專利名稱：一種動(dòng)物飼料抗菌肽的生產(chǎn)工藝及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物飼料添加劑，尤其涉及一種動(dòng)物飼料抗菌肽的生產(chǎn)工藝及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2005年7月，四川省資陽(yáng)、內(nèi)江等地爆發(fā)豬鏈球菌病疫情致人死亡，這再次迫使人們追問(wèn):動(dòng)物濫用抗生素的威脅鏈到底有多長(zhǎng)？由于抗生素飼料添加劑可以提高動(dòng)物生產(chǎn)效率，在食用動(dòng)物飼養(yǎng)中被廣泛使用。1996年，全世界抗生素飼料添加劑的用量已經(jīng)占全部飼料添加劑用量的45.8%，抗生素生產(chǎn)總產(chǎn)量的50%左右用于畜牧業(yè)。但是，由于持續(xù)低水平飼喂抗生素，抗生素飼料添加劑造成的細(xì)菌耐藥性、畜產(chǎn)品藥物殘留、過(guò)敏中毒反應(yīng)以及“三致”作用等危害日益嚴(yán)重，越來(lái)越受到人們的關(guān)注和許多國(guó)家的限制。1986年，瑞典成為第一個(gè)不準(zhǔn)使用抗生素作為飼料添加劑的國(guó)家，全面禁止在畜禽飼料中使用抗生素。1997年 ，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)要求停止或禁止使用抗生素飼料添加劑。1998年12月又提議在10年內(nèi)淘汰抗生素飼料添加劑。從2000年I月起，丹麥的抗生素只限于按處方用于治療動(dòng)物疾病。歐盟委員會(huì)決定從2006年I月I日起，在歐盟成員國(guó)全面停止使用所有抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑，包括離子載體類(lèi)抗生素。2004年，世界衛(wèi)生組織(WHO)、FA0和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)聯(lián)合召開(kāi)了一次專題討論會(huì)，討論了非人用抗生素的使用和抗生素的耐藥性問(wèn)題。討論會(huì)的報(bào)告建議，在食用動(dòng)物生產(chǎn)中停止使用也用于治療人類(lèi)疾病的抗生素飼料添加劑，直到進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后認(rèn)為對(duì)人類(lèi)健康沒(méi)有影響后才可以使用。報(bào)告還建議，進(jìn)行國(guó)家水平的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究，建立監(jiān)測(cè)制度，對(duì)抗生素飼料添加劑使用和食用動(dòng)物細(xì)菌的耐藥性情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。同時(shí)，世界各國(guó)對(duì)進(jìn)口動(dòng)物性食品抗生素殘留要求也越來(lái)越嚴(yán)格。2002年8月瑞士對(duì)我國(guó)輸入的禽肉產(chǎn)品繼諾沙星、氯霉素后又開(kāi)始檢測(cè)硝基呋喃，且檢測(cè)限量標(biāo)準(zhǔn)由原來(lái)的5ppb提高到lppb。到2003年，歐盟共發(fā)布了 37個(gè)有關(guān)食品中農(nóng)獸藥最高殘留限量(MRL)的指令，制定出了 194種農(nóng)獸藥在肉、蛋、乳等190種食品中共28689項(xiàng)MRL標(biāo)準(zhǔn)，其中有3/4以上的MRL標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定在檢測(cè)線上。俄羅斯對(duì)進(jìn)口凍肉類(lèi)檢測(cè)獸藥殘留的數(shù)量原來(lái)僅為10種，現(xiàn)在增加到59種，其中有35種不得檢出。最近，日本通過(guò)了《食品衛(wèi)生法》及其修正案，推行“可用農(nóng)藥清單制度”和“一律基準(zhǔn)制度”，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品使用的農(nóng)獸藥列出詳細(xì)清單，農(nóng)產(chǎn)品被檢出農(nóng)獸藥殘留超標(biāo)或檢出清單中未設(shè)定限量的農(nóng)獸藥殘留將不允許進(jìn)口，并將現(xiàn)有的130種農(nóng)產(chǎn)品、229種農(nóng)獸藥、9000個(gè)殘留標(biāo)準(zhǔn)增加到135種農(nóng)產(chǎn)品、724種農(nóng)獸藥、19000個(gè)殘留標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)日本厚生勞動(dòng)省宣布對(duì)我國(guó)出口雞肉產(chǎn)品實(shí)施批批檢驗(yàn)。2002年初，歐盟從中國(guó)進(jìn)口的蝦、對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)力抗生素的藥物殘留，認(rèn)為對(duì)人體健康構(gòu)成潛在威脅，導(dǎo)致歐洲部分地區(qū)陷入食品恐慌。受到進(jìn)口限制影響的中國(guó)動(dòng)物產(chǎn)品包括:兔肉、禽肉、蜂蜜、軟體動(dòng)物肉類(lèi)、甲殼類(lèi)、凍蝦、對(duì)蝦和寵物產(chǎn)品等。2006年3月22日至31日，歐盟殘留監(jiān)控團(tuán)對(duì)我國(guó)海南等10個(gè)省市的動(dòng)物源性食品殘留監(jiān)控工作進(jìn)行考察，其考察結(jié)果直接影響我國(guó)禽畜產(chǎn)品在海外的聲譽(yù)及市場(chǎng)份額。
從現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)看，在食用動(dòng)物中禁用、限用抗生素飼料添加劑已經(jīng)成為世界共識(shí)，是大勢(shì)所趨。從利弊分析和發(fā)達(dá)國(guó)家的做法看，抗生素飼料添加劑的發(fā)展呈現(xiàn)三個(gè)趨勢(shì)，一是使用將日益受到限制，二是積極選擇替代品，三是對(duì)進(jìn)口動(dòng)物性食品抗生素殘留檢驗(yàn)越來(lái)越嚴(yán)格。但禁用抗生素飼料添加劑會(huì)導(dǎo)致飼養(yǎng)成本的增加，主要原因:一是由于動(dòng)物發(fā)病率提高加大治療費(fèi)用，二是由于飼養(yǎng)管理更加嚴(yán)格會(huì)增加管理費(fèi)用。據(jù)美國(guó)學(xué)者2002年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，使用抗生素作為飼料添加劑，動(dòng)物可以平均增重4% 5%;如果停止使用抗生素飼料添加劑，肉雞的生產(chǎn)過(guò)程每年將多花30億美元。因此，為確保養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，在動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中推行更為安全、有效的替代添加劑刻不容緩。多年來(lái)在畜禽或水產(chǎn)養(yǎng)殖中，之所以對(duì)抗生素產(chǎn)生依賴，是人們希望用抗生素來(lái)發(fā)揮防病保健和提高動(dòng)物的生產(chǎn)效率。但是在過(guò)去的50多年中，人類(lèi)的防病觀念和防病策略存在著嚴(yán)重的片面性或錯(cuò)誤，即一味地強(qiáng)調(diào)“抑制或殺滅有害微生物”，卻忽視了由動(dòng)物的正常菌群、免疫與營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成的“微生態(tài)三角”的防病保健、營(yíng)養(yǎng)等重要作用。因此調(diào)節(jié)腸道中細(xì)菌活性的措施是有效的，可用來(lái)策略性地改善動(dòng)物生產(chǎn)性能和維持現(xiàn)代家畜生產(chǎn)體系中的生產(chǎn)效率。目前，飼料抗生素的替代方式主要有兩種，其一為飼喂微生物添加劑即益生素(菌)來(lái)改善腸道微生物的比例，抑制有害微生物，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)；其二為使用飼用酸化劑，改善腸道內(nèi)容物的酸堿度，抑制有害菌，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)。但總體而言，以上兩種措施相對(duì)于抗生素的作用仍然有一定的差距。

各種動(dòng)物在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化過(guò)程中在體內(nèi)已建立了平衡的微生物菌群共生生態(tài)系統(tǒng)，并建立了一套維持其體內(nèi)菌群穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，抗菌肽是這一機(jī)制中的主要因子之一在維持腸道正常菌群平衡中起著非常重要的作用，并可能與腸道粘膜免疫有一定的關(guān)系。與抗生素相比，抗菌肽的抑菌活性更高、抑菌范圍更廣，對(duì)于動(dòng)物的生產(chǎn)性能也具有明顯的促進(jìn)作用；更為重要的是，抗菌肽不會(huì)產(chǎn)生任何的耐藥性；因此，研制和開(kāi)發(fā)出合適的抗菌肽，將是飼料抗生素的最佳替代品?？咕挠址Q防御素(defensin)，是人體內(nèi)主要的防御素，包括α抗菌肽和β抗菌肽兩種。其中β抗菌肽主要來(lái)源于皮膚、呼吸道等上皮組織，目前已發(fā)現(xiàn)4種人體β抗菌肽。抗菌肽也是廣泛存在于動(dòng)、植物體內(nèi)的內(nèi)源性抗微生物多肽。富含精氨酸，具有穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)和眾多的生物活性，是生物體天然免疫的重要組成成分。根據(jù)抗菌肽氨基酸數(shù)量、半胱氨酸位置以及分子內(nèi)二硫鍵連接方式不同可分為植物抗菌肽、昆蟲(chóng)抗菌肽、α-抗菌肽、β -抗菌肽和Θ -抗菌肽自從1972年瑞典科學(xué)家Boman等首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)抗菌肽及其免疫功能以來(lái),迄今為止，已在各種生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)300多種內(nèi)源性抗菌肽。這些多肽可大致分為四類(lèi):殺菌肽類(lèi)、富含pro殘基的娃皮素、富含gly殘基的蜂毒素和富含cys殘基的抗菌肽。Harwing S1994年首次發(fā)現(xiàn)雞抗菌肽的存在抗菌肽具有廣譜的抗細(xì)菌活性、高效的抗真菌、病毒和原蟲(chóng)的活性，并且不易產(chǎn)生抗藥性；高等動(dòng)物抗菌肽更是具有“種”的特異性，不同動(dòng)物的腸道內(nèi)源性抗菌肽能抑制其相應(yīng)的外源性病原菌，而對(duì)動(dòng)物腸道中共生生態(tài)系統(tǒng)中的微生物和動(dòng)物細(xì)胞無(wú)殺傷作用。應(yīng)用各種專一性抗菌肽作為的飼料添加劑，可使動(dòng)物在收到各種外源性的病原菌入侵或應(yīng)激時(shí)能夠保持特異性的生長(zhǎng)。(溫劉發(fā)等，2001)。許多研究者已試圖將抗菌肽應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，用以取代抗生素。溫劉發(fā)等(2001)通過(guò)在斷奶仔豬的飼料中用抗菌肽代替抗生素，對(duì)仔豬的腹瀉、生產(chǎn)性能等作了比較。結(jié)果表明，抗菌肽在仔豬斷奶應(yīng)激期間抗腹瀉效果不比抗生素差，適量的抗菌肽比抗生素促生長(zhǎng)的效果要好，但高劑量的抗菌肽則降低了仔豬的生長(zhǎng)。黃永彤等(2004)發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對(duì)肉雞有促進(jìn)生長(zhǎng)和提高免疫力作用，與中草藥抗生素相比，在出欄率、平均體重、飼料效率等方面均無(wú)顯著性差異，且在出欄前3d停喂，抽檢無(wú)殘留。溫劉發(fā)等(2001)通過(guò)飲水方式給粵黃雞添加抗菌肽的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽可促進(jìn)小雞生長(zhǎng)和減少排泄物氮含量。陳曉生等(2005)于肉鴨日糧中添加液體的蠶抗菌肽AD-酵母制劑發(fā)現(xiàn)，血清代謝激素的活動(dòng)顯著增強(qiáng)，IGF-1濃度升高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成加強(qiáng)；甲狀腺素T3升高，脂肪、T4降低；尿素氮濃度顯著降低，體內(nèi)氮排出減少。陳曉生等(2005)發(fā)現(xiàn)抗菌肽能使肉鴨的產(chǎn)肉率提高，腹脂率、內(nèi)臟器官比重降低，在適當(dāng)劑量時(shí)，使用效果與金霉素基本一致。陳曉生等(2005)發(fā)現(xiàn)，添加抗菌肽制劑2ml/kg能有效提高肉鴨生產(chǎn)性能，尤其是小鴨階段(I 2周齡)效果顯著；2、3ml/kg添加量均可顯著提高產(chǎn)肉率。從尿素氮和總蛋白濃度結(jié)果看，添加抗菌肽會(huì)使機(jī)體在蛋白質(zhì)合成量變化不大的情況下減少機(jī)體蛋白質(zhì)的分解代謝，從而促進(jìn)生長(zhǎng)。王廣軍等(2005)研究了抗菌蛋白在南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果。結(jié)果表明，在飼料中添加抗菌蛋白，無(wú)論是在日生長(zhǎng)速度、相對(duì)增重率、飼料系數(shù)、成活率，還是抗病力方面均有顯著提高。也有研究者對(duì)抗菌肽和抗生素的抗菌作用進(jìn)行了比較，均顯示了良好的結(jié)果。馬衛(wèi)明等(2005)檢測(cè)了豬小腸抗菌肽對(duì)雞大腸桿菌(01)C83845株、雞白痢沙門(mén)氏菌C79-13株、大腸桿菌(02)、大腸桿菌(078)、豬致病性大腸桿菌自然分離株、雞致病性大腸桿菌自然分離株、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌ATCC25923株、豬致病性沙門(mén)氏菌自然分離株、綠膿桿菌ATCC27853株、魚(yú)致病性嗜水氣單胞菌等11株細(xì)菌的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬小腸抗菌肽對(duì)以上各株細(xì)菌均有不同程度的抑制作用，殺菌率59.5% 98.5%不等。汪以真等(2004)將抗菌肽與抗生素在體外抗大腸桿菌(E.coli)K88、大腸桿菌ATCC25922、豬霍亂沙門(mén)氏菌ATCC50020、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌ATCC25923的效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，抗生素抗金黃 色葡萄球菌的效果要好于抗菌肽，但對(duì)大腸桿菌的效果要差得多。以上研究均實(shí)證了抗菌肽具有很強(qiáng)的抗菌及提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的作用，具有良好的替代飼料中抗生素的潛力。但是，目前國(guó)內(nèi)外研究還限于實(shí)驗(yàn)室階段，很少能應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)際中去。除了研究局限于抗菌肽的提取，數(shù)量太少成本太高外，飼料制粒的高溫高壓高濕也限制了生物蛋白的使用。Gallinacin是抗菌肽家族一員，簡(jiǎn)稱GAL ,廣泛存在于生物界,在所有抗菌肽類(lèi)物質(zhì)中其抗菌譜最廣。Gallinacin —般由29個(gè) 54個(gè)氨基酸殘基組成，包括6個(gè) 8個(gè)保守的半胱氨酸，并通過(guò)半胱氨酸分子間二硫鍵使肽環(huán)形成反向平行的β_片狀結(jié)構(gòu)，有的Gallinacin (如昆蟲(chóng)和植物抗菌肽)還含有一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)。其除具有一般抗菌肽的抗微生物、抗病毒活性和細(xì)胞毒活性外，還具有免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)，以及對(duì)炎癥、創(chuàng)傷及神經(jīng)損傷的修復(fù)等作用(Nozdrachev A D等)。根據(jù)分子內(nèi)半胱氨酸的位置和連接方式、前體性質(zhì)及表達(dá)位置的差異抗菌肽可分為α-抗菌肽、β-抗菌肽、Θ-抗菌肽、昆蟲(chóng)抗菌肽和植物抗菌肽5種類(lèi)型。
在禽類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽均為β_抗菌肽。在鴕鳥(niǎo)的異嗜性白細(xì)胞中分別純化得到β -抗菌肽Osp-1 4 (Sugiarto H等)。企鵝的β -抗菌肽Sphe-1和Sphe_2存在于企鵝的胃內(nèi)，其濃度在食物儲(chǔ)存期比消化期明顯增高。所以企鵝在食物缺乏期其胃內(nèi)容物可保存至少兩周不變質(zhì)。這表明Sphe-1和Sphe-2在企鵝胃內(nèi)容物中起到抗微生物作用。雞的β-Gallinacin幾乎是無(wú)處不在的，它廣泛分布于肝臟、氣管、肺臟、腎臟、睪丸、卵巢、血管、輸卵管、子宮、腦、胸腺、法氏囊、肌肉、皮膚、骨髓、心臟等器官的組織細(xì)胞中。Gal UGal 2在骨髓和肺臟里表達(dá)，Gal 3最先在骨髓、舌、氣管和法氏囊中表達(dá)，Gal 4 7也能在骨髓中表達(dá)，Gal 5可以在舌、氣管、肺臟、腦中很少量地表達(dá)。與此相反，Gal8 13不能在骨髓中表達(dá)，但可以在肝臟、腎臟、睪丸、卵巢及雄性和雌性的生殖系統(tǒng)表達(dá)。也就是說(shuō)，雞的β -抗菌肽基因可以分為兩類(lèi)，即能夠在骨髓和呼吸系統(tǒng)高效表達(dá)的Gal I 7和能在肝臟和泌尿生殖系統(tǒng)表達(dá)的Gal 8 13。禽GAL-1，GAL-2，GAL-3，GAL-6，GAL-8，GAL-9蛋白作為一種內(nèi)源性抗菌肽，具有廣譜抗菌功能。具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌能力，對(duì)真菌、病毒及癌細(xì)胞也有一定的抑殺作用。其熱穩(wěn)定性好、水溶性好、抗菌機(jī)制獨(dú)特、對(duì)動(dòng)物正常細(xì)胞無(wú)害，具有成為優(yōu)良飼料添加劑的潛質(zhì)。應(yīng)用無(wú)毒無(wú)公害的新型抗菌肽代替抗生素作飼料添加劑，已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外飼料學(xué)科的一項(xiàng)研究重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了提供一種工藝簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的動(dòng)物飼料抗菌肽的生產(chǎn)工藝及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種動(dòng)物飼料抗菌肽的生產(chǎn)工藝，是利用基因重組技術(shù)，將動(dòng)物源性的GAL-6基因克隆到質(zhì)粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6為模板，用PCR方法獲得GAL-6基因，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-GAL-6并轉(zhuǎn)化畢赤酵母；經(jīng)多級(jí)放大培養(yǎng)至中試生產(chǎn)后，全面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，放大到生產(chǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)提取純化得到高純度、高活性成品GAL-6蛋白制劑。上述動(dòng)物飼料抗菌肽的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟:I).畢赤酵母pPIC9K-GAL-6表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:將動(dòng)物源性的GAL-6基因克隆到質(zhì)粒pGEM_3Zf，并以pGEM_3Zf-GAL_6為模板，用上、下游引物擴(kuò)增GAL-6基因；反應(yīng)條件是:94°C變性3分鐘；然后94°C變性40s，40°C退火40s, 72°C延伸60s，進(jìn)行5 30個(gè)循環(huán)；然后94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸60s，進(jìn)行20 40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保溫；PCR產(chǎn)物通過(guò)EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)與質(zhì)粒PPIC9K連接重組，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；挑陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒后進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切鑒定，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到基因DNA片段長(zhǎng)502bp，電泳分析結(jié)果顯示在400bp 600bp處有特異性條帶，與預(yù)測(cè)片段長(zhǎng)度一致，重組質(zhì)粒酶切鑒定片段長(zhǎng)度與理論預(yù)測(cè)一致，核苷酸序列分析結(jié)果完全正確，并測(cè)定DNA序列；重組質(zhì)粒命名為PPIC9K-GAL-6 ；2).電轉(zhuǎn)化畢赤酵母及篩選多拷貝陽(yáng)性克隆:參照Invitrogen 公司 Mult1-Copy Pichia Expression Kit 說(shuō)明書(shū)操作；用 Sal I酶切重組質(zhì)粒PPIC9K-GAL-6，使其完全線性化，經(jīng)酚/氯仿抽提、乙醇沉淀純化后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS ；電擊參數(shù)為:電壓1500V，電容25 μ F，電阻200 Ω ;涂布MD平板，30°C靜置培養(yǎng)48h ;挑單克隆菌落接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，經(jīng)同步化后分別接種至含O、1.0,2.0、4.0g/LG418的YPD平板上，30°C靜置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單克隆菌落；3).PCR 法鑒定:在高濃度G418-YPD平板上挑單克隆至20 μ L0.25% SDS溶液中，混勻后90°C加熱3min，離心后取I μ L上清作模板,用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)體系50 μ L，含 1% Triton X-100 ;反應(yīng)條件:95°C變性 5min ;95°C 變性 60s，55 °C 退火 60s，72 °C 延伸60s，進(jìn)行20 50個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸3min，4°C保溫；根據(jù)PCR結(jié)果酶切后電泳鑒定重組質(zhì)粒；4).實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng):在高濃度G418-YPD平板上挑單克隆于YPD培養(yǎng)液中，30°C，250r/min振蕩培養(yǎng)12h，得到一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液接種至1200mL BMGY培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)16h，至0D600=10 12，得到二級(jí)種子液；將二級(jí)種子液接種至20L BMMY培養(yǎng)液中，用28%氨水調(diào)節(jié)pH至5.0 ;發(fā)酵培養(yǎng)條件為:溫度30°C，攪拌速度200r/min，溶氧度35%，自動(dòng)補(bǔ)加氨水維持PH5.1 ;繼續(xù)培養(yǎng)18h至0D600 = 100 120，待溶氧度快速上升，培養(yǎng)液中甘油耗盡時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加50%甘油溶液，速度80m L/h，時(shí)間2 3h，至0D600 = 150 160時(shí)停止補(bǔ)加甘油，待其完全耗盡時(shí)立即開(kāi)始補(bǔ)加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，速度30mL/h，時(shí)間30h ;誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，發(fā)酵液放入冷卻罐，按放罐發(fā)酵液質(zhì)量3 %的量加入固體NaCl，攪拌至鹽溶解，待溫度降到IO0C以下，14000r/min離心收集菌體，按照菌體6倍質(zhì)量加入10°C以下蒸懼水,70r/min攪拌lOmin，完成細(xì)胞破碎，14000r/min離心收集上清液；5).重組GAL-6的純化和鑒定:將步驟4)中收集的上清液超濾濃縮5 15倍,進(jìn)行Sephadex G50凝膠過(guò)濾層析，上樣結(jié)束后用平衡液平衡至基線，平衡液用20mmol/L Na2HPO4, pH = 7.0，流速5mL/min ；然后用洗脫液線性梯度洗脫，洗脫液為20mmol/L Na2HPO4和lmol/LNaCl，pH = 7.0 ;對(duì)應(yīng)NaCl梯度0.1 0.2mol/L ;收集目的蛋白洗脫峰組份，然后進(jìn)行陰離子交換層析，層析柱QSepharose FF預(yù)先用20倍柱體積平衡液預(yù)平衡,平衡液為20mmol/L Na2HPO4, pH = 7.0,流速5mLPmin ;上樣結(jié)束后用平衡液沖洗至基線，再洗脫液線性梯度洗脫，洗脫液為20mmol/L Na2HPO4 和 lmol/LNaCl, pH = 7.0，對(duì)應(yīng) NaCl 梯度 0.1 0.2mol/L ;收集洗脫峰組份，用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，做15% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，掃描分析純度，純度應(yīng)大于95% JAWestern Blot進(jìn)一步驗(yàn)證純化的目的蛋白；6).生產(chǎn)化大規(guī)模培養(yǎng)工藝:將步驟4)中獲得的一級(jí)種子液接種至50L種子罐，BMGY培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速250r/min培養(yǎng)16h，至0D600 = 10 12，移種至1000L反應(yīng)器中進(jìn)行生產(chǎn)化大規(guī)模培養(yǎng)；采用BMMY發(fā)酵培養(yǎng)液，用28%氨水調(diào)節(jié)pH至5.0 ;發(fā)酵培養(yǎng)條件為:溫度30°C，攪拌速度600r/min，溶氧度35%，自動(dòng)補(bǔ)加氨水維持pH = 5.1 ;繼續(xù)培養(yǎng)18h至0D600 = 100 120，待溶氧度快速上升，培養(yǎng)液中甘油耗盡時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加50%甘油溶液，速度80mL/h，時(shí)間2 3h，進(jìn)行高密度培養(yǎng)，至0D600 = 150 160時(shí)停止補(bǔ)加甘油，待其完全耗盡時(shí)立即開(kāi)始補(bǔ)加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，速度30mL/h，時(shí)間30h，發(fā)酵液放入冷卻罐，依放罐發(fā)酵液質(zhì)量3%的量加入固體NaCl，攪拌至鹽溶解,待溫度降到10°C以下，14000r/min離心收集菌體，按照菌體6倍質(zhì)量加入IO0C以下蒸餾水，70r/min攪拌lOmin，完成細(xì)胞破碎，14000r/min離心收集上清液，純化后即得到GAL-6蛋白制劑產(chǎn)品。步驟3)中所述的上游引物的序列為5' AGGGAGACAGAAGGCAGCGGTGAT3' (5' AoxI Primer);下游引物的序列為 5' TCCCAGGAGAAGCCAGTGAGTCAT3' (3' AoxI Primer)。上述動(dòng)物飼料抗菌肽的應(yīng)用，是在給動(dòng)物飲水時(shí)，按每升水加5-10毫克抗菌肽GAL-6的量將抗菌肽GAL-6混合在動(dòng)物飲水中，讓動(dòng)物飲用，以提高動(dòng)物免疫力，取代動(dòng)物飼料抗生素，減少動(dòng)物疾病。上述動(dòng)物飼料抗菌肽的應(yīng)用，是在給動(dòng)物飼喂顆粒飼料時(shí)，按每公斤飼料添加5-10毫克抗菌肽GAL-6的量，采用制粒過(guò)程的后噴方法將抗菌肽溶于適量水中噴曬在制粒冷卻后的動(dòng)物飼料表面，飼喂動(dòng)物，以提高動(dòng)物免疫力，取代或減少動(dòng)物飼料抗生素，減少動(dòng)物疾病。上述動(dòng)物飼料抗菌肽的應(yīng)用，是在給動(dòng)物飼喂粉狀飼料時(shí)，按每公斤飼料添加5-10毫克抗菌肽GAL-6的量，將其直接混合在動(dòng)物飼料里，飼喂動(dòng)物，以提高動(dòng)物免疫力，取代或減少動(dòng)物飼料抗生素，減少動(dòng)物疾病。Gal-6蛋白是一種在雞的食道、嗉囊中高度表達(dá)，在腺胃中適度表達(dá)中的β -抗菌
月太-能夠有效抑制空腸彎桿菌(Campylobacter jejuni)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌等
多種主要食物源性病原體；抗真菌的效果也很顯著，殺菌曲線顯示Gal-6在6分鐘內(nèi)能夠降低C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)的存活率(A.van Dijk等)。對(duì)該蛋白的研究首次證明了 β -抗菌肽能夠在食道中高表達(dá)，并有抵抗食物源性病原體的強(qiáng)力抑菌活性。在現(xiàn)代畜禽飼養(yǎng)業(yè)日益呈集約化的今天，病原傳播和入侵及各種應(yīng)激作用日益強(qiáng)化，使得畜禽腸道表達(dá)量有限的抗菌肽難以對(duì)動(dòng)物自身的保健起很大作用。尋找各種飼養(yǎng)動(dòng)物內(nèi)源性抗菌肽，并以現(xiàn)代生物技術(shù)方法工業(yè)化生產(chǎn)這些在抗病原菌上具有動(dòng)物“種”專一性或特異性的產(chǎn)品 ，將是“后抗生素時(shí)代”的一條出路。而大規(guī)模生產(chǎn)Gal-蛋白無(wú)疑則是目前所知的替代抗生素最佳方案，其對(duì)于整個(gè)飼料行業(yè)乃至人類(lèi)的身體健康和安全意義深遠(yuǎn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn):1.首次在畢赤酵母中進(jìn)行GAL-6基因的高效表達(dá)，經(jīng)純化后的目的蛋白產(chǎn)量高于釀酒酵母幾十倍。2.首創(chuàng)全面優(yōu)化的動(dòng)物飼料抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)和純化工藝。3.擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的飼料表面噴涂技術(shù)，使得該產(chǎn)品能通過(guò)顆粒飼料的高溫、高壓高濕制粒過(guò)程而不遭破壞。4.本發(fā)明將提供一種高效抗生素替代物-動(dòng)物飼料抗菌肽的生產(chǎn)工藝和使用方法。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；圖2 為 pPIC9K-GAL-6 的 DNA 序列；圖3為Gal-6基因的RT-PCR結(jié)果；圖4為Gal-6基因的2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果；圖5為PCR篩選陽(yáng)性菌株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例本發(fā)明的工藝流程圖如圖1所示，具體生產(chǎn)工藝的技術(shù)路線如下:I).畢赤酵母pPIC9K-GAL-6表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:將從雞組織細(xì)胞或購(gòu)買(mǎi)獲得的動(dòng)物源性的GAL-6基因克隆到質(zhì)粒pGEM-3Zf，并以克隆質(zhì)粒pGEM_3Zf-GAL_6為模板，用上、下游引物擴(kuò)增GAL-6基因。反應(yīng)條件是94°C變性3分鐘；然后94°C變性40s，40°C退火40s，72°C延伸60s，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；然后94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸60s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保溫。PCR產(chǎn)物通過(guò)EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)與質(zhì)粒pPIC9K連接重組，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。挑陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒后進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切鑒定，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到基因DNA片段長(zhǎng)502bp，電泳分析結(jié)果顯示在400bp 600bp處有特異性條帶，與預(yù)測(cè)片段長(zhǎng)度一致，重組質(zhì)粒酶切鑒定片段長(zhǎng)度與理論預(yù)測(cè)一致核苷酸序列分析結(jié)果完全正確，并測(cè)定DNA序列。重組 質(zhì)粒命名為pPIC9K-GAL-6。Forward Primer Tm:60Bases:5/ AGGGAGACAGAAGGCAGCGGTGAT 3'Reverse Primer Tm:57Bases:5; TCCCAGGAGAAGCCAGTGAGTCAT 3'2).電轉(zhuǎn)化畢赤酵母及篩選多拷貝陽(yáng)性克隆:參照Invitrogen公司Mult1-CopyPichia Expression Kit說(shuō)明書(shū)操作。用Sal I酶切重組質(zhì)粒pPIC9K_GAL_6，使其完全線性化，經(jīng)酚/氯仿抽提、乙醇沉淀純化后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS，電擊參數(shù):電壓1500V，電容25 μ F，電阻200 Ω，涂布MD平板，30°C靜置培養(yǎng)48h。挑單克隆菌落接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，經(jīng)同步化后分別接種至含O、1.0,2.0,4.0g/LG418的YPD平板上，30°C靜置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單克隆菌落。3).PCR法鑒定:在高濃度G418-YPD平板上挑單克隆(約107個(gè)細(xì)胞)至20 μ L0.25% SDS溶液中，混勻后90°C加熱3min，離心后取I μ L上清作模板，用上、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系50 μ L，含1% Triton X-100。反應(yīng)條件:95°C變性5min ;95°C變性60s，55°C退火60s，72°C延伸60s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸3min，4°C保溫。根據(jù)PCR結(jié)果酶切后電泳鑒定重組質(zhì)粒。上游引物:5'AGGGAGACAGAAGGCAGCGGTGAT 3' (5' AoxI Primer)下游引物:5'TCCCAGGAGAAGCCAGTGAGTCAT 3' (3' AoxI Primer)4).實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng):在高濃度G418-YPD平板上挑單克隆于YH)培養(yǎng)液中，30°C，250r/min振蕩培養(yǎng)12h，此為一級(jí)種子液。將一級(jí)種子液接種至1200mLBMGY培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)16h，至0D600 = 10 12，此為二級(jí)種子液。將二級(jí)種子液接種至20LBMMY培養(yǎng)液中，用28%氨水調(diào)節(jié)pH至5.0。設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)條件:溫度30°C，攪拌速度600r/min，溶氧度35%，自動(dòng)補(bǔ)加氨水維持PH5.1。繼續(xù)培養(yǎng)18h至0D600 = 100 120，待溶氧度快速上升，培養(yǎng)液中甘油耗盡時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加50%甘油溶液，速度80mL/h，時(shí)間2 3h，至0D600 = 150 160時(shí)停止補(bǔ)加甘油，待其完全耗盡時(shí)立即開(kāi)始補(bǔ)加甲醇，速度30mL/h，時(shí)間30h。發(fā)酵液放入冷卻罐，依放罐發(fā)酵液質(zhì)量3%的量加入固體NaCl，攪拌至鹽溶解，待溫度降到10°C以下，14000r/min離心收集菌體，按照菌體6倍質(zhì)量加入1(TC以下蒸懼水,70r/min攪拌IOmin,完成細(xì)胞破碎，14000r/min離心收集上清液；待純化。
5).重組GAL-6的純化和鑒定:將4)中細(xì)胞破碎后離心所收集上清液超濾濃縮10倍，進(jìn)行Sephadex G50凝膠過(guò)濾層析,平衡液用20mmol/L Na2HP04pH7.0,流速5mL/min,洗脫液(20mmol/L Na2HP04pH7.0, lmol/L NaCl)線性梯度洗脫，對(duì)應(yīng)NaCl 梯度 0.1 0.2mol/L ;收集目的蛋白洗脫峰組份，然后進(jìn)行陰離子交換層析，層析柱Q Sepharose FF預(yù)先用20倍柱體積平衡液(20mmol/L Na2HP04pH7.0)預(yù)平衡，流速5mL/min，上樣結(jié)束后用平衡液沖洗至基線，洗脫液(20mmol/LNa2HP04 pH7.0, lmol/L NaCl)線性梯度洗脫，對(duì)應(yīng)NaCl梯度
0.1 0.2mol/L。收集洗脫峰組份，用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，做15% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，掃描分析純度，純度大于95%。做Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證純化的目的蛋白。6).生產(chǎn)化大規(guī)模培養(yǎng)工藝:將步驟4)中獲得的一級(jí)種子液接種至50L種子罐，BMGY培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速250r/min培養(yǎng)16h，至0D600 = 10 12，移種至1000L反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，采用BMMY發(fā)酵培養(yǎng)液，用28%氨水調(diào)節(jié)pH至5.0。設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)條件:溫度30°C，攪拌速度200r/min，溶氧度35%，自動(dòng)補(bǔ)加氨水維持pH5.1。繼續(xù)培養(yǎng)18h至0D600 =100 120，待溶氧度快速上升，培養(yǎng)液中甘油耗盡時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加50%甘油溶液，速度80mL/h，時(shí)間2 3h，進(jìn)行高密度培養(yǎng)，至0D600 = 150 160時(shí)停止補(bǔ)加甘油，待其完全耗盡時(shí)立即開(kāi)始補(bǔ)加甲醇，誘導(dǎo)產(chǎn)酶，速度30mL/h，時(shí)間30h，發(fā)酵液放入冷卻罐，依放罐發(fā)酵液質(zhì)量3%的量加入固體NaCl，攪拌至鹽溶解，待溫度降到10°C以下，14000r/min離心收集菌體，按照菌體6倍質(zhì)量加入10°C以下蒸餾水，70r/min攪拌lOmin，完成細(xì)胞破碎，14000r/min離心收集上清液；將離心所收集上清液超濾濃縮10倍，進(jìn)行SephadexG50凝膠過(guò)濾層析，平衡液用 20mmol/L Na2HP04pH7.0，流速 5mL/min，洗脫液(20mmol/L Na2HPO4 pH7.0,lmol/L NaCl)線性梯度洗脫，對(duì)應(yīng)NaCl梯度0.1 0.2mol/L ;收集目的蛋白洗脫峰組份，然后進(jìn)行陰離子交換層析，層析柱Q Sepharose FF預(yù)先用20倍柱體積平衡液(20mmol/LNa2HP04pH7.0)預(yù)平衡，流速5mL/min，上樣結(jié)束后用平衡液沖洗至基線，洗脫液(20mmol/L Na2HP04pH7.0, lmol/L NaCl)線性梯度洗脫，對(duì)應(yīng)NaCl梯度0.1 0.2mol/L。收集洗脫峰組份，用Bradford法對(duì)洗脫液進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，蛋白含量大于3000mg/l,平皿瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法進(jìn)行活性檢測(cè)，活性大于2000單位/mgGal-6，做15% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，掃描分析純度大于95%。洗脫液進(jìn)行0.22微米微孔過(guò)濾除菌，紫外線照射lOmin，
4℃低溫保減。Gal基因重組構(gòu)建的示意驗(yàn)證圖:1、Gal-1基因RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)2 %瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，在140bp左右有條帶。與GAL-1基因的成熟肽片斷大小相同，如圖3所示。2、Gal-1基因片段的回收、驗(yàn)證及與克隆載體的連接。在暗室將目的條帶切下，用膠回收試劑盒回收目的條帶，2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示。3、篩選陽(yáng)性菌株挑取平板上的白色單菌落，接種培養(yǎng)基12小時(shí)。然后挑取單菌落做菌落PCR驗(yàn)證。以驗(yàn)證篩選的陽(yáng)性菌株，結(jié)果如圖5所示。抗菌肽的動(dòng)物試驗(yàn)應(yīng)用及效果示例:1、抗菌肽對(duì)艾維茵肉仔雞生產(chǎn)性能的作用示例
①材料與方法選取6000只健康I日齡艾維茵肉仔雞，隨機(jī)分成2組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1000只雞。試驗(yàn)期為42天。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧為玉米-豆柏型，在此基礎(chǔ)上加入5mg/kg的抗菌肽和黃霉素。其他條件兩組相同。②結(jié)果如表I所示
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)物飼料抗菌肽的生產(chǎn)工藝，其特征在于:利用基因重組技術(shù)，將動(dòng)物源性的GAL-6基因克隆到質(zhì)粒pGEM-3Zf，并以pGEM_3Zf-GAL_6為模板，用PCR方法獲得GAL-6基因，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K-GAL-6并轉(zhuǎn)化畢赤酵母；經(jīng)多級(jí)放大培養(yǎng)至中試生產(chǎn)后，全面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，放大到生產(chǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)提取純化得到高純度、高活性成品GAL-6蛋白制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物飼料抗菌肽的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟:1).畢赤酵母PPIC9K-GAL-6表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:將動(dòng)物源性的GAL-6基因克隆到質(zhì)粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6為模板，用上、下游引物擴(kuò)增GAL-6基因；反應(yīng)條件是:94°C變性3分鐘；然后94°C變性40s，40°C退火40s，72°C延伸60s，進(jìn)行5 30個(gè)循環(huán)；然后94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸60s，進(jìn)行20 40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保溫；PCR產(chǎn)物通過(guò)EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)與質(zhì)粒PPIC9K連接重組，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；挑陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒后進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切鑒定，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到基因DNA片段長(zhǎng)502bp，電泳分析結(jié)果顯示在400bp 600bp處有特異性條帶，與預(yù)測(cè)片段長(zhǎng)度一致，重組質(zhì)粒酶切鑒定片段長(zhǎng)度與理論預(yù)測(cè)一致，核苷酸序列分析結(jié)果完全正確，并測(cè)定DNA序列；重組質(zhì)粒命名為PPIC9K-GAL-6 ；2).電轉(zhuǎn)化畢赤酵母及篩選多拷貝陽(yáng)性克隆:參照 Invitrogen 公司 Mult1-Copy Pichia Expression Kit 說(shuō)明書(shū)操作；用 Sal I 酶切重組質(zhì)粒PPIC9K-GAL-6·，使其完全線性化，經(jīng)酚/氯仿抽提、乙醇沉淀純化后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS ;電擊參數(shù)為:電壓1500V，電容25yF，電阻200Ω ;涂布MD平板，30°C靜置培養(yǎng)48h ;挑單克隆菌落接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，經(jīng)同步化后分別接種至含O、1.0,2.0,4.0g/LG418的YPD平板上，30°C靜置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單克隆菌落；3).PCR法鑒定:在高濃度G418-YPD平板上挑單克隆至20 μ L0.25 % SDS溶液中，混勻后90 V加熱3min，離心后取I μ L上清作模板，用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)體系50 μ L，含 1% Triton X-100 ;反應(yīng)條件:95°C 變性 5min ;95 °C變性 60s，55 °C退火 60s，72 °C 延伸60s，進(jìn)行20 50個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸3min，4°C保溫；根據(jù)PCR結(jié)果酶切后電泳鑒定重組質(zhì)粒；4).實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng):在高濃度G418-YPD平板上挑單克隆于YPD培養(yǎng)液中，30°C，250r/min振蕩培養(yǎng)12h，得到一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液接種至1200mL BMGY培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)16h，至0D600 =10 12，得到二級(jí)種子液；將二級(jí)種子液接種至20LBMMY培養(yǎng)液中，用28%氨水調(diào)節(jié)pH至5.0 ;發(fā)酵培養(yǎng)條件為:溫度30°C，攪拌速度200r/min，溶氧度35%，自動(dòng)補(bǔ)加氨水維持PH5.1 ;繼續(xù)培養(yǎng)18h至0D600 = 100 120，待溶氧度快速上升，培養(yǎng)液中甘油耗盡時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加50%甘油溶液，速度80mL/h，時(shí)間2 3h，至0D600 = 150 160時(shí)停止補(bǔ)加甘油，待其完全耗盡時(shí)立即開(kāi)始補(bǔ)加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，速度30mL/h，時(shí)間30h ;誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，發(fā)酵液放入冷卻罐，按放罐發(fā)酵液質(zhì)量3%的量加入固體NaCl，攪拌至鹽溶解，待溫度降到IO0C以下，14000r/min離心收集菌體，按照菌體6倍質(zhì)量加入10°C以下蒸懼水,70r/min攪拌lOmin，完成細(xì)胞破碎，14000r/min離心收集上清液；5).重組GAL-6的純化和鑒定:將步驟4)中收集的上清液超濾濃縮5 15倍,進(jìn)行Sephadex G50凝膠過(guò)濾層析,上樣結(jié)束后用平衡液平衡至基線，平衡液用20mmol/L Na2HPO4, pH = 7.0，流速5mL/min ;然后用洗脫液線性梯度洗脫，洗脫液為20mmol/L Na2HPO4和lmol/L NaCl, pH = 7.0 ;對(duì)應(yīng)NaCl梯度0.1 0.2mol/L ;收集目的蛋白洗脫峰組份，然后進(jìn)行陰離子交換層析，層析柱QSepharose FF預(yù)先用20倍柱體積平衡液預(yù)平衡,平衡液為20mmol/L Na2HPO4, pH = 7.0,流速5mLPmin ;上樣結(jié)束后用平衡液沖洗至基線，再洗脫液線性梯度洗脫，洗脫液為20mmol/L Na2HPO4 和 lmol/LNaCl, pH = 7.0，對(duì)應(yīng) NaCl 梯度 0.1 0.2mol/L ;收集洗脫峰組份，用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，做15% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，掃描分析純度，純度應(yīng)大于95% JAWestern Blot進(jìn)一步驗(yàn)證純化的目的蛋白；6).生產(chǎn)化大規(guī)模培養(yǎng)工藝:將步驟4)中獲得的一級(jí)種子液接種至50L種子罐，BMGY培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速250r/min培養(yǎng)16h，至0D600 = 10 12，移種至1000L反應(yīng)器中進(jìn)行生產(chǎn)化大規(guī)模培養(yǎng)；采用BMMY發(fā)酵培養(yǎng)液，用28%氨水調(diào)節(jié)pH至5.0 ;發(fā)酵培養(yǎng)條件為:溫度30°C，攪拌速度200r/min，溶氧度35%,自動(dòng)補(bǔ)加氨水維持pH = 5.1 ;繼續(xù)培養(yǎng)18h至0D600 = 100 120，待溶氧度快速上升，培養(yǎng)液中甘油耗盡時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加50%甘油溶液，速度80mL/h，時(shí)間2 3h，進(jìn)行高密度培養(yǎng)，至0D600 = 150 160時(shí)停止補(bǔ)加甘油，待其完全耗盡時(shí)立即開(kāi)始補(bǔ)加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，速度30mL/h，時(shí)間30h，發(fā)酵液放入冷卻罐，依放罐發(fā)酵液質(zhì)量3%的量加入固體NaCl，攪拌至鹽溶解，待溫度降到10°C·以下，14000r/min離心收集菌體，按照菌體6倍質(zhì)量加入10°C以下蒸懼水，70r/min攪拌IOmin,完成細(xì)胞破碎，14000r/min離心收集上清液,純化后即得到GAL-6蛋白制劑產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種動(dòng)物飼料抗菌肽的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟3)中所述的上游引物的序列為Y AGGGAGACAGAAGGCAGCGGTGAT (5' AoxI Primer);下游引物的序列為 5' TCCCAGGAGAAGCCAGTGAGTCAT 3' (3' AoxI Primer)。
4.一種動(dòng)物飼料抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于，給動(dòng)物飲水時(shí)，按每升水加5-10毫克抗菌肽GAL-6的量將抗菌肽GAL-6混合在動(dòng)物飲水中，讓動(dòng)物飲用，以提高動(dòng)物免疫力，取代動(dòng)物飼料抗生素，減少動(dòng)物疾病。
5.—種動(dòng)物飼料抗菌肽的應(yīng)用,其特征在于,給動(dòng)物飼喂顆粒飼料時(shí),按每公斤飼料添加5-10毫克抗菌肽GAL-6的量，采用制粒過(guò)程的后噴方法將抗菌肽溶于適量水中噴曬在制粒冷卻后的動(dòng)物飼料表面，飼喂動(dòng)物，以提高動(dòng)物免疫力，取代或減少動(dòng)物飼料抗生素，減少動(dòng)物疾病。
6.一種動(dòng)物飼料抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于，給動(dòng)物飼喂粉狀飼料時(shí)，按每公斤飼料添加5-10毫克抗菌肽GAL-6的量，將其直接混合在動(dòng)物飼料里，飼喂動(dòng)物，以提高動(dòng)物免疫力，取代或減少動(dòng)物飼料抗生素，減少動(dòng)物疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物飼料抗菌肽的生產(chǎn)工藝及其應(yīng)用，尤其是抗菌肽家族中Gallinacin系列中的GAL-6的生產(chǎn)工藝及其應(yīng)用。該工藝?yán)没蛑亟M技術(shù)，將動(dòng)物源性的GAL-6基因克隆到質(zhì)粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6為模板，用PCR方法獲得GAL-6基因，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-GAL-6，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母；經(jīng)多級(jí)放大培養(yǎng)至中試生產(chǎn)后，全面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，放大到生產(chǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)純化后得到高純度、活性好的成品GAL-6蛋白制劑。該蛋白制劑的應(yīng)用采用動(dòng)物飲水或顆粒飼料制粒后噴涂的方法以克服高溫、高壓等對(duì)蛋白制品的破壞性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有工藝簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/84GK103074362SQ20111032819
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者鐘誠(chéng) 申請(qǐng)人:上海高龍生物科技有限公司