專(zhuān)利名稱(chēng)：一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)生物工程領(lǐng)域，涉及一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。所得的微囊體積可控，大小均一，微囊內(nèi)腫瘤細(xì)胞增生活躍，動(dòng)物模型成瘤率高。
背景技術(shù)：
胰腺癌是一種惡性腫瘤，患者總的5年生存率低于5%。只有不到20%的患者胰腺癌病灶局限，可手術(shù)切除。盡管放化療發(fā)展迅速，但其對(duì)于患者的生存時(shí)間延長(zhǎng)效果微乎其微。因此，迫切得需要可以用于胰腺癌發(fā)生發(fā)展的動(dòng)物模型。目前人腫瘤細(xì)胞的大多數(shù)動(dòng)物模型可分為皮下、原位以及異位移植。皮下腫瘤模型具有操作簡(jiǎn)單、易于觀察腫瘤發(fā)展等觀點(diǎn)。皮下種植形成的腫瘤生長(zhǎng)良好，但是皮下移植瘤其生物學(xué)表現(xiàn)更類(lèi)似于良性腫瘤及時(shí)來(lái)源于低分化細(xì)胞系。更重要的是皮下移植瘤極少轉(zhuǎn)移至實(shí)質(zhì)性臟器。因此，皮下移植瘤臨床價(jià)值有限。原位注射細(xì)胞懸液或移植已形成腫瘤組織團(tuán)塊形成的腫瘤動(dòng)物模型可以很好的模擬腫瘤發(fā)展、局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移的整個(gè)過(guò)程，并且成瘤率及轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高。原位移植已形成的腫瘤組織塊可以避免注射細(xì)胞懸液時(shí)腫瘤細(xì)胞播散入腹腔的風(fēng)險(xiǎn)。大量臨床證據(jù)表明，胰腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生在疾病的早期階段。因此，需要能夠研究腫瘤早期發(fā)展、轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型。腫瘤組織團(tuán)塊原位移植需要提前準(zhǔn)備腫瘤，并且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，不能研究腫瘤早期發(fā)展機(jī)制因?yàn)樵l(fā)腫瘤并非原位形成。而原位注射腫瘤細(xì)胞懸液至胰腺包膜下，細(xì)胞懸液可能經(jīng)包膜破損處進(jìn)入腹腔，形成腹腔播散灶。因此，原位注射微囊化腫瘤細(xì)胞懸液相對(duì)于其他方法具有成瘤率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，腹腔播散率低以及能模擬腫瘤細(xì)胞早期進(jìn)展的過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題而提供一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的目的之二在于提供上述的一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法。本發(fā)明的目的之三在于提供一種應(yīng)用上述的一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞在裸鼠中建立原位腫瘤或皮下腫瘤動(dòng)物模型的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法，即將懸浮有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液加入到含Matrigel的海藻酸鈉溶液中，在高壓靜電環(huán)境下噴入到氯化鈣溶液中形成微球后與檸檬酸鈉溶液進(jìn)行離子置換反應(yīng)，最終得到微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞，該制備方法包括以下具體步驟
(1)、人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液的制備
在0)2培養(yǎng)箱中，人胰腺癌細(xì)胞在含有熱滅活胎牛血清的Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培養(yǎng)液中，控制溫度為37°C、0)2濃度為5%的條件下對(duì)人胰腺癌腫瘤細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后傳代1-2次；
取上述培養(yǎng)過(guò)程中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌腫瘤細(xì)胞，以0. 25%胰酶對(duì)其進(jìn)行消化 20min后，置于離心機(jī)中以500>的速度離心15min，以4°C、pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液(PBS) 溶液洗滌三次，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)目至4' 107cells/mL,即得人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液；
(2)、含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉溶液的制備
按體積比即濃度為25%(v/v )的Matrigel 質(zhì)量濃度為1. 8%的海藻酸鈉溶液為1 20， 將濃度為25%(v/v )的Matrigel加入質(zhì)量濃度1. 8%的海藻酸鈉溶液中，得到含Matrigel 的海藻酸鈉溶液；
然后加入步驟(1)所得的人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液加入到上述所得的含Matrigel的海藻酸鈉溶液中，使最終人胰腺癌腫瘤細(xì)胞濃度為2'107cellS/mL，即得含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉溶液；
(3)、高壓靜電下形成膠珠
通過(guò)高頻脈沖微囊制備儀，控制噴射速率為90mm/h，將步驟(2)所得的含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉溶液自上而下垂直噴射到質(zhì)量濃度為1. 1%的CaCl2溶液中，形成膠珠；所述的膠珠的粒徑大小可通過(guò)設(shè)定高壓脈沖微囊制備儀的電壓、頻率等進(jìn)行調(diào)整； 上述的高壓脈沖微囊制備儀噴射過(guò)程控制電壓60kv，頻率90Hz，脈沖6ms ；
(4)、含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的多聚賴(lài)氨酸/聚海藻酸鈉的包被
將步驟(3)所得的膠珠懸浮于質(zhì)量濃度為0. 05%多聚賴(lài)氨酸溶液中5min，多聚賴(lài)氨酸與膠珠表面的海藻酸鈣發(fā)生聚電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)成膜，形成含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉/聚賴(lài)氨酸微膠囊；
將形成的含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉/聚賴(lài)氨酸微膠囊再懸浮于質(zhì)量濃度為 0. 1%的海藻酸鈉溶液中l(wèi)Omin，中和其表面正電荷；
(5)、微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液的制備
將步驟(4)所得表面正電荷被中和后的含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉/聚賴(lài)氨酸微膠囊浸泡于質(zhì)量濃度3%檸檬酸鈉溶液中l(wèi)Omin，含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉/聚賴(lài)氨酸微膠囊內(nèi)的海藻酸鈣凝膠中的鈣離子被鈉離子置換并液化，用4°C、pH為7. 2的PBS 溶液洗滌微囊，最終得到本發(fā)明的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞。上述所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的微囊，其平均直徑約420mm，將所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞浸泡于含有熱滅活胎牛血清的Dulbecco，s Modified Eagle Medium (DMEM)培養(yǎng)液保存，即得微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液。所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞用于腫瘤動(dòng)物模型的建立，其建立過(guò)程如下 皮下腫瘤動(dòng)物模型的建立
將上述的一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法中步驟(5)所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞在37°C，CO2的濃度為5%的(X)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6天后，調(diào)節(jié)微囊濃度至2' IO2個(gè)/mL， 取IOOmL注射于裸鼠腋下或肩背部皮下，即得到皮下腫瘤動(dòng)物模型。原位腫瘤動(dòng)物模型的建立
首先用10%水合氯醛(0. 3g/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，75%酒精消毒皮膚，取腹部正中切口，仔細(xì)分離胃脾，暴露胰腺，將上述的一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法中步驟 (5)所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞在37°C，CO2的濃度為5%的(X)2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6
5天后，調(diào)節(jié)微囊濃度至2' IO2個(gè)/mL，取IOOmL注射于胰腺體尾被膜下，即得到原位腫瘤動(dòng)物模型。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞，由于在微囊薄膜內(nèi)增加了 Matrigel，經(jīng)倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察證實(shí)人胰腺癌腫瘤細(xì)胞增生活躍。另外，微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞應(yīng)用于皮下腫瘤及原位腫瘤動(dòng)物模型，相對(duì)于傳統(tǒng)腫瘤細(xì)胞懸液注射法，建模成功率高，腫瘤生長(zhǎng)迅速。將按照此方法制備的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞應(yīng)用于腫瘤動(dòng)物模型，可加深對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí)，廣泛應(yīng)用于藥物的研發(fā)、檢測(cè)及篩選。特別是原位注射微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液相對(duì)于其他方法具有成瘤率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，腹腔播散率低以及能模擬腫瘤細(xì)胞早期進(jìn)展的過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)。


圖1、倒置相差顯微鏡100X下的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞圖2、透射電子顯微鏡2500X下的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞圖，圖中箭頭指完整的微
囊膜；
圖3、透射電子顯微鏡2500X下的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞圖，其中微囊包膜因腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)而破裂，圖中箭頭所指為微囊包膜；
圖4、微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液與人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液兩種方法制備皮下移植瘤定期檢測(cè)腫瘤體積所繪制的生長(zhǎng)曲線；
圖5、微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液與人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液兩種方法在制備原位移植瘤模型中所成腫瘤質(zhì)量的比較。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，并不限制本發(fā)明。本發(fā)明所用的高頻脈沖微囊制備儀，上海理工大學(xué)生產(chǎn)； 所用的離心機(jī)型號(hào)A1330005，德國(guó)SIGMA ；
所用的透射電子顯微鏡=Philips，CM80 ； CO2培養(yǎng)箱WJ-2，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；
所用的人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2取自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化外科研究所；
0. 25%胰酶，上海史瑞可生物科技有限公司； DMEM Gibco, Grand Island, NY; Matrigel BD Bioscience, Bedford, ΜΑ; PBS:上海葉舟生物科技有限公司； 檸檬酸鈉上海信然原裝生物試劑有限公司； 海藻酸鈉上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司； 多聚賴(lài)氨酸北京瑞澤康科技有限公司； PET-CT Inveon micro, SIEMENS; 本發(fā)明所用的檢查方法
6請(qǐng)給出本發(fā)明所用的一些檢查方法，采用參考文獻(xiàn)的方式給出。PET-CT 檢查的方法，見(jiàn) Valentiner U ；Haane C ；Peldschus K, et al. (18F)FDG and (18F) FLT PET-CT and MR imaging of human neuroblastomas in a SCID mouse xenograft model. Anticancer Research, 2008, 28 (5A) : 2561-8.
本發(fā)明所用的所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，如微囊化人胰腺癌細(xì)胞與人胰腺癌細(xì)胞細(xì)胞在成瘤體積及腫瘤質(zhì)量方面的差異使用t檢驗(yàn)，微囊化人胰腺癌細(xì)胞與人胰腺癌細(xì)胞懸液在成瘤率方面的差異使用Fisher's確切概率法。成瘤質(zhì)量的差異亦使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P < 0.05在本發(fā)明中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)所有統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算均使用SAS 8.0。實(shí)施例1
一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2的制備，包括如下步驟
(1)、人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2懸液的制備
在(X)2培養(yǎng)箱中，人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2在含有熱滅活胎牛血清的Dulbecco’ s Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)液中，控制溫度為37°C、C02濃度為5%的條件下對(duì)人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)；
取20ml上述培養(yǎng)過(guò)程中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2，棄去上層培養(yǎng)液，加入4°C，pH7. 2的PBS洗滌三次，棄去上清液，再加入0. 25%胰酶4mL消化，置于37°C、 CO2的濃度為5%的(X)2培養(yǎng)箱中，5min后取出，加入DMEM培養(yǎng)液3mL，將所得溶液倒入離心管中，以500>的速度離心15min，棄去上清液，以4°C PBS溶液洗滌三次，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)目至 4' 107cells/mL,即得人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2懸液；
(2)、含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2的海藻酸鈉溶液的制備
將濃度為25% (ν/ν)的Matrigel 50ul加入質(zhì)量濃度1. 8%的海藻酸鈉溶液ImL中，加入步驟(1)所得人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2懸液1. lmL，調(diào)節(jié)人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2 濃度為2' 107cells/mL,即得含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2的海藻酸鈉溶液；
(3)、高壓靜電下形成膠珠
通過(guò)高頻脈沖微囊制備儀，控制噴射速度為90mm/h，自上而下將步驟(2)所得的含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2的海藻酸鈉溶液垂直噴入含有質(zhì)量濃度為1. 1%的CaCl2溶液的燒杯中，形成膠珠；
高頻脈沖微囊制備儀的電壓為60kv，頻率為90Hz，脈沖6ms ；
(4)、含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2的多聚賴(lài)氨酸/聚海藻酸鈉的包被
將步驟(3)所得的膠珠懸浮于質(zhì)量濃度0. 05 %多聚賴(lài)氨酸溶液20mL中5min，多聚賴(lài)氨酸與膠珠表面的海藻酸鈣發(fā)生聚電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)成膜，形成海藻酸鈉/聚賴(lài)氨酸微膠囊， 微膠囊懸浮于質(zhì)量濃度為0. 1%的海藻酸鈉溶液20mL中l(wèi)Omin，中和其表面正電荷；
(5)、微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2懸液的制備
將步驟(4)經(jīng)表面正電荷中和后的含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉/聚賴(lài)氨酸微膠囊浸泡于質(zhì)量濃度3%檸檬酸鈉溶液中，含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉/聚賴(lài)氨酸微膠囊內(nèi)的海藻酸鈣凝膠中的鈣離子被鈉離子置換并液化，用4°C、pH為7. 2的PBS溶液洗滌含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2的海藻酸鈉/聚賴(lài)氨酸微膠囊，最終得到本發(fā)明的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2 ；
將所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2浸泡于含有熱滅活胎牛血清的Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)培養(yǎng)液保存，即得微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2 ；！夕夜。利用上述所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2的動(dòng)物模型的制備，具體如下
(1)、皮下人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2動(dòng)物模型的制備
將上述的步驟(5)所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2在37°C，CO2的濃度為 5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6天后，調(diào)節(jié)微囊濃度至2' IO2個(gè)/mL，取IOOmL注射于裸鼠腋下，即得到皮下人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2動(dòng)物模型。(2)、原位人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2動(dòng)物模型的制備
首先用10%水合氯醛(0. 3g/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，75%酒精消毒皮膚，取腹部正中切口，仔細(xì)分離胃脾，暴露胰腺，將上述的步驟(5)所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2在37°C，CO2的濃度為5%的，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6天后，調(diào)節(jié)微囊濃度至2' IO2個(gè)/ mL,取IOOmL注射于胰腺體尾被膜下，即得到原位人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2動(dòng)物模型。上述所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2通過(guò)倒置相差顯微鏡及透射電子顯微鏡掃描，見(jiàn)圖1、圖2、圖3。其中，圖1為倒置相差顯微鏡100X下的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2 圖，從圖1中可以看出，微囊大小均一，平均直徑約420um，微囊內(nèi)的人胰腺癌腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2增生活躍。圖2為上述所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2的微囊包膜完整時(shí)在透射電子顯微鏡2500X下的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2圖，從圖2中可以看出人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2在微囊內(nèi)增生良好，從而表明了微囊技術(shù)有利于腫瘤細(xì)胞的增值。圖3為上述所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2的微囊包膜破損時(shí)，在透射電子顯微鏡2500X下的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2圖，從圖2中可以看出當(dāng)人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2增生至一定程度可脹破微囊包膜，從而表明了微囊化人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2增生良好。應(yīng)用實(shí)施例1
皮下移植瘤動(dòng)物模型的比較
將實(shí)施例1中步驟(5)所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2在37°C，CO2的濃度為5%的(X)2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6天后，調(diào)節(jié)微囊濃度至2' IO2個(gè)/mL，分別取IOOuL注射于12只裸鼠左肩背部皮下，建立皮下移植瘤即微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2動(dòng)物模型，即微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組；
同時(shí)，用0. 25%胰酶消化上述實(shí)施例1中步驟(1)中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2，冷PBS沖洗3次，用PBS重新懸成濃度2' IO7個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，將IOOuL單細(xì)胞懸液接種于12只裸鼠右肩背部皮下，建立皮下移植瘤即人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2 動(dòng)物模型，即人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組；
監(jiān)測(cè)微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組及人胰腺腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組及人胰腺癌腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2組中的腫瘤大小，按公式V=1//長(zhǎng)徑’短徑2，計(jì)算微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2組及人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組中腫瘤的大小，結(jié)果見(jiàn)表1，表1、皮下移植瘤動(dòng)物模型成瘤體積
將表1中的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組(表中的微囊化腫瘤細(xì)胞)與人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組(表中的腫瘤細(xì)胞)中所成腫瘤體積通過(guò)t檢驗(yàn)，得出第六周 P=O. 5348，P>0. 05 ；第七周 P=O. 5467，P>0. 05 ；第八周 P=O. 5988，P>0. 05。其中 P 均 >0. 05 說(shuō)明了微囊化人胰腺癌細(xì)胞懸液組與胰腺腫瘤細(xì)胞懸液組所成腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)繪制皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖4，從圖中可以看出微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2 (圖中為微囊化腫瘤細(xì)胞)與人胰腺癌腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2 (圖中為腫瘤細(xì)胞)在制備皮下移植瘤動(dòng)物模型方面無(wú)明顯差異。另外，皮下移植瘤動(dòng)物模型建立后的;Γ5日潛伏期后，接種人胰腺腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2及微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2部位均可見(jiàn)皮下灰色結(jié)節(jié)，逐漸呈圓形或橢圓形生長(zhǎng)。連續(xù)觀察八周，兩組裸鼠均全部存活，人胰腺腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組有兩只裸鼠一直沒(méi)有腫瘤長(zhǎng)出，接種陽(yáng)性率83. 3%。微囊化人胰腺腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組有一只裸鼠一直沒(méi)有腫瘤長(zhǎng)出，接種陽(yáng)性率91. 6796，兩種方法成瘤率統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異(C2 =0. 3810,/^=0. 5371,/^0. 05)。原位移植瘤動(dòng)物模型的比較
取14只裸鼠，10%水合氯醛(0. 3g/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，75%酒精消毒皮膚，取腹部正中切口，仔細(xì)分離胃脾，暴露胰腺，于胰腺體尾被膜下分別注射上述實(shí)施例1中步驟(1)中所得的人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2懸液IOOuL后常規(guī)關(guān)腹，即得原位移植人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2動(dòng)物模型，即人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組；
另取14只裸鼠，依照上述方法將實(shí)施例1中步驟(5)所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2在37°C，CO2的濃度為5%的(X)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6天后，調(diào)節(jié)微囊濃度至2' IO2 個(gè)/mL，分別取IOOuL于注射于胰腺體尾被膜下，即得原位移植微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2動(dòng)物模型，即微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組；
對(duì)上述的2組動(dòng)物模型，分別于原位移植瘤模型建立4周和8周時(shí)進(jìn)行動(dòng)物PET-CT檢查及剖腹探查即在第4周每組分別取7只裸鼠進(jìn)行PET-CT檢查后再進(jìn)行剖腹探查；在第 8周每組分別取7只裸鼠進(jìn)行PET-CT檢查后再進(jìn)行行剖腹探查，仔細(xì)記錄腫瘤質(zhì)量，觀察腫瘤侵襲周?chē)K器及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。收集腫瘤原發(fā)灶及所有可能發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的臟器，如肝、腎、脾、腸系膜、肺、腹膜、淋巴結(jié)等標(biāo)本。即分別于第4周及第8周每組取7只裸鼠通過(guò)尾靜脈麻醉后注射18FDG (
w氟-脫氧葡萄糖)0. 2ml進(jìn)行PET-CT檢查，并于影像學(xué)檢查后剖腹探查。檢查的結(jié)果如下
人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組中術(shù)后4周的7只裸鼠有2只裸鼠存在腹腔注射附近處腹膜聚集成片的多個(gè)白色小癌灶，術(shù)后8周的7只裸鼠有2只存在類(lèi)似情況，考慮為人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2懸液注射時(shí)腹腔污染所致的種植灶。結(jié)果表明，人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組建立裸鼠原位胰腺癌模型的成功率為71. 43%。
9
微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組建立裸鼠原位胰腺癌模型的成功率為100%，人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組的成功率為71. 43%，經(jīng)確切概率Fisher檢驗(yàn)， P=Q. 0489，/X0. 05，表明該兩組有顯著性差異。腫瘤細(xì)胞與荷瘤裸鼠數(shù)量及術(shù)后時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)表2
表2 腫瘤質(zhì)量與荷瘤裸鼠數(shù)量及術(shù)后時(shí)間的關(guān)系
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將表2中微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組(表中為微囊化腫瘤細(xì)胞)相對(duì)人胰腺腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組(表中為腫瘤細(xì)胞)在腫瘤質(zhì)量方面經(jīng)t檢驗(yàn)，結(jié)果如下
手術(shù)后4周無(wú)顯著性差異(0.0461 士 0.0399相對(duì)于0.0313 士 0. 021， =_0. 81， P=Q. 4379，P>Q. 05)；
但手術(shù)后第8周，兩組在腫瘤質(zhì)量方面經(jīng)t檢驗(yàn)有顯著性差異(0. 1284 士 0. 0284相 X^i1 0.0943 士 0.0571，i=_2. 28,/^=0. 0457，/X0. 05)，具體見(jiàn)圖 5，從圖 5 中可以看出微囊化人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2組(圖中為微囊化腫瘤細(xì)胞)相對(duì)于人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2 組(圖中為腫瘤細(xì)胞)在原位移植瘤模型成瘤質(zhì)量方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，從而說(shuō)明了微囊化人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2具有較快的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速率。經(jīng)過(guò)Wilc0x0n秩和檢驗(yàn)比較微囊化人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2組與人胰腺癌細(xì)胞 MiaPaCa-2組所成腫瘤質(zhì)量的差異，與 檢驗(yàn)的結(jié)果一致。手術(shù)后8周，剖腹探查顯示微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組中有裸鼠胰腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移至小腸系膜、肝臟等，這與上述的PET-CT發(fā)現(xiàn)相一致，而人胰腺癌腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2組未見(jiàn)明顯腫瘤轉(zhuǎn)移跡象。其中，微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組7只裸鼠中2只出現(xiàn)腸系膜轉(zhuǎn)移灶，而人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。肉眼可見(jiàn)人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組與微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2 組所成腫瘤無(wú)明顯差異，均呈圓形或橢圓形，質(zhì)地較硬，無(wú)完整的包膜形成，周?chē)┴S富。 腫瘤與胰腺組織分界不明顯，外觀呈粉紅色，表面有結(jié)節(jié)狀突起，腫瘤切面呈灰白色。表面有結(jié)節(jié)狀突起，表面有結(jié)節(jié)狀突起，腫瘤切面呈灰白色。少數(shù)裸鼠內(nèi)腫瘤中央部分組織液化壞死。鏡下H&E染色，人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組與微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞 MiaPaCa-2組所成腫瘤腫瘤大致相同，均可見(jiàn)原發(fā)腫瘤細(xì)胞大小形態(tài)不一，細(xì)胞異型明顯， 呈多邊形或圓形，細(xì)胞體積大，胞質(zhì)淡染，核大小、形態(tài)、染色不一，細(xì)胞核增大，核漿比例增高，核仁清除，核分裂相多見(jiàn)，可見(jiàn)巨核、雙核、多核。組織病理學(xué)檢查(H&E染色)證實(shí)了 PET-CT成像所檢測(cè)的確為胰腺癌轉(zhuǎn)移灶。免疫組化(參見(jiàn)AE1AE3，CA199，CAM5. 2，EGFR, MIB-I，VIM)表明微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組所成腫瘤與人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組所成腫瘤在腫瘤細(xì)胞病理學(xué)方面表現(xiàn)相同。
上述結(jié)果表明微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞MiaPaCa-2組原位注射相對(duì)于其他方法具有成瘤率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，腹腔播散率低以及能模擬腫瘤細(xì)胞早期進(jìn)展的過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)。上述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說(shuō)明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于將懸浮有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液加入到含Matrigel的海藻酸鈉溶液中，在高壓靜電環(huán)境下噴入到氯化鈣溶液中形成微球后與檸檬酸鈉溶液進(jìn)行離子置換反應(yīng)，最終得到微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于具體包括如下步驟(1)、人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液的制備在0)2培養(yǎng)箱中，人胰腺癌細(xì)胞在含有熱滅活胎牛血清的Dulbecco's Modified Eagle Medium培養(yǎng)液中，控制溫度為37°C、(X)2濃度為5%的條件下對(duì)人胰腺癌腫瘤細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后傳代1-2次；取上述培養(yǎng)過(guò)程中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌腫瘤細(xì)胞，以0. 25%胰酶對(duì)其進(jìn)行消化 20min后，置于離心機(jī)中以500>的速度離心15min，以4°C、pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液(PBS) 溶液洗滌三次，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)目至4' 107cells/mL,即得人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液；(2)、含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉溶液的制備按體積比即濃度為25%(v/v )的Matrigel 質(zhì)量濃度為1. 8%的海藻酸鈉溶液為1 20， 將濃度為25%(v/v )的Matrigel加入質(zhì)量濃度1. 8%的海藻酸鈉溶液中，得到含Matrigel 的海藻酸鈉溶液；然后加入步驟(1)所得的人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液加入到上述所得的含Matrigel的海藻酸鈉溶液中，使最終人胰腺癌腫瘤細(xì)胞濃度為2'107cellS/mL，即得含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉溶液；(3)、高壓靜電下形成膠珠通過(guò)高頻脈沖微囊制備儀，控制噴射速率為90mm/h，將步驟(2)所得的含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉溶液自上而下垂直噴射到質(zhì)量濃度為1. 1%的CaCl2溶液中，形成膠珠；上述的高壓脈沖微囊制備儀噴射過(guò)程控制電壓60kv，頻率90Hz，脈沖6ms ；(4)、含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的多聚賴(lài)氨酸/聚海藻酸鈉的包被將步驟(3)所得的膠珠懸浮于質(zhì)量濃度0.05%多聚賴(lài)氨酸溶液中5min，多聚賴(lài)氨酸與膠珠表面的海藻酸鈣發(fā)生聚電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)成膜，形成含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉 /聚賴(lài)氨酸微膠囊；將形成的含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉/聚賴(lài)氨酸微膠囊再懸浮于質(zhì)量濃度 0. 1%的海藻酸鈉溶液中l(wèi)Omin，中和其表面正電荷；(5)、微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液的制備將步驟(4)所得表面正電荷被中和后的含有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的海藻酸鈉/聚賴(lài)氨酸微膠囊浸泡于質(zhì)量濃度為3%的檸檬酸鈉溶液中l(wèi)Omin，用4°C、pH為7. 2的PBS溶液洗滌微囊，最終得到本發(fā)明的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的人胰腺癌細(xì)胞為MiaPaCa-2。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞用于腫瘤動(dòng)物模型的建立。
5.如權(quán)利要求4所述的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞用于腫瘤動(dòng)物模型的建立，其特征在于所述的動(dòng)物模型為皮下腫瘤動(dòng)物模型或原位腫瘤動(dòng)物模型。
6.如權(quán)利要求5所述的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞在皮下腫瘤動(dòng)物模型中的應(yīng)用，其特征在于將所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞在 370C，CO2的濃度為5%的(X)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6天后，調(diào)節(jié)微囊濃度至2' IO2個(gè)/mL，取IOOmL注射于裸鼠腋下或肩背部皮下，即得含有微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的皮下腫瘤動(dòng)物模型。
7.如權(quán)利要求5所述的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的制備方法所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞在原位腫瘤動(dòng)物模型中的應(yīng)用，其特征在于將所得的微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞在 37°C，CO2的濃度為5%的(X)2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后，調(diào)節(jié)微囊濃度至2' IO2個(gè)/mL，取 IOOmL原位注射于裸鼠胰腺包膜下，即得含有微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的原位腫瘤動(dòng)物模型。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。將懸浮有人胰腺癌腫瘤細(xì)胞懸液加入到含Matrigel的海藻酸鈉 溶液中，在高壓靜電環(huán)境下噴入到氯化鈣溶液中形成微球后與檸檬酸鈉溶液進(jìn)行離子置換反應(yīng)，最終得到微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞。所得微囊化人胰腺癌腫瘤細(xì)胞的大小均一，直徑約為420mm。微囊內(nèi)細(xì)胞增殖良好，細(xì)胞呈現(xiàn)立體式生長(zhǎng)。應(yīng)用于皮下腫瘤及原位腫瘤動(dòng)物模型，相對(duì)于傳統(tǒng)腫瘤細(xì)胞懸液注射法，建模成功率高，腫瘤生長(zhǎng)迅速。
文檔編號(hào)C12N11/08GK102337259SQ20111032496
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者葉靳華, 彭承宏, 王加祥, 程?hào)|峰, 董亞?wèn)|, 馬明哲 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院