專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抗玉米矮花葉病RNAi載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種RNA干擾(RNAi)載體，特別涉及一種抗甘蔗花葉病毒引起的玉米矮花葉病的RNAi載體。
背景技術(shù)：
甘蔗花葉病毒、Sugarcane mosaic virus, SCMV)屬于馬鈴薯Y病毒屬 (/^ij^irm)，在自然界中主要通過(guò)蚜蟲(chóng)和種子傳播，是國(guó)內(nèi)外甘蔗和玉米等禾本科作物上的重要病毒。SCMV的基因組由一條正單鏈RNA分子組成，有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框(0RF)， 可表達(dá)產(chǎn)生一個(gè)多肽，然后經(jīng)翻譯切割成10個(gè)成熟蛋白。SCMV感染所致的玉米矮花葉病 (Maize dwarf m0Saic，MDM)在我國(guó)北方大面積發(fā)生，是玉米生產(chǎn)上面臨的突出問(wèn)題。引起我國(guó)玉米矮花葉病的SCMV大多屬于MDB株系。但近年在山東、河北等地還出現(xiàn)了一個(gè)國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道的新株系，可以侵染我國(guó)大多數(shù)主栽玉米品種。種植抗病品種是防治玉米矮花葉病最有效的措施。但在培育抗病品種時(shí)面臨選育周期長(zhǎng)、抗病基因匱乏及病毒變異導(dǎo)致的抗病性喪失等問(wèn)題。利用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)基因工程手段可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得抗病毒材料。RNA干擾(RNA interference，RNAi ；也稱(chēng)RNA沉默，在植物中也可稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄后基因沉默)是真核生物體內(nèi)發(fā)生的、基于核酸序列同源性的一種基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。雙鏈RNA (double-stranded RNA，dsRNA)是RNAi起始的關(guān)鍵因子。它首先被Dicer酶降解為3‘-端具有2 nt突出的2H6 nt的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)，后者整合入 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC),并指導(dǎo) RISC 對(duì)同源 RNA 進(jìn)行識(shí)別和切割，最終導(dǎo)致RISC降解靶標(biāo)mRNA。dsRNA形成的有效途徑之一是將體外構(gòu)建的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)(inverted repeats, 頂)轉(zhuǎn)入植株。轉(zhuǎn)入植物的反向重復(fù)載體在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成dsRNA后，啟動(dòng)RNAi，有效控制與轉(zhuǎn)基因有同源性的入侵病毒。反向重復(fù)結(jié)構(gòu)由一段間隔序列(spacer)連接兩段反向互補(bǔ)序列構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄后會(huì)形成發(fā)夾狀RNA (hairpin RNA, hpRNA)。hpRNA由莖(stem，是反向互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)錄的RNA配對(duì)形成的雙鏈)和環(huán)(loop，是由spacer轉(zhuǎn)錄的RNA單鏈結(jié)構(gòu))組成。hpRNA中的莖是誘發(fā)序列特異性基因沉默的關(guān)鍵部份，莖的長(zhǎng)短影響RNA沉默的效率和穩(wěn)定性，植物中50-1000 bp的dsRNA同源片段均能高效誘發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，沉默效率接近100%。轉(zhuǎn)化頂獲得的抗病植株比例和抗病程度高于轉(zhuǎn)正義或反義基因。RNAi的效率還取決于頂?shù)那o與入侵病毒核酸一致率的高低。轉(zhuǎn)基因與入侵病毒基因組核苷酸一致率越高，則抗病效果越好。植物RNA病毒在自然界中是以準(zhǔn)種形式存在， 同一種病毒的基因組可能有一定程度的變異。在構(gòu)建RNAi載體時(shí)，需要針對(duì)不同病毒找到最保守的基因，篩選最有效的片斷作為靶標(biāo)。因此如何應(yīng)用RNA干擾技術(shù)來(lái)獲得抗玉米矮花葉病的植株，就成為了現(xiàn)在亟待解決的問(wèn)題之一。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述的原因，發(fā)明人利用在鑒定引起我國(guó)玉米矮花葉病的病毒種類(lèi)和分析其基因組群體變異以及已知SCMV的全基因序列的基礎(chǔ)上，篩選出了 SCMV最保守的基因，并在其中找到了誘導(dǎo)RNA干擾最有效的3個(gè)片段(CI、OTb和CP)。本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了新的抗玉米矮花葉病RNAi載體(p3301-SCMVCINIblCPRi)。利用該載體可以培育出對(duì)我國(guó)玉米矮花葉病具有廣譜、高效、持久抗性的轉(zhuǎn)基因植株；通過(guò)RNAi獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗病程度高，特異性強(qiáng)。轉(zhuǎn)入植物的反向重復(fù)不需要完整病毒基因，避免了翻譯成蛋白質(zhì)可能帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，而且產(chǎn)生的RNA干擾高效持久并能在后代穩(wěn)定遺傳，對(duì)于采用RNA干擾技術(shù)來(lái)獲得抗病毒植株的研究，提供了良好的參考借鑒作用。本發(fā)明所提供的RNAi載體，發(fā)明人將其命名為p3301-SCMVCINIblCPRi，其序列如kq ID No:l所示。其中發(fā)明人篩選出了 SCMV最保守的基因，發(fā)現(xiàn)了誘導(dǎo)RNA干擾最有效的3個(gè)片段Cl、NIb 和 CP，其序列分別如 kq ID No:2, Seq IDID No:4 所示，其中 CI 位于SCMV全序列中的4878-5430 bp, NIb位于全序列的7652-7892 bp, CP位于全序列的 9008-9303 bp，具體如下表
權(quán)利要求
1.一種抗玉米矮花葉病RNAi載體，其基因序列如kq ID No: 1所示。
2.—種將權(quán)利要求1所述RNAi載體p3301-SCMVCINIblCPRi轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中獲得的大腸桿菌，其保藏編號(hào)為CGMCC NO 43560
3.如權(quán)利要求1所述的抗玉米矮花葉病RNAi載體，在轉(zhuǎn)化玉米或水稻或小麥或其他禾本科作物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，發(fā)明人在鑒定引起我國(guó)玉米矮花葉病的病毒種類(lèi)和分析其基因組群體變異的基礎(chǔ)上，篩選出了SCMV最保守的基因，找到了誘導(dǎo)RNA干擾最有效的3個(gè)片段(CI、NIb和CP)。本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了新的抗玉米矮花葉病RNAi載體(p3301-SCMVCINIb1CPRi)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)其進(jìn)行生物保藏，其保藏編號(hào)為CGMCCNO4356。利用該載體可以培育出對(duì)我國(guó)玉米矮花葉病具有廣譜、高效、持久抗性的轉(zhuǎn)基因植株；通過(guò)RNAi獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗病程度高，特異性強(qiáng)。而且轉(zhuǎn)入植物的反向重復(fù)不需要完整病毒基因，避免了翻譯成蛋白質(zhì)可能帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102363787SQ20111032611
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者張春慶, 李向東, 賈金磊 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)