專利名稱：一種分離牛外周血單核細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞分離技術(shù)，具體地說，涉及一種分離牛外周血單核細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
分離外周血單核細(xì)胞一般包括兩個步驟S卩外周血單個核細(xì)胞的分離和后續(xù)單核細(xì)胞的分離。其中，第一步是通過密度梯度離心完成的，通過選擇一定密度的分離液，可以將血液中密度較低的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(二者密度相近，合稱外周血單個核細(xì)胞，PBMC) 與密度較高的粒細(xì)胞、紅細(xì)胞成分分開；第二步，單核細(xì)胞可以用其它一些方法與淋巴細(xì)胞分離開，包括吸附法、免疫分選、反向淘選離心法和密度梯度分離等。其中，吸附法是最常用的方法，它簡單、經(jīng)濟，但是也存在一些缺點，比如淋巴細(xì)胞污染量高、靈活性低、工作量大、 單核細(xì)胞激活等。免疫分選對于日常應(yīng)用以及處理大量血液樣本而言十分昂貴，需要專門的單克隆抗體和設(shè)備，一般包括流式細(xì)胞術(shù)和免疫磁珠兩種方法。反向淘選離心法可以處理大量的血液，純度高活率高，而且不易激活單核細(xì)胞，但是需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員。密度分離的方法包括使用連續(xù)密度梯度和非連續(xù)密度梯度兩種，其中制作連續(xù)密度梯度的泵和超速離心機價格相對昂貴。1999年，Jindrich Soltys等人使用了免疫磁珠的方法分離牛的中性粒細(xì)胞，細(xì)胞得率更高、純度更純，而且在諸多檢測指標(biāo)中都表現(xiàn)出了更好的活性，但是用免疫磁珠法分離牛外周血單核細(xì)胞還未有文獻報道。使用抗體的單核細(xì)胞分離技術(shù)還有流式細(xì)胞術(shù)，但是也沒有用于分離牛外周血單核細(xì)胞的文獻報道。反向離心淘洗法需要一套專門的反向離心淘洗設(shè)備，用于人的外周血單核細(xì)胞分離，但也沒有文獻使用了該技術(shù)分離牛的外周血單核細(xì)胞。密度分離的方法是基于單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的大小不同，使用連續(xù)密度梯度分離液和超速離心機將二者分開，目前該方法也不常用牛的外周血單核細(xì)胞分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，對塑料吸附法分離牛外周血單核細(xì)胞的關(guān)鍵步驟進行改進，提供一種優(yōu)化的分離牛外周血單核細(xì)胞的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種分離牛外周血單核細(xì)胞的方法，包括步驟1) 向含有抗凝劑A⑶-A的離心管中加入采集到的牛外周血，制成抗凝血液；2)將OptiPi^p 原液與C液按比例混合，制成密度分離液；3)將1)的抗凝血液與PBS液按比例混合，制成稀釋的抗凝血液；4)將2份體積的3)稀釋的抗凝血液加在1份體積的2)的密度分離液之上，離心，棄上清，將分離液和血清液面交界處的白色薄層轉(zhuǎn)移至另一離心管中；5)向4)的離心管中加入PBS溶液清洗細(xì)胞，然后以轉(zhuǎn)速250g離心5-lOmin;重復(fù)5) —次；6)向5)的細(xì)胞沉淀中加入PBS溶液重懸，即得單個核細(xì)胞。其中，前述2)和3)中C液的制備方法為將1.79g Tricine Buffer加入IOOml水中，制得IOOmM Tricine儲存液，4°C保存；將0. 85g NaCl加入50ml水中，加入20ml IOOmM Tricine儲存液，用IM NaOH調(diào)節(jié)pH值7. 4，加水補充體積至100ml，0. 22 μ m濾器過濾除菌。
前述步驟1)中所述的抗凝劑A⑶-A的制備方法為向IOOml水中加入0. 73g無水檸檬酸、2. 20g 二水檸檬酸鈉和2. 45g —水右旋糖，調(diào)節(jié)pH值至7. 0-7. 3，0. 22 μ m濾器過濾除菌。其中，抗凝劑A⑶-A和牛外周血的體積比為1 5-10。前述步驟2)中OptiPi^p 原液與C液的體積比為1.4 4. 6。前述步驟3)中抗凝血液與PBS液的體積比為1 1。前述的方法還包括以下步驟將6)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入 RPMI1640培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C，5% CO2的條件下培養(yǎng)，得到貼壁的單核細(xì)胞。
本發(fā)明采用了新型的密度梯度分離液OptiPi^p ，它是一種非離子型等滲造影劑， 可以配置的密度范圍寬，而且它不像Percoll 含有固態(tài)顆粒，后者可能會被單核細(xì)胞吞噬，而且內(nèi)毒素含量很低(高濃度Ficoll 可能含有較高的內(nèi)毒素含量)，對敏感的單核細(xì)胞損傷和影響很小。本發(fā)明是以O(shè)ptiPrep 說明書為基礎(chǔ)，參考了其它關(guān)于牛和人的單核細(xì)胞分離技術(shù)的文獻，經(jīng)過反復(fù)實驗和不斷摸索而設(shè)計得到的，將說明書和部分文獻中對實驗有利的步驟保留，剔除不利的步驟。(一)本發(fā)明采用的抗凝劑ACD-A相比于常規(guī)使用的其它抗凝劑(如肝素和 EDTA2K)能更穩(wěn)定地分離到形態(tài)更好的細(xì)胞，而且該抗凝劑適宜較長時間儲存血液，在室溫條件下保存一天的血液仍然可以分離到合適的細(xì)胞。( 二)細(xì)胞清洗條件的優(yōu)化按照現(xiàn)有文獻和說明書的方法經(jīng)常導(dǎo)致單核細(xì)胞分離的失敗，原因之一可能在于細(xì)胞的清洗過程，本發(fā)明采用PBS溶液對細(xì)胞進行清洗，減少了對后續(xù)單核細(xì)胞貼壁分離不利的因素，例如血清和血小板的影響，最終使分離的成功率大大增加。(三)本發(fā)明首次將從牛血采樣到分離牛外周血單核細(xì)胞并最終轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞形成了一整套完備的體系，中間不需要計數(shù)和染色，節(jié)省了時間并提高了分離效果。(四)采用本發(fā)明方法從牛外周血樣中分離出的單核細(xì)胞存活率高，貼壁單核細(xì)胞活率大于95%，實驗重復(fù)性好，可操作性強，為簡便高效地分離牛外周血中的單核細(xì)胞提供了有力的技術(shù)支持。


圖1和圖2為使用EDTA作為抗凝劑分離牛外周血單核細(xì)胞，顯微鏡下觀察到的結(jié)果(放大倍數(shù)200X)。圖3和圖4為使用肝素作為抗凝劑分離牛外周血單核細(xì)胞，顯微鏡下觀察到的結(jié)果(放大倍數(shù)200X)。圖5和圖6為使用A⑶-A作為抗凝劑分離牛外周血單核細(xì)胞，顯微鏡下觀察到的結(jié)果(放大倍數(shù)200X)。圖7顯示出由于貼壁面積過小，單核細(xì)胞在大量淋巴細(xì)胞的影響下，無法完全貼壁的結(jié)果(放大倍數(shù)200X)。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。以下實施例中觀察細(xì)胞使用Olympus 1X71倒置顯微鏡20倍物鏡，美國ImagePLUS 圖像分析系統(tǒng)采集數(shù)碼圖像。實施例1分離牛外周血樣中的單核細(xì)胞1、材料與試劑

1)抗凝劑A⑶-A，配制方法為每IOOml水中加入0. 73g無水檸檬酸、2. 20g 二水檸檬酸鈉和2. 45g—水右旋糖。調(diào)節(jié)pH值至7. 0-7. 3，0.22 μ m濾器過濾除菌。1份體積 A⑶-A抗凝5-10份體積的血液。2) OptiPrep 密度梯度分離液(Axis-Shield PoC, Norway)。3) Tricine BufTer(Amresco)04) RPMI1640 培養(yǎng)基(Gibco, invitrogen)。5)胎牛血清(Gibco, invitrogen)。6) PBS (NaCl 8. 00g, KCl 0. 20g, Na2HPO4 · 12H20 2. 91g, KH2PO4O. 24g,加入 800ml 去離子水，調(diào)節(jié)pH為7. 4，定容至1000ml，高壓滅菌)。2、方法1)無菌采集牛外周血，使用A⑶-A抗凝劑(50ml離心管，加入約7ml A⑶_A，采集血液至45ml刻度線)。2)按照OptiPi^p 說明書(Application Sheet C08)，準(zhǔn)備工作液C液。具體方法為將1. 79g Tricine Buffer加入100ml水中，制得IOOmMTricine儲存液，4°C保存；將 0. 85g NaCl 加入 50ml 水中，加入 20mlIOOmM Tricine 儲存液，用 IM NaOH 調(diào)節(jié) pH 值 7. 4， 加水補充體積至100ml，0. 22 μ m濾器過濾除菌。3)按照說明書，將OptiPi^p 原液(A液)與C液按1. 4 4.6的比例混合，制備成1. 068g/ml密度分離液。4)將1)的抗凝血液與PBS液按照1 1的比例混合。5)將2份體積4)的稀釋血液小心地累加到1份體積1. 068g/ml密度分離液上 (50ml離心管中一般是30ml混合血加在15ml分離液上)。建議采用巴斯德吸管，將含有密度分離液的離心管傾斜成與水平桌面呈20度角，然后貼著管壁在距離密度分離液上緣 Icm處緩緩添加，可減少液面的擾動，隨著液體的加入，慢慢將離心管直立(該方法詳見 OptiPi^p 說明書 Application Sheet 02)。6)將離心管置于水平轉(zhuǎn)子室溫離心機，在800g的轉(zhuǎn)速下離心30min，減速時必須采用最小制動。7)取出離心管，將上清棄去一部分，留下一部分輔助吸取PBMC (50ml離心管大約留下5-10ml)，然后小心地吸取透明分離液和血清液面交界處的白色薄層，由于細(xì)胞容易粘附在離心管壁上，吸取時應(yīng)加以注意。8)將吸得的細(xì)胞置于15ml離心管中(用1000 μ L移液器一般吸取3_4ml)，加入室溫PBS至15ml，輕柔顛倒混勻5次，然后置于水平轉(zhuǎn)子室溫離心機，在250g轉(zhuǎn)速下離心 7min，采用半制動。采用同樣方法再清洗一次細(xì)胞，離心時采用全制動。9)將每個15ml離心管中的細(xì)胞用0. 5ml PBS充分輕柔地重懸，加入一個25cm2 塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后向培養(yǎng)瓶中加入5. 5ml室溫RPMI1640完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、1 %青/鏈霉素)，輕微振蕩混勻使細(xì)胞均勻平鋪在培養(yǎng)瓶中(此時細(xì)胞密度約為 2. 5X IO6個/ml)。將細(xì)胞瓶在37°C下，5% CO2的條件下培養(yǎng)。即得PBMC細(xì)胞，可以用于后續(xù)實驗。10)培養(yǎng)1天后，即可去掉上層細(xì)胞液，并用室溫PBS浸洗兩次，然后加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞。至第5天，貼壁的單核細(xì)胞就可以轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，可以用于下游實驗。
實施例2抗凝劑對分離牛外周血單核細(xì)胞的影響本發(fā)明在常規(guī)分離方法的基礎(chǔ)上對細(xì)節(jié)步驟和條件進行了改進。首先是抗凝劑的選擇，優(yōu)選ACD-A，其次是肝素，不建議使用EDTA。然后，細(xì)胞的清洗必須充分去除血小板、 殘留血清等。最后，形成了一套模式化的方案，包括使用50ml離心管離心，15ml離心管清洗，25cm2培養(yǎng)瓶貼壁的方案，具有很好的重復(fù)性和可操作性，不需要細(xì)胞計數(shù)，節(jié)省實驗時間，提高分離效果。本發(fā)明摸索了抗凝劑的使用條件，包括肝素(2mg/10ml血液)、EDTA 二鉀(K2EDTA, 18mg/10ml血液)和A⑶-A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種抗凝劑得到的PBMC數(shù)量有明顯差異。分別采集兩頭奶牛I和I’的血樣，由同一名操作人員按照OptiPi^p 說明書中所述的方法同時進行分離。得到的PBMC細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸后取少量用臺盼藍進行染色，剩余的培養(yǎng)于細(xì)胞瓶內(nèi)。臺盼藍染色后，通過細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞進行計數(shù)和分類。(表1)表1不同抗凝劑抗凝血液后分離出PBMC的細(xì)胞活率及數(shù)量
權(quán)利要求
1.一種分離牛外周血單核細(xì)胞的方法，其特征在于，包括步驟1)向含有抗凝劑ACD-A的離心管中加入采集到的牛外周血，制成抗凝血液；2)將OptiPi^p 原液與C液按比例混合，制成密度分離液；3)將1)的抗凝血液與PBS溶液按比例混合，制成稀釋的抗凝血液；4)將2份體積的3)稀釋的抗凝血液加在1份體積的2)的密度分離液之上，離心，棄上清，將分離液和血清液面交界處的白色薄層轉(zhuǎn)移至另一離心管中；5)向4)的離心管中加入PBS溶液清洗細(xì)胞，然后以轉(zhuǎn)速250g離心5-lOmin；6)向5)的細(xì)胞沉淀中加入PBS溶液重懸，即得單個核細(xì)胞；其中，2)中所述的C液的制備方法為將1.79g Tricine Buffer加入IOOml水中，制得 IOOmM Tricine 儲存液，4°C保存；將 0. 85g NaCl 加入 50ml 水中，加入 20ml IOOmM Tricine 儲存液，用IM NaOH調(diào)節(jié)pH值7. 4，加水補充體積至100ml，0. 22 μ m濾器過濾除菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述的抗凝劑ACD-A的制備方法為向IOOml水中加入0. 73g無水檸檬酸、2. 20g 二水檸檬酸鈉和2. 45g 一水右旋糖，調(diào)節(jié)pH值至7. 0-7. 3，0. 22 μ m濾器過濾除菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，抗凝劑ACD-A和牛外周血的體積比為 1 5-10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中OptiPrep 原液與C液的體積比為 1. 4 4. 6。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中抗凝血液與PBS液的體積比為
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟5)和步驟6)之間重復(fù)一次清洗細(xì)胞的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟將6)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入RPMI1640培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C，5% CO2的條件下培養(yǎng)，得到貼壁的單核細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的分離牛外周血單核細(xì)胞的方法，包括以ACD-A作為抗凝劑、離心條件的優(yōu)化、細(xì)胞清洗條件的優(yōu)化、貼壁條件的優(yōu)化等，大大提高了分離成功率。本發(fā)明首次建立了從牛血采樣到分離牛外周血單核細(xì)胞并最終轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞的一整套完備體系，中間不需要計數(shù)和染色，節(jié)省了時間并提高了分離效果。采用本發(fā)明方法分離出的單核細(xì)胞存活率高，實驗重復(fù)性好，可操作性強，為簡便高效地分離牛外周血中的單核細(xì)胞提供了有力的技術(shù)支持。
文檔編號C12N5/0786GK102329774SQ20111032470
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者周向梅, 尹曉敏, 楊利峰, 林敬鈞, 王洋, 趙德明 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)