←溁蛑?，?jīng)過篩選得到的能夠表達(dá)目的基因的小麥。在基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)研究中，需要對經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的幼苗進(jìn)行分子檢測，以淘汰非轉(zhuǎn)化植株。選擇標(biāo)記基因(如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和潮霉素轉(zhuǎn)移酶基因等)和報(bào)告基因(如B2葡萄糖苷酸酶基因和熒光素酶基因等)已被廣泛用于轉(zhuǎn)化植株和組織的篩選，但在某些情況下，這種篩選效果不可靠。PCR是用于此目的檢測的常用技術(shù)之一，具有靈敏、快速的優(yōu)點(diǎn)。對于此技術(shù)的應(yīng)用在于尋找恰當(dāng)?shù)?、特異性?qiáng)的標(biāo)記性基因片段，并以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)相匹配的引物及擴(kuò)增條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供能準(zhǔn)確快速地鑒定轉(zhuǎn)基因小麥B72-8_llb的方法，所述的轉(zhuǎn)基因小麥B72-8-llb的檢測方法，是通過PCR的方法檢測序列為SEQ ID N0:11的基因組件，該基因組件中包括序列為SEQ ID NO: 14的邊緣序列。上述本發(fā)明的方法所述及的PCR擴(kuò)增的引物對是SEQ ID NOS 1/2 B72-F1(SEQ ID NO 1) :ATGATGGAGGGCATTACTTGGGAGTGAAB72-R1(SEQ ID NO 2) :ACCCTGATCCCCAAAGTAAACTCGC。容易理解，采用上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增結(jié)果為陽性，則待測的小麥為轉(zhuǎn)基因小麥B72-8-llb ；如果擴(kuò)增結(jié)果為陰性，則待測的小麥不是轉(zhuǎn)基因小麥B72-8-llb。更為優(yōu)選的技術(shù)方案中，PCR反應(yīng)條件是94°C，lmin，1 個(gè)循環(huán)；980C 10s，55°C 30s，72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C，7min，1 個(gè)循環(huán)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小麥B72-8_llb的檢測方法的最優(yōu)技術(shù)方案是采用50 μ LPCR反應(yīng)體系，其中含有待測樣品DNA，其濃度優(yōu)選5ng/μ L，10XLA PCR BufferII (Mg2+Plus) 5ul，dNTP 各 0. 4mM，堿基序列為 SEQ ID NOS :1 2 的 PCR 引物各 0. 2 μ M，Taq DNA 聚合酶 0. 05U/ul。采用本發(fā)明的方法可以快速、靈敏地實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因小麥B72-8_llb的品系鑒定， 該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，快速準(zhǔn)確。


本發(fā)明附圖3幅，圖1是實(shí)施例1以樣品C基因組DNA為模板擴(kuò)增的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，其中 M 是 DL2，000 DNA Marker ； 1 6 分別是 ubiquitin、NOS、barl、bar2、uidA 和 GAG56D。
圖2是實(shí)施例1以樣品A、B、C基因組DNA為模板擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中Ml 是 λ -Hind III digest, M2 是 DL2, 000 DNA Marker, 1 6 分別是 C-ubiquitin F/ Nos R,C-ubiquitin F/bar Rl,C-ubiquitin F/uidA R,A-ubiquitin F/Nos R,A-ubiquitin F/bar Rl和 A-ubiquitin F/uidA R。 圖3是實(shí)施例1的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M :DL2, 000 DNA Marker。
具體實(shí)施例方式本申請的發(fā)明人經(jīng)過大量研究，成功地克隆出包括轉(zhuǎn)基因小麥B72-8_llb中特異性外源序列的基因組件A，該基因組件A中包括uidA，ubi，IacZ 1Dx5和小麥基因組部分序列。該基因組件A的全序列如SEQ ID N0:11所示。在所獲得的上述基因組件A全序列的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步獲得轉(zhuǎn)基因成分的邊緣序列，即SEQ ID NO :14所示的序列，它位于 SEQ ID NO :11序列的第8213 10384位。針對SEQ ID NO :11所示的基因組件的檢測可以通過PCR來實(shí)現(xiàn)，使用特異性的引物對SEQ ID NOS :1/2在一定條件下擴(kuò)增，如擴(kuò)增出目標(biāo)序列，即可判定所檢測樣品源自轉(zhuǎn)基因小麥B72-8-llb。下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1.轉(zhuǎn)基因小麥特異性基因組件A、B、C全序列及相應(yīng)邊緣序列的獲取

1、轉(zhuǎn)基因樣品基因組DNA提取 分別選取轉(zhuǎn)基因小麥B72-8_llb、轉(zhuǎn)基因小麥B73_6_l和轉(zhuǎn)基因小麥B102_l_2， 分別標(biāo)記為樣品A、樣品B和樣品C。各個(gè)樣品粉碎后在液氮中研成細(xì)末，然后使用DNA Extraction Kit for GMO Detection Ver. 2. 0 (TaKaRa Code No. D9093)進(jìn)行基因組DNA提取。以1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質(zhì)量，并使用超微量分光光度計(jì)(Nanodrop) 對檢測樣品基因組DNA質(zhì)量和濃度，檢測結(jié)果顯示基因組DNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，樣品 A、B 和 C 的平均基因組 DNA 濃度是 162. 69ng/ μ L、125. 80ng/ μ L、203. 75ng/ μ L，也符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。2、轉(zhuǎn)基因小麥特異性基因組件A、B、C全序列獲取以及元件分析(1)根據(jù)從GenBank獲取的小麥內(nèi)、外源基因相關(guān)信息設(shè)計(jì)引物如表1所示表1定性PCR檢測小麥內(nèi)源基因、外源基因所需的引物序列
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因小麥B72-8-1Ib的檢測方法，是通過PCR的方法檢測序列為SEQ IDN0:11的基因組件，該基因組件中包括序列為SEQ ID N0:14的邊緣序列。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增的引物對是SEQIDNOS 1/20
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的PCR反應(yīng)條件是 94°C，Imin，1 個(gè)循環(huán)；980C 10s，55°C 30s, 72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)； 72°C，7min，l 個(gè)循環(huán)。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的PCR反應(yīng)體系為50μ L體系，含有待測樣品 DNA 5ng/y L, 10XLA PCR BufferII (Mg2+Plus) 5ul，dNTP 各 0. 4mM，引物對各 0. 2 μ M， Taq DNA 聚合酶 0. 05U/ul。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)基因小麥B72-8-11b的檢測方法，是通過PCR的方法檢測序列為SEQ IDNO11的基因組件，該基因組件中包括序列為SEQ ID NO14的邊緣序列。采用本發(fā)明的方法可以快速、靈敏地實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因小麥B72-8-11b的品系鑒定，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，快速準(zhǔn)確。
文檔編號C12Q1/68GK102344964SQ20111032146
公開日2012年2月8日 申請日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者徐君怡, 曹際娟 申請人:徐君怡, 曹際娟