專利名稱：以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)活菌的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是芽孢桿菌屬的一種，單個(gè)細(xì)胞，0. 7 0.8X2 3微米，無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢0.6 0.9X1.0 1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)具有多種功能，是一種可以應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域的優(yōu)良菌種，例如可以作為微生物農(nóng)藥、微生物飼料添加劑、生物有機(jī)肥接種劑、凈水劑等。 它的主要功能有抑制有害細(xì)菌(大腸桿菌、沙門氏菌)生長(zhǎng)，預(yù)防腹瀉、下痢等疾?。环置诘鞍酌?、淀粉酶、脂肪酶等消化酶，降解動(dòng)植物性飼料中復(fù)雜的有機(jī)物，促進(jìn)消化吸收，提高飼料利用率；安全高效，無(wú)藥殘，無(wú)毒副作用，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力和抗病力；減少糞便中氮、磷、鈣的排泄量，減少有害氣體排放，降低養(yǎng)殖場(chǎng)所氨氣、吲哚等有害氣體的濃度，改善養(yǎng)殖環(huán)境；分解水體中的殘餌、糞便、死藻等，維護(hù)水質(zhì)，減少病害，減小換水量，提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力、抗病力，提高成活率?？莶菅挎邨U菌生產(chǎn)主要有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種，液體發(fā)酵需要全套的發(fā)酵罐裝置，其優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵過(guò)程易于控制，產(chǎn)品純度高，缺點(diǎn)是發(fā)酵后需要吸附干燥，工藝程序多； 固體發(fā)酵一般在發(fā)酵房中進(jìn)行，其優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵產(chǎn)量高且發(fā)酵后不需吸附，直接晾干即可使用，工藝簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是發(fā)酵過(guò)程不易控制，雜菌污染不易控制。因此，采用固體發(fā)酵生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌產(chǎn)品不適用于微生物飼料添加劑，但可適用于微生物肥料。目前國(guó)內(nèi)大部分生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的企業(yè)是采用液體發(fā)酵，例如康地恩生物集團(tuán)、山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司等，采用固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的企業(yè)不多且規(guī)模不大?？莶菅挎邨U菌固體發(fā)酵的原料主要是麩皮、豆粕、稻殼、玉米粉等，其中麩皮、豆粕、玉米粉為菌體生長(zhǎng)提供碳氮源，而稻殼主要是增加固體培養(yǎng)基的透氣性。另外培養(yǎng)基中還需要添加一些無(wú)機(jī)元素供菌體生長(zhǎng)所用。枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵過(guò)程最重要的兩個(gè)因素是培養(yǎng)基配方和溫度。由于枯草芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)熱，料溫升高的很快，如果控制不好，菌體生長(zhǎng)易于提前停止。因此，通過(guò)合理的培養(yǎng)基配方和溫度控制，以建立模式化固體發(fā)酵法生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)活菌的方法。本發(fā)明所述以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，步驟是
(1)菌種選擇選用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC03120菌株；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)所述菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于90 IOOmL液體種子培養(yǎng)基中，以150 180轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速、35 40°C震蕩培養(yǎng)M 36小時(shí)，得一級(jí)種子液；以體積比1 3%的接種量，將一級(jí)種子液再次接種于同樣配方的液體種子培養(yǎng)基中，以150 180轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速、35 40°C震蕩培養(yǎng)18 36小時(shí)，得二級(jí)種子液；(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)以5 10%質(zhì)量比的接種量，將二級(jí)種子液接種于經(jīng)121°C、 30分鐘滅菌的固體培養(yǎng)基中，隨后將接種的固體培養(yǎng)基以4 7厘米的厚度平攤于底部帶空隙的料筐中，再將料筐置于滅菌的固體發(fā)酵房?jī)?nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在30 35°C，并時(shí)常翻料使料筐中層料溫不高于47°C，同時(shí)利用空壓機(jī)往固體發(fā)酵房中通無(wú)菌風(fēng)， 發(fā)酵48 72小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束；(4)發(fā)酵產(chǎn)物晾干將步驟(3)發(fā)酵產(chǎn)物平攤于干凈的水泥地面上自然風(fēng)干35 45小時(shí)，其間取樣鏡檢和測(cè)定水分，當(dāng)芽孢率超過(guò)70%，含水率低于10%時(shí)，風(fēng)干過(guò)程結(jié)束，收集產(chǎn)物并粉碎，過(guò)80目篩，所得粉末即為含枯草芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品；利用系列稀釋法對(duì)含枯草芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，可計(jì)算出枯草芽孢桿菌的有效活菌數(shù)。上述液體種子培養(yǎng)基配方及制備方法為以重量份計(jì)，將玉米粉0. 5-2份、豆?jié){
1-4份、葡萄糖0.1-1份、硫酸銨0. 1-1份、硫酸錳0. 005-0. 02份、硫酸鎂0. 001-0. 03份、磷酸氫二鉀0. 001-0. 03份混合，加純凈水1-91份溶解，調(diào)節(jié)pH值至6_8，蒸汽滅菌后備用；上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方及制備方法為以重量份計(jì)，將麩皮20-40份、玉米粉
2-8份、豆粕2-8份、紅糖0.1-5份、糖蜜0. 1-5份、稻殼1_10份、硫酸銨0. 1-1份、硫酸鎂 0. 01-1份、硫酸錳0. 01-1份、酵母粉0. 001-0. 1份、自來(lái)水20-75份均勻混合，然后蒸汽滅菌備用，自然PH，不需額外調(diào)節(jié)。上述以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法中，步驟(1)所述菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC03120購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；步驟( 所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選37°C;步驟( 所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選觀小時(shí)；步驟C3)所述環(huán)境溫度優(yōu)選30°C; 步驟( 所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選56小時(shí)；步驟( 所述無(wú)菌風(fēng)的氣流速度為2-6米/秒；步驟 (4)所述風(fēng)干時(shí)間優(yōu)選40小時(shí)。本發(fā)明將麩皮、玉米粉、豆粕、紅糖、糖蜜、稻殼放在一起進(jìn)行枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵，通過(guò)合理的培養(yǎng)基配方和溫度控制，大大提高了固體發(fā)酵的枯草芽孢桿菌有效活菌含量，實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用本發(fā)明方法制備的枯草芽孢桿菌的有效活菌數(shù)可達(dá)600億/克固體發(fā)酵干料，具有創(chuàng)新性和實(shí)用性。經(jīng)檢索，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有這種固體發(fā)酵方法。應(yīng)用本發(fā)明方法生產(chǎn)含枯草芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品成本低，不需要大型設(shè)備，對(duì)環(huán)境污染也低，符合國(guó)家產(chǎn)業(yè)政策。并且本發(fā)明方法生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)高，能夠滿足微生物肥料的需要。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (1)菌種選擇選用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC03120菌株；所述菌種購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，具有固氮和作物根際促生能力；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)所述菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1環(huán)于IOOmL液體種子培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)觀小時(shí)，得一級(jí)種子液；(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)以5%的體積比的接種量，將一級(jí)種子液接種于裝有IOOOmL液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C，以180轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速搖瓶發(fā)酵觀小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，得二級(jí)種子液；(4)菌落計(jì)數(shù)以系列稀釋法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，二級(jí)種子液活菌含量為1. 5 X IOVmL 發(fā)酵液。上述液體發(fā)酵種子培養(yǎng)基及制備方法為按重量份(單位克)稱取玉米粉2份、 豆?jié){4份、葡萄糖0. 5份、硫酸銨0. 2份、硫酸錳0. 005份、硫酸鎂0. 02份、磷酸氫二鉀0. 005 份，然后將其充分混合，加自來(lái)水93. 3份溶解，調(diào)節(jié)pH值至7，121°C、30分鐘蒸汽滅菌后備用。實(shí)施例2 (1)菌種選擇選用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ACCC03120，所述菌種購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)所述菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于60mL液體發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)30小時(shí)，得一級(jí)種子液；(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)以3%的體積比的接種量，將一級(jí)種子液接種于裝有IOOOmL液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C，以180轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速搖瓶發(fā)酵觀小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，得二級(jí)種子液；(4)固體發(fā)酵培養(yǎng)以10%的質(zhì)量比的接種量，將二級(jí)種子液接種于0. 2噸提前配好混勻并滅菌的固體培養(yǎng)基中，將接種好的固體培養(yǎng)基以5厘米的厚度平攤于底部帶空隙的塑料筐中，再將塑料筐置于無(wú)菌的固體發(fā)酵房鐵架上發(fā)酵，利用冷暖空調(diào)控制環(huán)境溫度在32°C，同時(shí)利用空壓機(jī)往固體發(fā)酵房中通無(wú)菌風(fēng)(氣流速度為3-4米/秒)，在發(fā)酵過(guò)程中控制料溫，時(shí)常翻料使料筐中層料溫不高于47°C，發(fā)酵50小時(shí)后結(jié)束；(5)發(fā)酵產(chǎn)物分離晾干將步驟(4)所述發(fā)酵結(jié)束后的產(chǎn)物平攤于干凈的水泥地面上自然風(fēng)干35 45 小時(shí)，在風(fēng)干過(guò)程中大量菌體轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎?。在風(fēng)干中，取樣鏡檢和水分測(cè)定，當(dāng)芽孢率超過(guò) 70%，含水率低于8%時(shí)，風(fēng)干過(guò)程即結(jié)束，收集發(fā)酵產(chǎn)物粉碎過(guò)80目篩，所得粉末即為含枯草芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品；(6)菌落計(jì)數(shù)利用系列稀釋法對(duì)含枯草芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果是有效活菌數(shù)為6 X 101°/克發(fā)酵干料，芽孢率79 %，水分5 %。上述液體種子培養(yǎng)基及制備方法為按重量份(單位克)稱取玉米粉1. 5份、豆?jié){3. 5份、葡萄糖1份、硫酸銨0. 1份、硫酸錳0. 006份、硫酸鎂0. 02份、磷酸氫二鉀0. 005 份，混合，加自來(lái)水93. 9份溶解，調(diào)節(jié)pH值至7，121°C、30分鐘蒸汽滅菌后備用。上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基及制備方法為按重量份(單位克)稱取麩皮30份、玉米粉 3份、豆粕3份、紅糖2份、糖蜜2份、稻殼5份、硫酸銨0. 5份、硫酸鎂0. 01份、硫酸錳0. 01 份、酵母粉0. 005份、自來(lái)水54. 5份，均勻混合后121°C、30分鐘蒸汽滅菌備用，自然pH，不
5需額外調(diào)節(jié)。實(shí)施例3 (1)菌種選擇選用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC03120 ；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)所述菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于IOOmL 液體種子培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)30小時(shí)，得一級(jí)種子液；(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)以2%的體積比的接種量，將一級(jí)種子液接種于裝有IOOOmL液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C，以180轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速搖瓶發(fā)酵觀小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，得二級(jí)種子液；(4)固體發(fā)酵培養(yǎng)以7%的質(zhì)量比的接種量，將二級(jí)種子液接種于0. 8噸提前配好混勻并滅菌的固體培養(yǎng)基中，將接種好的固體培養(yǎng)基以7厘米的厚度平攤于底部帶空隙的塑料筐中，再將塑料筐置于無(wú)菌的固體發(fā)酵房鐵架上發(fā)酵，利用冷暖空調(diào)控制環(huán)境溫度在30°C，同時(shí)往固體發(fā)酵房中通無(wú)菌風(fēng)(氣流速度為4-6米/秒)，56小時(shí)后發(fā)酵結(jié)束；在發(fā)酵過(guò)程中控制料溫，當(dāng)料的中層溫度超過(guò)47°C時(shí)，人工翻料。(5)發(fā)酵產(chǎn)物分離晾干將步驟(4)所述發(fā)酵結(jié)束后的產(chǎn)物平攤于干凈的水泥地面上自然風(fēng)干35 45 小時(shí)，在風(fēng)干過(guò)程中大量菌體轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎?。在風(fēng)干中，取樣鏡檢和水分測(cè)定，當(dāng)芽孢率超過(guò) 70%，含水率低于8%時(shí)，風(fēng)干過(guò)程即結(jié)束，收集發(fā)酵產(chǎn)物粉碎過(guò)80目篩，所得粉末即為含枯草芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品；(6)菌落計(jì)數(shù)以系列稀釋法對(duì)含枯草芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果是有效活菌數(shù)為6. 5 X 101°/克發(fā)酵干料，芽孢率81. 9 %，水分6. 5 %。上述液體種子培養(yǎng)基及制備方法為按重量份(單位克)稱取玉米粉2份、豆?jié){ 4份、葡萄糖0. 5份、硫酸銨0. 1份、硫酸錳0. 007份、硫酸鎂0. 02份、磷酸氫二鉀0. 005份， 混合，加自來(lái)水93. 4份溶解，調(diào)節(jié)pH值至7，蒸汽滅菌后備用。上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基及制備方法為按重量份(單位克)稱取麩皮35份、玉米粉2. 5份、豆粕3份、紅糖1份、糖蜜1份、稻殼5份、硫酸銨0. 5份、硫酸鎂0. 01份、硫酸錳 0.01份、酵母粉0. 005份、自來(lái)水52份，均勻混合后蒸汽滅菌備用，自然pH，不需額外調(diào)節(jié)。
權(quán)利要求
1.一種以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，步驟是(1)菌種選擇選用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ACCC03120菌株；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)所述菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于90 IOOmL 液體種子培養(yǎng)基中，以150 180轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速、35 40°C震蕩培養(yǎng)M 36小時(shí)，得一級(jí)種子液；以體積比1 3%的接種量，將一級(jí)種子液再次接種于同樣配方的液體種子培養(yǎng)基中，以150 180轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速、35 40°C震蕩培養(yǎng)18 36小時(shí)，得二級(jí)種子液；(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)以5 10%質(zhì)量比的接種量，將二級(jí)種子液接種于經(jīng)121°C、30分鐘滅菌的固體培養(yǎng)基中，隨后將接種的固體培養(yǎng)基以4 7厘米的厚度平攤于底部帶空隙的料筐中，再將料筐置于滅菌的固體發(fā)酵房?jī)?nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在30 35°C， 并時(shí)常翻料使料筐中層料溫不高于47°C，同時(shí)利用空壓機(jī)往固體發(fā)酵房中通無(wú)菌風(fēng)，發(fā)酵 48 72小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束；(4)發(fā)酵產(chǎn)物晾干將步驟C3)發(fā)酵產(chǎn)物平攤于干凈的水泥地面上自然風(fēng)干35 45小時(shí)，其間取樣鏡檢和測(cè)定水分，當(dāng)芽孢率超過(guò)70 %，含水率低于10 %時(shí)，風(fēng)干過(guò)程結(jié)束，收集產(chǎn)物并粉碎，過(guò)80目篩，所得粉末即為含枯草芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品；上述液體種子培養(yǎng)基配方及制備方法為以重量份計(jì)，將玉米粉0. 5-2份、豆?jié){1-4份、 葡萄糖0. 1-1份、硫酸銨0. 1-1份、硫酸錳0. 005-0. 02份、硫酸鎂0. 001-0. 03份、磷酸氫二鉀0. 001-0. 03份混合，加純凈水1-91份溶解，調(diào)節(jié)pH值至6_8，蒸汽滅菌后備用；上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方及制備方法為以重量份計(jì)，將麩皮20-40份、玉米粉2-8份、 豆粕2-8份、紅糖0. 1-5份、糖蜜0. 1-5份、稻殼1-10份、硫酸銨0. 1-1份、硫酸鎂0. 01-1 份、硫酸錳0. 01-1份、酵母粉0. 001-0. 1份、自來(lái)水20-75份均勻混合，然后蒸汽滅菌備用， 自然PH，不需額外調(diào)節(jié)。
2.如權(quán)利要求1所述以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于，步驟(2) 所述培養(yǎng)溫度為37°C。
3.如權(quán)利要求1所述以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于，步驟(2) 所述培養(yǎng)時(shí)間為觀小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于，步驟(3) 所述環(huán)境溫度為30°C。
5.如權(quán)利要求1所述以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于，步驟(3) 所述培養(yǎng)時(shí)間為56小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1所述以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于，步驟(3) 所述無(wú)菌風(fēng)的氣流速度為2-6米/秒。
7.如權(quán)利要求1所述以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于，步驟(4) 所述風(fēng)干時(shí)間為40小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，是選用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC03120菌株，在30～35℃利用固體發(fā)酵培養(yǎng)48～72小時(shí)，然后自然風(fēng)干35～45小時(shí)，再經(jīng)粉碎過(guò)80目篩，制得含枯草芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品。本發(fā)明方法原料成本低廉，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，不需要大型設(shè)備，且產(chǎn)物中枯草芽孢桿菌有效活菌高，為600億/克發(fā)酵干料的產(chǎn)品，能夠滿足微生物肥料的大量需求。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102352334SQ20111032414
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者尤升波, 岳壽松, 張斌, 柳絮, 游銀偉, 范仲學(xué) 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心