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一種異源藍(lán)舌病毒雙鏈rna內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑的制備方法

文檔序號:399177閱讀:568來源:國知局
專利名稱:一種異源藍(lán)舌病毒雙鏈rna內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種異源藍(lán)舌病毒雙鏈RNA內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑的制備方法,該誘導(dǎo)劑可直接用于人體,誘導(dǎo)人體產(chǎn)生各種內(nèi)源性干擾素(ENIs), 賦予人體抗病毒、抗腫瘤以及廣泛的防病、治病和增強(qiáng)體質(zhì)的功能。
背景技術(shù)
由于具有廣泛的疾病防治功能的干擾素(Interferon,IFN)(董長垣主編,《現(xiàn)代分子病毒學(xué)》,武漢大學(xué)出版社,1996年10月)是人類至今所發(fā)現(xiàn)的最好的一類細(xì)胞因子; 也由于內(nèi)源性干擾素(Endodnterferon,ENI)較外源性干擾素(Exo-Interferon,EXI)有無可比擬的優(yōu)點,以及人類至今尚未獲得理想的內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(Endo-hterferon Inducer, EnII)等原因,人類一直在追求安全而有效的醫(yī)用ΕηΙΙ。一、干擾素及其分類IFNs是由干擾素誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生的一組多功能的可溶性糖蛋白,通過與細(xì)胞受體結(jié)合,至少可轉(zhuǎn)錄活化300多種IFN刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs), 發(fā)揮多種生物學(xué)活性。IFN不僅具有抗腫瘤和抗病毒作用,而且具有增強(qiáng)體質(zhì)的調(diào)理作用;既能治療疾病,又能預(yù)防疾?。患饶芸挂阎《?,也能抗未知病毒(包括烈性病毒,如 SARS-CoV、禽流感病毒)。國際IFN命名委員會規(guī)定,先根據(jù)IFN的動物來源進(jìn)行初分類;再根據(jù)IFN的抗原特性和分子結(jié)構(gòu)的差異分成不同的型;在特定的型內(nèi),按氨基酸序列或組成差異又可分為若干亞型。于是,根據(jù)氨基酸序列和受體的不同,IFN被分為I、II和III三種類型(Richard Ε. Randall, Stephen G. Interferons and viruses :an interplay between induction, signalling, antiviral responses and virus countermeasures. J of General Virology, 2008,89 :4-6) I型IFN包括a、3、r和ω亞型,主要參與抗病毒、抗腫瘤;II型IFN只有IFN-γ,主要參與誘導(dǎo)MHC類抗原的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng),其抗病毒作用比 I 型 IFN 弱;III 型 IFN 又稱為 IFN-λ,包括 IFN-λ 1、IFN-λ 2 禾口 IFN-λ 3,或 IL-29、 IL-28a和IL-28b等,在抗病毒、抗增殖及體外抗腫瘤等方面發(fā)揮近似于而又不同于I型干擾素的作用。IFN-α、IFN-β、IFN-γ均有抗病毒作用。但是,IFN-γ抗病毒活性遠(yuǎn)較I 型IFN低;IFN-α和IFN-β能相互加強(qiáng)抗病毒作用。IFN抗病毒具有廣譜性,但它對細(xì)胞的抗病毒作用是間接的,而且是非特異性(Richard Ε. Randall, Stephen G. Interferons and viruses :an interplay between induction,signalling,antiviral responses and virus countermeasures. J of General Virology, 2008,89 :4_6)。根據(jù)來源,IFNs可分為內(nèi)源性干擾素(Endo-Interferon,ENI)和外源性干擾素 (EXI)。EXI就是在體外應(yīng)用外源性干擾素誘導(dǎo)劑(Exo-Interferon Inducer, ExII)刺激離體培養(yǎng)細(xì)胞所生產(chǎn)的或基因工程合成的,而后用于機(jī)體的IFNs ;ENI則是用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(EnII)于體內(nèi),直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的IFNs。
近年來,有關(guān)誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生機(jī)理的研究,IFN抗病毒、抗腫瘤和調(diào)理機(jī)體功能的藥理和生理作用的研究取得了令人滿意的結(jié)果,顯示了其符合機(jī)體自然防御功能的特性,理所當(dāng)然地為抗病毒和抗腫瘤治療開辟了新途徑。二、干擾素的產(chǎn)生與干擾素誘導(dǎo)劑細(xì)胞基因組密碼著IFN基因。由于IFN基因抑制物(IFN suppressor)與IFN基因結(jié)合,所以,在一般情況下,IFN基因處于抑制狀態(tài)。能誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的物質(zhì)統(tǒng)稱為干擾素誘導(dǎo)劑(Interferon inducer)。當(dāng)干擾素誘導(dǎo)劑作用于細(xì)胞膜,便會解脫IFN基因抑制物與IFN基因的結(jié)合,IFN操縱子開始轉(zhuǎn)錄,合成mRNA,mRNA迅速轉(zhuǎn)移至胞漿,在核糖體上轉(zhuǎn)譯出IFN前體,切除信號肽后,成熟的IFN分泌到細(xì)胞外。研究表明,病毒感染細(xì)胞后,經(jīng)相同機(jī)制可同時誘生III型和I型干擾素,但兩者表達(dá)量不同(Osterlund P, Veckman V, Siren J, et al. Gene expression and antiviral activity of alpha/bela intederons and interleukin-29 in virus-infected human myeloid dendritic cells. J Virol,2005,79 [15] :9608-9617, Contoli M, Message SD, Laza-Stanca V, et al. Role of deficient typeIII interferon-lambda production in asthma exacerbations. Nat Med,2006,12[9] :1023-1026, Khaitov MR, Laza-Stanca V, Edwards MR, et al. Respiratory virus induction of alpha-, beta一and lambda一interferons in bronchial epithelial cells and peripheral blood mononuclear cells. Allergy, 2009,64[3] :375-386),表達(dá)的組織也不同,例如,IFN-λ 應(yīng)答主要產(chǎn)生于上皮細(xì)胞,尤其是在肺、皮膚和腸道,而幾乎所有類型的細(xì)胞均能產(chǎn)生I型干擾素(Sommereyns C, Paul S, Staeheli P, et al. IFN-Iambda(IFN-Iambda) is expressed in a tissue-dependent fashion and primarily acts on epithelial cells in vivo. PLoS Pathog,2008,4[3] :el000017)。在某些條件下,IFN-λ和I型干擾素并不同時表達(dá)(Doyle SE, Schreckhise H, Khuu-Duong K, et al. Interleukin-29 uses a type I interferon-like program to promote antiviral responses in human hepatocytes. Hepatology,2006,44[4] :896-906)。幾乎所有的脊椎動物(包括人)細(xì)胞都可產(chǎn)生IFN, 但無論在體內(nèi)還是體外,必須由IFN誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)生。按照干擾素誘導(dǎo)劑的本質(zhì),可將其分為病毒IFN誘導(dǎo)劑、雙鏈RNA IFN誘導(dǎo)劑、 代謝物IFN誘導(dǎo)劑和一些病原菌IFN誘導(dǎo)劑等。RNA病毒具有良好的IFN誘導(dǎo)作用,如新城疫病毒(NDV)、豬冠狀病毒(TGEV)、豬水泡病病毒(SVDV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、雞傳染性氣管炎病毒(BV)等。一些DNA病毒也有誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的能力,例如雞馬立克氏皰疹病毒 (MDHV),但其誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的能力較RNA病毒低。除病毒外,衣原體、立克次體、細(xì)胞內(nèi)毒素、 真菌提取物等也能誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生。盡管如此,病原體是不能用作干擾素誘導(dǎo)劑的。目前主要是滅活的新城疫病毒(NDV)用作外源性干擾素誘導(dǎo)劑(EXI)。三、內(nèi)源性干擾素的優(yōu)點和內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑EXI存在諸多缺點,如所用INF的種類單一,所以,相對于ENI,其藥物和生理功能較差;INF屬蛋白質(zhì)多肽類,所以,EXI用于人體為異源抗原蛋白,發(fā)揮具有免疫原性,會引起機(jī)體異源反應(yīng)和依賴性,同樣具有較大的毒副作用;而且其制備復(fù)雜、價格昂貴,保存和運(yùn)輸麻煩,所以,限制了 EXI的大量生產(chǎn)和普及應(yīng)用。ENI則是用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(EnII)于體內(nèi),直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的IFNs。在這種情況下,機(jī)體變成了生產(chǎn)干擾素的復(fù)合工廠,以生產(chǎn)各型干擾素,發(fā)揮抗腫瘤、抗感染和調(diào)理作用。ENI是由機(jī)體自身產(chǎn)生的天然的復(fù)合型干擾素,即白細(xì)胞干擾素、纖維母細(xì)胞型干擾素和免疫型干擾素等,由多種不同類型的細(xì)胞誘導(dǎo)生成(Sang-Myeong L,Susan KS, Steven B. Kleiboeker Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates differ in in vitro interferon phenotypes Veterinary Veterinary. Immunology and Immunopathology,2004,102,217-231)。所以,用 EnII 在人體內(nèi)直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的·Ι能克服EXI的諸多不足,如誘生的IFN種類齊全、體內(nèi)濃度高、沒有異源蛋白質(zhì)的免疫原性(即過敏反應(yīng)和排斥反應(yīng))、沒有依賴性、無需提純、造價低廉、……等。也由于 IFNs具有相對種屬特異性,所以,內(nèi)源性干擾素的抗病毒、抗腫瘤以及調(diào)理功能活性最強(qiáng)。 同時,EOT既可作為治療用藥,也可以作為預(yù)防用藥??梢姡哂袕V泛的疾病防治功能的IFNs是人類至今所發(fā)現(xiàn)的最好的一類細(xì)胞因子;內(nèi)源性干擾素(ENI)較外源性干擾素(EXI)有無可比擬的優(yōu)點。然而,欲想得到ENI, 關(guān)鍵是要獲得能安全應(yīng)用于人體的、能有效誘導(dǎo)人體產(chǎn)生ENI的、造價低廉的、便于工業(yè)化生產(chǎn)的、不污染環(huán)境的、資源豐富的內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(EnII)。目前用于人體的商業(yè)化EnII主要是多聚肌苷酸(Polyinosinic Polycytidylic Acid,Poly [I: C],PIC),為人工合成的小分子雙鏈 RNA (Chadha KC, Dembinski WE, Dunn CB, et al. Effect of increasing thiolation of the polycytidylic acid strand of poly I :poly C on the alpha, beta and gamma interferon-inducing properties,antiviral and antipmliferative activities. Antiviral Res,2004,64[3] :171-7),國內(nèi)于 1983 年廣泛用于臨床,作為廣譜抗病毒藥物使用。Poly[I:C]的藥理是通過刺激在體細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性IFNs(ENI)來發(fā)揮其臨床效應(yīng),它能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能、殺傷病毒感染的細(xì)胞、阻止病毒蛋白的合成、抑制病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制繁殖、抑制病毒從細(xì)胞內(nèi)釋放、阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞、防止病毒擴(kuò)散、保護(hù)正常細(xì)胞不受病毒侵犯、增強(qiáng)未感染細(xì)胞的抗病毒能
力......等;同時,它具有免疫調(diào)節(jié)功能,刺激和促進(jìn)細(xì)胞活性從而增強(qiáng)清除病毒感染細(xì)
胞的能力,臨床已用于腫瘤和白血病的治療,病毒性肝炎、痘類病毒性感染等的治療。然而,近年發(fā)現(xiàn)Poly[I:C]在人體和其他靈長類體內(nèi)易被血清核酸酶破壞、誘生 IFN產(chǎn)生的效能低。更有文獻(xiàn)報道Poly[I:C]會引起自身免疫性疾病,會導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱、造血機(jī)能下降、促紅細(xì)胞生成素減少、白細(xì)胞減少、肝脾細(xì)胞破壞、血壓及凝血功能失常、轉(zhuǎn)氨酶升高、腎功能損傷等一系列毒副作用,從而大大限制了 Poly[I:C]的市場和臨床應(yīng)用(聶實踐、胡冬琴,錯位雙鏈核糖核酸的熱原反應(yīng),中國生物工程,2003,23[2] :97-98)。所以,尋找和開發(fā)新的第二代醫(yī)用EnII是全世界生物醫(yī)學(xué)家們角逐的領(lǐng)域,人類一直在追求安全而有效的醫(yī)用EnII。四、BTV NdsRNA具備發(fā)展成理想的醫(yī)用EnII的潛能人類已認(rèn)識到“病毒具有誘導(dǎo)IFN的作用”、“人工合成的dsRNA具有誘導(dǎo)IFN的作用”,那么,在理論上講,來自dsRNA病毒基因組的dsRNA分子應(yīng)該具有發(fā)展成EnII的潛能。動物藍(lán)舌病毒(Bluetongue Virus,BTV)(董長垣主編,《現(xiàn)代分子病毒學(xué)》,武漢大學(xué)出版社,1996 年 10 月,Hu J,Dong CY,Jos印h L,Chen J, Chen DE, Liang K, Zhang WY. In vitro Selective cytotoxic effect of human cancer cells by Bluetongue virus-10. Acta 0ncologica,2008,47 :124-134)是家畜綿羊的一種dsRNA病毒,與人類及其他動物等存在種族屏障。數(shù)百年的觀察已經(jīng)結(jié)論BTV宿主范圍非常狹窄,對同科的牛不致病,對山羊兄弟也很少輕微致疾?。幌诞愒磩游锊《?,不引起人類任何疾??;含分段dsRNA,帶依賴 RNA的RNA聚合酶,故提取和純化的dsRNAs沒有感染性;為dsRNA病毒,沒有腫瘤源性;系天然病毒,其核酸是天然核酸,毫無影響生態(tài)平衡的后顧之憂;BTV本身就是最好的天然干擾素誘導(dǎo)劑。BTV基因組為雙鏈RNA分子,耐RNA酶(RNAase);便于離體增殖和純化制備, 有利于產(chǎn)業(yè)化。這些特點賦予了它極其顯著的醫(yī)用和生物工程價值。人類早已結(jié)論,BTV不引起人類任何疾?。唤暧钟辛Φ刈C明了 “dsRNA分子的安全性”。過去的近十年,申請人和國際同行又已反復(fù)證明了 dsRNA病毒科成員,如人呼腸孤病毒(Reovirus,RV)、BTV 既具有靶向抗人癌作用(Hu J,Dong CY, Joseph L,Chen J, Chen DE, Liang K, Zhang WY. In vitro Selective cytotoxic effect of human cancer cells by Bluetongue virus-10. Acta Oncologica,2008,47 :124-134 ;陳杰、胡俊、董長垣、梁科、戴瑩、高婧,藍(lán)舌病毒湖北株致人肝癌H印-3B和人肺腺癌A549細(xì)胞死亡機(jī)理的研究, 中華腫瘤學(xué)雜志,2007,四[7] :505-509,陽海燕、董長垣、劉軍、李小成、鄧庚糧、畢國明,五株藍(lán)舌病毒對宮頸癌HeLa細(xì)胞作用特性的比較研究,中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2010, 30 [7] :621-625,杜賢進(jìn)、周峰、董長垣、郭應(yīng)祿、張杰,藍(lán)舌病毒HbC3對人腎癌細(xì)胞的感染殺傷作用,中華實驗外科雜志,2010,27 [4] =504-506),又對人體十分安全,并有顯著誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生IFN的作用。最近,我們亦證實了 BTV對人正常細(xì)胞如人胚肺細(xì)胞、人氣管平滑肌細(xì)胞等無感染性;用實驗動物小鼠(非敏感動物)作半數(shù)致死量測定尚未尋找到LD5tl,顯示了 BTV dsRNA對實驗小鼠的安全性。須知,人對BTV也是非敏感性的。近年,申請人又在離體培養(yǎng)的人源細(xì)胞(正常/腫瘤細(xì)胞)上比較研究了 BTV、BTV 裸露的dsRNA分子(NdsRNA)和商業(yè)化的Poly [I C]的安全性和誘導(dǎo)IFN的能力,結(jié)果表明 ① BTV 對人源正常細(xì)胞安全(Hu J,Dong CY, Joseph L,Chen J, Chen DE, Liang K,Zhang WY. In vitro Selective cytotoxic effect of human cancer cells by Bluetongue virus-10. Acta Oncologica, 2008,47 :124-134,陳杰、胡俊、董長垣、梁科、戴瑩、高婧,藍(lán)舌病毒湖北株致人肝癌H印-3B和人肺腺癌A549細(xì)胞死亡機(jī)理的研究,中華腫瘤學(xué)雜志, 2007, 29 [7] :505-509,陽海燕、董長垣、劉軍、李小成、鄧庚糧、畢國明,五株藍(lán)舌病毒對宮頸癌HeLa細(xì)胞作用特性的比較研究,中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2010,30 [7] =621-625, 杜賢進(jìn)、周峰、董長垣、郭應(yīng)祿、張杰,藍(lán)舌病毒HbC3對人腎癌細(xì)胞的感染殺傷作用,中華實驗外科雜志,2010,27 ] =504-506);②BTVNdsRNA對離體培養(yǎng)的人正常細(xì)胞安全;③BTV NdsRNA能有效地誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的人源細(xì)胞(包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)產(chǎn)生IFN-β ;
④BTVNdsRNA體外誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)量顯著高于目前臨床上應(yīng)用的Poly [I C] (P <0.01);
⑤BTVNdsRNA能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN而殺死離體培養(yǎng)的人癌細(xì)胞等等(戴瑩、陳冬峨、高婧、胡俊、董長垣,異源藍(lán)舌病毒dsRNA與Poly[I:C]誘導(dǎo)人源體細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的比較研究,中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2008二8[3] :218-221,王海琪、董長垣、陳東娥、陳曉、 郭淑芳、劉文培,BTV及其dsRNA分子誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡,中國病毒學(xué),2005,20 [3] 268-271)。近來,申請人進(jìn)而又在實驗動物體內(nèi)比較研究了 BTV裸露的dsRNA分子(BTV NdsRNA)和商業(yè)化的Poly[I:C]的安全性和誘導(dǎo)IFN的能力。結(jié)果顯示了 ①BTV NdsRNA 對實驗動物的安全性;②BTV NdsRNA能有效地誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素(ENIs),如IFN-a、IFN- β、IFN- γ等;③BTV NdsRNA誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生ENI- β的水平高于 ENI-α ;④BTV NdsRNA誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生ENI-β的水平具有一定的量效關(guān)系;⑤同劑量的BTV NdsRNA誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生ENI-β的能力顯著高于Poly [I :C] (P < 0. 01);⑥BTV NdsRNA在實驗動物體內(nèi)誘導(dǎo)IFN-a、IFN-i3產(chǎn)生的速度快,在完成動物接種后約池即達(dá)高峰;……。最近,我們建立起了流感病毒Hmi感染小鼠模型和疾病模型,并借助該動物模型,以動物模型組為空白對照、以病毒感染動物模型組為條件對照、以目前最好的商業(yè)化干擾素誘導(dǎo)劑Poly[I:C]為陽性藥物對照,系統(tǒng)地開展了 BTVNdsRNA體內(nèi)預(yù)防流感病毒感染的作用研究、BTV NdsRNA體內(nèi)治療流感肺炎的作用研究;并進(jìn)一步驗證了 BTV NdsRNA對疾病動物的安全性、誘導(dǎo)疾病動物產(chǎn)生EOT的有效性、以及體內(nèi)誘導(dǎo)內(nèi)源性干擾素EOT的種類,從而進(jìn)一步確認(rèn)了 BTV NdsRNA分子的醫(yī)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑EnII的極大潛能。研究結(jié)果顯示(I)BTVNdsRNA處理的小鼠,無明顯不良反應(yīng)出現(xiàn),再一次提示了 BTVNdsRNA在機(jī)體內(nèi)的安全性。(2)real time RT-PCR試驗結(jié)果顯示BTV NdsRNA處理對于流感病毒Hmi感染小鼠,不管是預(yù)防還是治療,均能有效抑制鼠肺內(nèi)的流感病毒的復(fù)制,且效果均優(yōu)于 Poly[I:C]。(3)在有限觀察時間內(nèi)(僅7天),HE染色病理切片顯示BTV NdsRNA能有效預(yù)防流感病毒Hmi感染,高度顯著地減輕小鼠肺炎;并且,BTV NdsRNA預(yù)防流感病毒Hmi感染小鼠肺炎效果顯著地優(yōu)于Poly [I C]。(4)在有限觀察時間內(nèi)(僅7天),HE染色病理切片顯示=BTVNdsRNA能高度有效地治療流感病毒Hmi感染導(dǎo)致的小鼠肺炎;并且,其治療流感病毒Hmi感染小鼠肺炎效果顯著地優(yōu)于Poly[I:C],流感病毒感染小鼠肺組織病變改善更為明顯。根據(jù)趨勢,隨著觀察的時間延長,BTV NdsRNA治療組動物肺組織病變會恢復(fù)得更好。(5) ELISA檢測結(jié)果顯示BTV NdsRNA和Poly [I C]都能有效誘導(dǎo)Hmi感染小鼠血清IFN-α、IFN-β、IFN-γ產(chǎn)生,并且,BTV NdsRNA誘導(dǎo)內(nèi)源性干擾素產(chǎn)生的能力顯著地優(yōu)于 Poly [I: C]。我們的以上研究明顯地提示申請人BTV NdsRNA具備發(fā)展成理想的醫(yī)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(ENI Inducer, EnII)的潛能,具有顯著的發(fā)展成新型抗病毒藥物的潛能。申請人:研究BTV NdsRNA ΕηΙΙ,無論體內(nèi)還是體外,均以Poly [I C]為對照。無論在理論上,還是在體內(nèi)、體外研究結(jié)果上,BTV NdsRNA EnII均優(yōu)于Poly [I: C]。申請人考慮, 其原因可能是(A)Poly[I:C]為人工合成的dsRNA,而BTV NdsRNA則是天然的dsRNA ; (B) Poly [I C]為較小分子dsRNA,而BTVNdsRNA則是大分子dsRNA。五、dsRNA分子誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IFNs的細(xì)胞分子機(jī)理已很成熟Poly [I C]、霉菌和細(xì)菌的dsRNA、核酸類,以及我們的BTVNdsRNA等都是dsRNA分子,均能誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生。近年已證實,TLR3 (Toll like receptor 3)和RIG-I/MDA5細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是識別dsRNA、誘導(dǎo)I型IFN表達(dá)的重要分子。TLR3主要表達(dá)于免疫細(xì)胞,定位于細(xì)胞內(nèi)涵體(endosome)膜上的模式識另授體(pattern recognition receptor, PRR), 可識別經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞囊泡的dsRNA分子,誘導(dǎo)I型IFN表達(dá)。RIG-I/MDA5定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PRR,識別胞質(zhì)內(nèi)dsRNA,通過不依賴TLR3的方式誘導(dǎo)IFN合成。這些研究成就為外源dsRNA通過受體結(jié)合,激活細(xì)胞信號通路,誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生顯示了亮點(Alexopoulou L, Holt AC,Medzhitov R,et al. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappa B by toll-like receptor 3. Nature, 2001,413 [6857] :732-738)。有關(guān)干擾素誘導(dǎo)劑、IFNs的產(chǎn)生和IFNs發(fā)揮各種重要生理功能的細(xì)胞分子機(jī)理已經(jīng)研究得很清楚。關(guān)于TLR3細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與dsRNA分子。TLRs是單次跨膜受體,分為胞外區(qū)、 跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)有LRRs(leucine-rich repeats)結(jié)構(gòu)域,由18 31個富含亮氨酸的重復(fù)序列和半胱氨酸結(jié)構(gòu)所組成,識別特定的病原相關(guān)分子模式(PAMP)配體,如病原體組分、病原體產(chǎn)物、dsRNA。胞內(nèi)區(qū)是TLR向下游傳遞信號的核心元件,由大約200個氨基酸殘基組成,因其與IL-I受體的胞內(nèi)區(qū)相似,故稱之為Toll/IL-Ι受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptor homologous region, TIR)(Martin MU, Wesche H. Summary and comparison of the signaling mechanisms of the To 11/interleukin-1 receptor fam ily.Biochim Biophys Acta, 2002,1592 [3] :265-280)。TLRs家族成員的胞外區(qū)結(jié)構(gòu)的差異性較大,是結(jié)合不同配體的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。在已知的11個TLRs中,只有TLR3識別外源dsRNA、誘導(dǎo)I型 IFN合成(Alexopoulou L,Holt AC,Medzhitov R, et al. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappa B by toll-like receptor 3. Nature,2001,413[6857] 732-738)。TLR3主要在DC細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá),主要定位于DC細(xì)胞內(nèi)涵體(Matsumoto M, Funami K, Tanabe M, et al. Subcellular localization of Toll-like receptor 3 in human dendritic cells. J Immunol, 2003,171 [6] :3154 3162.)和成纖維細(xì)胞表面 (Matsumoto Μ, Kikkawa S, Kohase Μ, et al. Establishment of a monoclonal antibody against human Toll-like receptor 3 that blocks double-stranded RNA-mediated signaling. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 293 [5] :1364 1369)。TLR3 信號通過絲氨酸/蘇氨酸(kr/Thr)磷酸化、二聚化及其核置換激活I(lǐng)FN調(diào)節(jié)因子-3(IRF-3)。Ser/ Thr激酶TBK-I是TLR3介導(dǎo)活化及磷酸化IRF-3的關(guān)鍵。關(guān)于RIG-I/MDA5細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與dsRNA分子。動物細(xì)胞還存在不依賴TLR3 識別dsRNA的受體。視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I(RIG-I)是細(xì)胞內(nèi)識別病毒雙鏈RNA的一種受體,屬含 DexD/H box的dsRNA解旋酶家族成員。RIG-I的C端是解旋域,可以借助解旋酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合 dsRNA(人工合成的和病毒的),并以ATP酶依賴的方式解開雙鏈RNA ;N端是2個串聯(lián)的半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域(CARD)。誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)需要RIG-I,但是,RIG-I并不參與IFN-β 下游的信號通路(Kato H, Sato S, Yoneyama M, et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity, 2005,23 [1] : 19 28)。MDA5 也是一個能結(jié)合 dsRNA、激活 IRF-3 (IFN regulatory factor 3)、誘導(dǎo) IFN 表達(dá)的信號分子(Kata H, Takeuchi 0, Sato S,et al. Differential roles of MDA5 and RIG—I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature, 2006,441 [7089] :101 105)。MDA5N 端也有 CARD 結(jié)構(gòu)域,C端也有結(jié)合dsRNA的DExD/H box RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域。全長MDA5并非誘導(dǎo)IRF3 激活和IFN表達(dá)的必要條件。只要C端DExD/H box RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合dsRNA,MDA5才被激活(Yoneyama M, Kikuchi M, Matsumoto K, et al. Shared and unique functions of the DExD/H-box helicases RIG-I, MDA5, and LGP2 in antiviral innate immunity. JImmunol, 2005,175 [5] J851 沘58)。MAVS和CARDIF在RIG-I信號通路中具有重要作用。 MAVS定位于細(xì)胞線粒體外膜,是RIG-II下游信號通路中的重要功能分子,為RIG-I和MDA5 下游的信號分子,將信號傳遞給激酶IKK ε和ΤΒΚ1,進(jìn)而激活I(lǐng)RF3(kth R B, Sun L, Ea C K, et al. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell,2005,122[5] 669 ~ 682)。TLRs誘導(dǎo)I型IFN表達(dá)。I型干擾素包括IFN- α、IFN- β、IFN- ε和IFN- λ,是連接天然免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵樞紐分子。TLRs能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)產(chǎn)生I型干擾素(Hoebe K, Janssen E M, Kim S 0, et al. Upregulation of costimulatory molecules induced by lipopolysaccharide and double-stranded RNA occurs by Trif-dependent and Trif-independent pathways. Nat Immunol, 2003, 4[12] :1223 1229)。不同的 TLRs 誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素能力并不相同,111 3、11^4、11^7、11^9能誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-α / β,而其他 TLRs似乎不能。同樣地,不同的DC細(xì)胞亞群產(chǎn)生I型干擾素的能力也不一樣。pDC是I型干擾素分泌細(xì)胞,高表達(dá)TLR7和TLR9,受到相應(yīng)配體刺激時誘導(dǎo)大量的IFN- α ;mDC雖然也表達(dá)TLR7和TLR9,但是受體被激活后產(chǎn)生的細(xì)胞因子是IL-12。人類基因組中編碼有各種干擾素基因,人類細(xì)胞有復(fù)雜的干擾素調(diào)控系統(tǒng)。目前已發(fā)現(xiàn)有二條途徑介導(dǎo)TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo),一為髓樣分化因子88 (myeloid differentiation factor 88MyD88) it Wi^k^ (Akashi S, Shimazu R, Ogata H, et al. Cutting edge cell surface expression and lipopolysaccharide signaling via the toll-like receptor 4—MD—2 complex on mouse peritoneal macrophages. J Immunol.2000, 164[7] :3471-3475);另一條為 MyD88 非依賴性途徑(Kawai Τ, Adachi 0,Ogawa Τ, et al. Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin. Immunity,1999,11[1] 115-12 。MyD88分子是大多數(shù)TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的接頭分子,但是,MyD88功能缺失并不能完全終止所有的TLRs信號。所以,TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必然還存在MyD88非依賴信號途徑。 dsRNA被TLR3胞外LRR結(jié)構(gòu)域識別,引起胞內(nèi)IlR結(jié)構(gòu)域變化,與TRIF的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用,通過接頭分子Trif介導(dǎo)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),其中Trif-RIPl或者Trif_TRAF6通路激活 NF-k B誘導(dǎo)炎癥因子的分泌,而Trif-TBKl/IKK ε通路激活I(lǐng)RFs,誘導(dǎo)I型IFN分泌(Kawai T,Akira S. TLR signaling. Cell Death Differ, 2006,13 [5] :816 825)。TLRs 的胞外 LRR結(jié)構(gòu)域識別不同的PAMP,引起胞內(nèi)IlR結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化,再招募下游含IlR結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MyD88、TRIF (TICAM-I)、TRAM、TIRAP (Mal)等向細(xì)胞核內(nèi)傳遞信號,激活 NF-k B、IRF-3, AP-I (activation protein 1)等家族的轉(zhuǎn)錄因子,后者在IFN基因的增強(qiáng)子上形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,調(diào)控I型IFN基因表達(dá)。六、干擾素受體及其信號通道產(chǎn)物IFN釋出胞外,與靶細(xì)胞特異性受體結(jié)合后,激活與受體胞漿端相連的“兩面神”激酶(Janus kinases, JAKs),JAKs再磷酸化激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激動子(signal transducers and activators oftranscription, STATs)中的酷氛酸殘基,使信號放大。 粦酸化激活的STATs酪氨酸殘基與磷酸化酪氨酸的Src同源區(qū)2 (Sffi)形成同二聚體和異二聚體。異二聚體和同二聚體都可與IRF結(jié)合,組成不同的三聚體。不同的三聚體與IFN激活的調(diào)節(jié)序列(IFN stimulated regulatory elements, ISREs)結(jié)合以分別驅(qū)動 IFN-α /β調(diào)控的基因表達(dá)或IFN-Y調(diào)控的基因表達(dá)。以前認(rèn)為 dsRNA 依賴蛋白激 Bl (double-stranded RNA-dependent Protein Kinase, PKR)是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的重要因子,dsRNA誘導(dǎo)的PKR途徑是IFN產(chǎn)生的主要信號傳導(dǎo)通路。近年的研究工作已經(jīng)搞清,蛋白激酶HiR以及2' -5'寡聚腺苷酸合成酶 (OAS)處于干擾素介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)的下游,并不參與干擾素本身的基因表達(dá)的調(diào)控過程, 而是蛋白激酶PKR和2' -5'寡聚腺苷酸合成酶(OAS)參與IFN介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)(Smith E J, Marie I,Prakash A, et al. IRF3 and IRF7 phosphorylation in virus-infected cells does not require double-stranded RNA-dependent protein kinase R or Ikappa B kinase but is blocked by Vaccinia virus E3L protein. J Biol Chem,2001,276[12] 8951 8957)。dsRNA分子及其誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究成績?yōu)闈撛诘厥褂肂TV NdsRNA作醫(yī)用內(nèi)源性IFN誘導(dǎo)劑以誘導(dǎo)人體內(nèi)源性IFN提供了理論依據(jù)。這一系列的基礎(chǔ)理論研究成績結(jié)合申請人的前期應(yīng)用基礎(chǔ)理論研究成績已經(jīng)為申請人提出的本發(fā)明專利奠定了堅實的理論基礎(chǔ)和技術(shù)條件。利用體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖BTV,提取dsRNA,制備內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑,直接用于人體,遵循機(jī)體自身防御反應(yīng)方式誘導(dǎo)各種內(nèi)源性干擾素,賦予人體以抗病毒病臨床治療和預(yù)防、抗腫瘤的治療和聯(lián)合治療、以及廣泛的防病、治病和增強(qiáng)體質(zhì)的功能,具有高度的安全性和高效性。七.小結(jié)本發(fā)明是在我們前期以BTV NdsRNAs作為外源性干擾素誘導(dǎo)劑(ExII)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生外源性干擾素(EXI)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。如前所述,IFNs可分為內(nèi)源性干擾素(ENI)和EXI。EXI就是在體外用ExII刺激離體培養(yǎng)細(xì)胞所生產(chǎn)的或基因工程合成的而后用于機(jī)體的IFN。EXI存在諸多缺點,如所用INF的種類單一,所以,相對于ENI,其藥物和生理功能較差;INF屬蛋白質(zhì)多肽類,所以, EXI用于人體為異源抗原,發(fā)揮免疫原性,會引起機(jī)體異源反應(yīng)和依賴性,同樣具有較大的毒副作用;而且其制備復(fù)雜、價格昂貴,保存和運(yùn)輸麻煩,所以,限制了 EXI的大量生產(chǎn)和普及應(yīng)用。亦如前所述,ENI則是用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(EnII)于體內(nèi),直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的內(nèi)源性IFNs。用EnII在人體內(nèi)直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的ENI能克服EXI的諸多不足,如誘生的 IFN種類齊全、體內(nèi)濃度高、沒有異源蛋白質(zhì)的免疫原性(即過敏反應(yīng)和排斥反應(yīng))、沒有依賴性、無需提純、造價低廉、……等。也由于IFNs具有相對種屬特異性,所以,ENI的抗病毒、抗腫瘤以及調(diào)理功能活性最強(qiáng)。同時,EOT既可作為治療用藥,也可以作為預(yù)防用藥。然而,欲想得到ENI,關(guān)鍵是要獲得能安全應(yīng)用于人體的、能有效誘導(dǎo)人體產(chǎn)生EOT的、造價低廉的、便于工業(yè)化生產(chǎn)的、不污染環(huán)境的、資源豐富的ΕηΙΙ。目前,人類所用的最好的商業(yè)化的EnII是Poly [I: C]。如前所述,Poly [I C]具有一系列的缺陷,市場和臨床應(yīng)用都受到極大限制。所以,尋找和開發(fā)新的第二代醫(yī)用EnII 是全世界生物醫(yī)學(xué)家們角逐的領(lǐng)域,人類一直在追求安全而有效的醫(yī)用ΕηΙΙ。本發(fā)明正是提供了這樣一種全新的優(yōu)于Poly[I:C]的內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑 (EnII)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足,本發(fā)明的目的在于提供了一種應(yīng)用于人體產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素的全新的異源藍(lán)舌病毒雙鏈RNA內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(BTV NdsRNA EnII)。為了實現(xiàn)臨床應(yīng)用,本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種異源藍(lán)舌病毒雙鏈RNA內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑的制備方法,其步驟是1.細(xì)胞培養(yǎng)以世界衛(wèi)生組織推薦為生產(chǎn)人用疫苗的理想細(xì)胞,一非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)或幼倉鼠腎傳代細(xì)胞(BHK-21)為病毒擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞在37°C、5% C02、10%小牛血清、DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。2. dsRNA BTV增殖待細(xì)胞長至80% _90%匯合時,棄培養(yǎng)液,用pH 7. 4的IXPBS 洗滌貼壁細(xì)胞1-2次,接種BTV病毒株懸液1. Oml于培養(yǎng)瓶,37°C吸附1_2小時后,棄病毒液,以含2%小牛血清的添加DMEM培養(yǎng)基在37°C,5% CO2條件下維持培養(yǎng)。隨后每12小時光鏡下觀察一次,至細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),即當(dāng)CPE達(dá)90%時收獲病毒。3. dsRNABTV的提取和純化收獲培養(yǎng)的dsRNABTV按本研究室獲得的高活性、高純度、高通量制備病毒的“反向免疫共沉淀技術(shù)”(PARA ;)工藝(中國專利ZL2004100U605. 9) 提取和純化dsRNA BTV。4. BTV dsRNA 的提取(a) PEG6000濃縮上述提取和純化的BTV ;(b)裂解液裂解BTV ;(c)磁珠法提取 BTV dsRNA ;(d)蔗糖濃縮純化的dsRNA ;(e)-20°C保存,備用。5.病毒基因組dsRNA的鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù),分析電泳圖譜鑒定。6.提取dsRNA純度鑒定采用紫外分光光度法(根據(jù)0擬60/0擬80比值)結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)判斷所提取dsRNA的純度。7.雙鏈RNA濃度的測定采用紫外分光光度法測定雙鏈RNA含量,根據(jù)dsRNA濃度=OD260 X 稀釋倍數(shù) Χ40(μ g/ml)。8.制備成注射劑型,經(jīng)肌內(nèi)注射使用。實驗研究統(tǒng)計分析結(jié)果及說明本發(fā)明所作的BTV dsRNAs體內(nèi)誘導(dǎo)內(nèi)源性干擾素產(chǎn)生的研究是在我們前期在體外培養(yǎng)細(xì)胞上所作的BTV dsRNAs誘導(dǎo)外源性干擾素的基礎(chǔ)上開展的。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果1.能非常安全地運(yùn)用于人體。BTV不引起人類任何疾病;含分段dsRNA,帶依賴 RNA的RNA聚合酶,故提取和純化的BTV dsRNAs沒有感染性;BTV為dsRNA病毒,沒有腫瘤源性;為天然病毒,不會影響生態(tài)平衡。所以,本發(fā)明制備的新的內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑BTV NdsRNAEnII系天然病毒雙鏈RNA,能非常安全地運(yùn)用于人體。2.為新的理想的天然核酸藥物。本發(fā)明制備的EnII能直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生種類齊全的內(nèi)源性干擾素(ENIs)。干擾素(Interferons,IFNs)是人類至今所發(fā)現(xiàn)的最好的一類細(xì)胞因子,不僅具有抗腫瘤和抗病毒作用,而且具有增強(qiáng)體質(zhì)的調(diào)理作用;既能治療疾病, 又能預(yù)防疾??;既能抗已知病毒,也能抗未知病毒(包括烈性病毒,如SARS-CoV、禽流感病毒)。本發(fā)明制備是醫(yī)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(Endo-hterferon Inducer, ΕηΙΙ),直接用于人體內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ENIs。在這種情況下,機(jī)體變成了生產(chǎn)干擾素的復(fù)合工廠,以生產(chǎn)各型干擾素,發(fā)揮抗腫瘤、抗感染和調(diào)理作用。EOT是天然干擾素,所以,用EnII在人體內(nèi)直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的MI能克服EXI的諸多不足,如誘生的IFN種類齊全、體內(nèi)濃度高、沒有異源蛋白質(zhì)的免疫原性(即過敏反應(yīng)和排斥反應(yīng))、沒有依賴性、無需提純、造價低廉、既可用作治療用藥,也可以作為預(yù)防用藥等。也由于IFNs具有相對種屬特異性,所以,內(nèi)源性干擾素抗病毒、抗腫瘤以及調(diào)理功能活性最強(qiáng)。并且,本發(fā)明制備的EnII用于人體完全遵循機(jī)體產(chǎn)生干擾素的防御反應(yīng)機(jī)制,能更有效誘導(dǎo)內(nèi)源性干擾素產(chǎn)生。3.本發(fā)明的臨床效果顯著地優(yōu)于目前所用的最好的商業(yè)化的Poly[I:C]。 Poly[I:C]為人工合成的小片段dsRNA分子,誘生IFN的能力低,伴有許多副作用,且價格昂貴,市場受到極大的限制。本發(fā)明在研究BTV NdsRNA EnII過程中,無論體內(nèi)還是體外,均以Poly[I:C]為對照;無論在理論上,還是在體內(nèi)、外實驗結(jié)果上,BTV NdsRNA EnII均優(yōu)于 Poly[I:C]。4.具有顯著的資源優(yōu)勢。(A)BTV NdsRNA是一種全新的對人安全的天然的可無限再生的綠色生物材料,取之不盡,用之不竭。BTV NdsRNA EnII正是以之為資源而提取制備的天然EnII ; (B)申請人擁有22個(幾乎全部)血清型BTV資源、人癌細(xì)胞和動物癌細(xì)胞資源;形成了全套管理、保管、使用、監(jiān)測.......等技術(shù)系統(tǒng)。5.具有潛在的其他生理學(xué)功能。申請人的前期工作也提示了,BTVNdsRNA不僅具有誘導(dǎo)ENIs產(chǎn)生的生理功能,而且具有誘導(dǎo)白細(xì)胞間介素-2 (IL-2)產(chǎn)生的生理功能。BTV NdsRNA EnII理所當(dāng)然地也能用作BTV NdsRNA ExII06.全新的系統(tǒng)和理論。其作用機(jī)理是利用“裸露的動物病毒基因組 dsRNA(NdsRNA)直接調(diào)控人源細(xì)胞干擾素基因的表達(dá)”。這是一個全新的系統(tǒng),揭示了裸露的病毒基因組dsRNA無須用轉(zhuǎn)基因技術(shù)而直接通過注射的方式應(yīng)用于人體,并安全而有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生各種ENIs,發(fā)揮其藥理和生理作用。7.本發(fā)明所用資源便于離體增殖和純化制備,有利于產(chǎn)業(yè)化,生產(chǎn)成本低,容易獲取。8.由于EnII體內(nèi)誘導(dǎo)ENIs產(chǎn)生的速度快、安全、高效、造價低廉,所以,既能用于臨床疾病的常規(guī)預(yù)防和治療,也可應(yīng)對突發(fā)性公共衛(wèi)生事件。9.本發(fā)明制備的EnII市場很大。申請人的前期工作已經(jīng)展示了理想的EnII的醫(yī)學(xué)價值和市場前景。BTV NdsRNA具有誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的生理功能,具有選擇性抗癌的作用,而病毒病和腫瘤這兩類疾病都是目前對人類健康和生命威脅最大的疾病之一。從近年新的病毒病等(如AIDS、SARS、禽流感、結(jié)核等)的出現(xiàn)和流行來看,新的傳染病的預(yù)防顯得特別重要,在這一點上,更是EnII的用武之地。所以,EnII既在新、老傳染病預(yù)防和治療上有廣闊的市場,又具有應(yīng)對突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的重大價值,比如說,它是抗乙型肝炎的首先藥物,可見一斑。由于ENI較EXI有無可比擬的優(yōu)點,所以,理想的EnII將會占據(jù)IFN相關(guān)生產(chǎn)的95%以上的市場,并會極大地擴(kuò)大現(xiàn)有IFN市場。


圖1. BTV dsRNA基因組聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜和瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖2.實驗動物體內(nèi)比較研究BTV dsRNA與Poly [I C]誘導(dǎo)IFN- α產(chǎn)生的消長曲線圖(有限觀察時間6小時)圖3.實驗動物體內(nèi)比較研究BTV dsRNA與Poly [I: C]誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的消長曲線圖(有限觀察時間6小時)圖4.小鼠體內(nèi)BTV dsRNAs預(yù)防和治療流感病毒Hmi感染性肺炎的組織學(xué)切片 (HE染色)圖4-A.正常組鼠肺組織(HE染色,x400),可見肺泡組織結(jié)構(gòu)正常,間隙清楚,無滲
出ο圖4-B.病毒模型組鼠肺組織(HE染色,x400),可見肺泡間隔不清,肺泡有大量滲出,大量炎性細(xì)胞聚集。圖4-C. Poly[I:C]預(yù)防組鼠肺組織(HE染色,x400),與圖4-B比,病變較輕,可見肺泡組織結(jié)構(gòu),肺泡間隔少量滲出,有炎性細(xì)胞聚集。圖4-D. BTVNdsRNA預(yù)防組鼠肺組織(HE染色,x400),與圖4_B比較,僅少量滲出, 些許炎性細(xì)胞聚集;與圖4-C比較,組織病變明顯較輕,肺泡組織結(jié)構(gòu)清楚,肺間隔滲出少, 伴少許炎性細(xì)胞。圖4-E. Poly [I C]治療組鼠肺組織(HE染色,x400),與圖4_B比較,病變組織有所好轉(zhuǎn),肺組織輪廓可見,但肺間隔仍有大量炎性滲出,伴炎性細(xì)胞浸潤。圖4-F. BTVNdsRNA治療組鼠肺組織(HE染色,x400),與圖4_B比較,肺泡間隙清楚,病變明顯改善;與圖4-E比較,肺組織病變顯著輕微,肺組織輪廓清晰,肺間隔少許滲出ο圖5.流感病毒核酸RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜A為Marker ;B為PCR產(chǎn)物條帶;C為未加模板的陰性對照。圖6. Real-time PCR檢測各實驗組小鼠肺組織流感病毒HmiRNA載量曲線6-A.正常對照組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴(kuò)增曲線;圖6-B.模型對照組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴(kuò)增曲線;圖6_C.Poly[I:C]預(yù)防組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴(kuò)增曲線;圖6-D. BTV dsRNA預(yù)防組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴(kuò)增曲線;圖6_E.Poly[I:C]治療組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴(kuò)增曲線;圖6-F. BTV dsRNA治療組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴(kuò)增曲線。圖7.各實驗組鼠肺組織內(nèi)流感病毒Hmi RNA載量比較圖(PIC即Poly [I :C])圖8.各實驗組小鼠血清IFN- α、IFN- β、IFN- γ等內(nèi)源性干擾素濃度比較(觀察 7 天;PIC 即 Poly[I:C])
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)說明的是,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。我們前期在體外培養(yǎng)細(xì)胞上所作的BTV dsRNAs誘導(dǎo)外源性干擾素的研究中,均以目前最好的已商品化的Poly[I:C]為對照,開展BTV dsRNAs體外誘導(dǎo)干擾素的有效性研究;以人源正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞對照研究了 BTV dsRNAs體外誘導(dǎo)干擾素的有效性和安全性。部分結(jié)果見表1-4。表1.不同濃度BTV分別誘導(dǎo)Hela細(xì)胞和HEL細(xì)胞產(chǎn)生β-IFN含量的直線回歸
權(quán)利要求
1. 一種異源藍(lán)舌病毒雙鏈RNA內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑的制備方法,其步驟如下(1)細(xì)胞培養(yǎng)以非洲綠猴腎細(xì)胞或幼倉鼠腎傳代細(xì)胞為病毒擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞,在37°C、 5% CO2、10%小牛血清、DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng);(2)dsRNABTV增殖待細(xì)胞長至80% -90 %匯合時,棄培養(yǎng)液,用pH 7. 4的IXPBS洗滌貼壁細(xì)胞1-2次,接種BTV病毒株懸液1. Oml于培養(yǎng)瓶,37°C吸附1_2小時后,棄病毒液, 以含2%小牛血清的添加DMEM培養(yǎng)基在37°C,5% CO2條件下維持培養(yǎng),隨后每12小時光鏡下觀察一次,至細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng),即當(dāng)CPE達(dá)90%時收獲病毒;(3)dsRNA BTV的提取和純化收獲培養(yǎng)的dsRNA BTV按中國專利ZL200410012605. 9的 “反向免疫共沉淀技術(shù)”工藝提取和純化dsRNA BTV ;(4)BTV dsRNA 的提取(a)PEG6000濃縮上述提取和純化的BTV;(b)裂解液裂解BTV;(c)磁珠法提取BTVdsRNA ;(d)蔗糖濃縮純化的dsRNA;(e)-20°C保存,備用;(5)病毒基因組dsRNA的鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù), 分析電泳圖譜鑒定;(6)提取dsRNA純度鑒定采用紫外分光光度法結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)判斷所提取dsRNA的純度;(7)雙鏈RNA濃度的測定采用紫外分光光度法測定雙鏈RNA含量;(8)制備成注射劑型,經(jīng)肌內(nèi)注射使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種異源藍(lán)舌病毒雙鏈RNA內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑的制備方法。該誘導(dǎo)劑是從動物藍(lán)舌病毒中提取裸露的dsRNA分子制備而成的,直接用于人體,誘導(dǎo)人體產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素,賦予人體抗病毒、抗腫瘤以及廣泛的防病、治病和增強(qiáng)體質(zhì)的功能。主要優(yōu)點A)直接誘導(dǎo)人體產(chǎn)生種類齊全的ENI、體內(nèi)濃度高、抗病毒和抗腫瘤活性最強(qiáng)、沒有異源蛋白的免疫原性、沒有依賴性、無須提純、造價低廉。B)沒有感染性;系dsRNA病毒,沒有腫瘤源性;為天然病毒,不會影響生態(tài)平衡。C)是一種全新的對人安全的天然的綠色生物材料,用之不竭、可無限再生,便于離體增殖和純化制備。D)高度符合種屬特異性,在人體內(nèi)的藥理作用最強(qiáng)。
文檔編號C12N15/113GK102350001SQ201110325180
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者劉軍, 方蘭, 楊繼紅, 董長垣, 鄧庚糧, 陳冬娥 申請人:武漢大學(xué)
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