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肌肉組織特異性表達(dá)Follistatin以提高牛瘦肉率的轉(zhuǎn)基因載體的制作方法

文檔序號(hào):399450閱讀:251來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):肌肉組織特異性表達(dá)Follistatin以提高牛瘦肉率的轉(zhuǎn)基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種肌肉組織特異性表達(dá)Follistatin以提高牛瘦肉率的轉(zhuǎn)基因載體。
背景技術(shù)
牛肉作為中國(guó)人民的主要肉類(lèi)食品之一,保證全國(guó)人民有充足的、優(yōu)質(zhì)的牛肉供應(yīng)是關(guān)系到人民日常生活的重要事件。而隨著人口的增長(zhǎng)和人民生活水平的提高,除了對(duì)牛肉的需求量增加以外,對(duì)牛肉的質(zhì)量和口感的要求也提高了。因此,有必要建立和改良中國(guó)自己的牛的品種,改善牛肉口感和質(zhì)量,以滿(mǎn)足人民群眾的生活需求。Follistatin是由肌肉細(xì)胞分泌到血液中的一種糖蛋白,它可與抑制肌肉生長(zhǎng)的Myostatin結(jié)合,從而拮抗Myostatin的功能,進(jìn)而促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)。已在小鼠和猴中通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明,將表達(dá)Follistatin的腺病毒群(Adeno-associated Virus)注射到肌肉中,可有效地促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng),不僅提高了肌肉的重量,還增強(qiáng)了肌肉的力量(Haidet A.M.etal." Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single geneadministration of myostatin inhibitors." Proc Natl Acad Sci USA,2008.105:4318-4322 ;Kota, J.et al.“Follistatin gene delivery enhances muscle growth andstrength in nonhuman primates”.Sci Transl Med, 2009.1,6ral5)。基于這些數(shù)據(jù),我們預(yù)期在牛的骨骼肌中過(guò)表達(dá)Follistatin可提高牛的瘦肉率,并可改善肌肉的品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是一種能在肌肉組織特異性表達(dá)Follistatin以提高牛瘦肉率的轉(zhuǎn)基因載體。為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:一種能在肌肉組織特異性表達(dá)Follistatin以提高牛瘦肉率的轉(zhuǎn)基因載體包含小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase,MCK)增強(qiáng)子、2.7kb牛的α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白(a -skeletal actin)基因的啟動(dòng)子、牛的Follistatin的cDNA和牛生長(zhǎng)激素基因(bGH)的3’端不翻譯區(qū)域,且?guī)в胁溉閯?dòng)物細(xì)胞中篩選用的抗性基因-嘌呤霉素(PuiOmycin)基因和原核細(xì)胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素(Zeocin)基因(見(jiàn)圖2)。2.7kb的α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白(a-skeletal actin)的啟動(dòng)子可保證下游的基因在骨骼肌中特異表達(dá),而且MCK增強(qiáng)子也具有肌肉組織特異性的增強(qiáng)子活性,可特異地促進(jìn)下游基因的高表達(dá)。在此轉(zhuǎn)基因載體中表達(dá)的是牛自身的Follistatin基因,所以從食品安全的角度講,對(duì)消費(fèi)者的健康沒(méi)有任何影響。此外,本發(fā)明在嘌呤霉素和博萊霉素抗性基因的兩端還加入LoxP序列,這樣,在Follistatin基因整合到基因組DNA后,如有需要,本發(fā)明可通過(guò)表達(dá)Cre蛋 白,誘導(dǎo)LoxP序列的重組,以除去抗性基因,進(jìn)一步保障轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的食品安全性。
本發(fā)明構(gòu)建的肌肉組織特異表達(dá)牛Follistatin的轉(zhuǎn)基因載體pHJ20的全序列如SEQ ID No:1所示,其中第5-1039堿基為牛Follistatin編碼區(qū),第1059-1272堿基為bGH 3’端不翻譯區(qū),第1448-1481堿基為L(zhǎng)oxP,第1837-2508堿基為嘌呤霉素抗性基因,第2566-2937堿基博萊霉素(Zeocin)抗性基因,第2952_2985LoxP堿基為4458-4804 MCK增強(qiáng)子,第5110-7857堿基為牛α -骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體可應(yīng)用于體細(xì)胞克隆,以構(gòu)建高瘦肉率的Follistatin.轉(zhuǎn)基因牛。


圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2是本發(fā)明構(gòu)建的PHJ20轉(zhuǎn)基因載體的示意圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例,可以更好地理解本發(fā)明。然而,本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解,實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明,而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1:插入 LoxP-Puro-Zeo-LoxP 片段,構(gòu)建 pZTl。將pO)NA3.I (myc-His) a 載體(Invitrogen)用 PvuII 酶切,酶切體系為 2 μ g 質(zhì)粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I PvuII 酶,加入 ddH20 補(bǔ)足體積至 30 μ 1,37°C溫浴 3 小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出3.3kb大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步 驟為,將紫外光下切下目的DNA條帶裝入1.5ml離心管中,稱(chēng)重后加入3倍體積的溶膠液,55°C保溫10分鐘,使瓊脂糖凝膠完全融化;融化的凝膠待溫度降至室溫后,將混合液轉(zhuǎn)入附柱中,10,OOOg離心I分鐘,倒掉流出液;加入650 μ I漂洗緩沖液,10,OOOg離心I分鐘,倒掉流出液;吸附柱再次離心,10,OOOg離心,I分鐘,倒掉流出液;將吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml離心管中,加入50 μ I ddH20,放置I分鐘,10,OOOg離心I分鐘收集純化產(chǎn)物。從pSNAP載體用EcoRV酶切出LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段,酶切體系為3 μ g質(zhì)粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I EcoRV 酶,加入 ddH20 補(bǔ)足體積至 30 μ 1,37°C溫浴 3 小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出1.7kb大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pCDNA3.1 (myc-His) a(PvuII)和 LoxP-Puro-Zeo-LoxP (EcoRV)連接,連接反應(yīng)中加入2μ I載體,6μ I插入片段,1μ I 10Xbuffer,I μ I T4DNA連接酶,16°C溫浴16小時(shí)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。取一管50 μ I的Trans5 α感受態(tài)細(xì)胞置于冰上,待其融化后,向其中加入4μ I上述連接產(chǎn)物,輕彈混勻,后于冰上孵育30分鐘;42°C熱擊30秒,后冰上靜置10分鐘;加入500 μ I無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基,37°C震蕩培養(yǎng)I小時(shí);4,OOOrpm離心5分鐘,吸走,保留100 μ I左右的培養(yǎng)基,用移液器將細(xì)菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨節(jié)和博萊雙抗性的LB培養(yǎng)基平板上。然后將平板置于37°C溫箱培養(yǎng)16小時(shí)。克隆生長(zhǎng)出來(lái)后,挑單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí),提取質(zhì)粒DNA,用EcoRI酶切鑒定,陽(yáng)性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的兩條DNA條帶。再通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆的正確性,得到的克隆即為PZT1。實(shí)施例2:插入牛α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子DNA片段,構(gòu)建pZT2。將pZTl用PvuI和NdeI雙酶切,酶切體系為2yg質(zhì)粒DNA,3y I 10Xbuffer,1.5μ I PvuI酶,1.5μ I NdeI酶,加入ddH20補(bǔ)足體積至30μ 1,37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出4.0kb大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過(guò)PCR擴(kuò)增得到2.7kb的牛α -骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子DNA片段,PCR條件如下:1μ I (約 IOOng)?;蚪M DNA,引物 I (ATG CCT CCT CAG CTCTCA AAC GG)和引物2 (TCA CAT CTG GCT GAT TCT CTG CTT C)的終濃度均為 0.5 μ M, dNTPs 的終濃度為 0.2mM,5μ I 10 X buffer,I μ I HiFi Taq 酶,加入 ddH20 補(bǔ)足體積至 50 μ1.PCR 循環(huán)為,95°C,2 分鐘;接著是95 °C,30秒,55 °C,30秒,72 °C,3分鐘,35個(gè)循環(huán);72 °C,5分鐘;4°C,保溫。將PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出2.7kb大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將PCR擴(kuò)增得到的2.7kb的牛α -骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子DNA片段通過(guò)TA克隆連接到pEASY-T3載體(全式金公司)上。I μ I pEASY_T3,加入4 μ I 2.7kb的牛α -骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子DNA片段,250C,30分鐘。然后將連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化到E.coli感受態(tài)細(xì)胞中,把轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布到含有IPTG和X-Gal以及氨芐青霉素的LB平板上生長(zhǎng)??寺∩L(zhǎng)出來(lái)后,挑白色的單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí),提取質(zhì)粒DNA,用EcoRI酶切鑒定,陽(yáng)性克隆中可得到3.0kb和2.7kb的兩條DNA條帶。再通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆的正確性,得到的克隆即為pLCNK3。從pLCNK3用PvuI和NdeI雙酶切以切出牛α -骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子DNA,酶切體系為3yg pLCNK3DNA,3 μ I 10 Xbuff er,1.5μ I PvuI 酶,1.5μ I NdeI 酶,加入ddH20補(bǔ)足體積至30 μ 1,37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出2.7kb大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZTl (PvuI/NdeI)和牛α -骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子DNA(PvuI/NdeI)連接,連接反應(yīng)同上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ε.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。具體步驟同上,除了只用博萊霉素進(jìn)行抗性篩選。克隆生長(zhǎng)出來(lái)后,挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養(yǎng)液中,37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí),提取質(zhì)粒DNA,用EcoRI酶切鑒定,陽(yáng)性克隆中可得到2.8kb、2.lkb、1.6kb和0.5kb的四條DNA條帶。再通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆的正確性,得到的克隆即為pZT2。實(shí)施例3:插入MCK增強(qiáng)子DNA片段,構(gòu)建pML5。將pZT2 用 PvuI 酶切,酶切體系為 2yg 質(zhì)粒 DNA,3y I 10 X buffer,1.5 μ IKpnI酶,1.5 μ INdeI酶,加入ddH20補(bǔ)足體積至30μ 1,37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出7.0kb大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。pZT2 載體的 去磷酸化,35 μ I pZT2 (PvuI),4 μ I 10 X buffer, I μ I 牛小腸堿性去磷酸化酶(CIP),37°C溫浴I小時(shí)。然后將反應(yīng)體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出7.0kb大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過(guò)PCR擴(kuò)增得到MCK增強(qiáng)子DNA片段,PCR條件如下:I μ I (約IOng)模板DNAPST181,引物 I (gataCGATCGACGGGCCAGATATACGCGTTAGAA)和引物 2 (ccggCGATCGGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTAT)的終濃度均為 0.5 μ M, dNTPs 的終濃度為 0.2mM, 5 μ I 10 X buffer, I μ IHiFi Taq酶,加入ddH20補(bǔ)足體積至50 μ I。PCR循環(huán)為,95°C,2分鐘;接著是95°C,30秒,550C,30秒,720C,30秒,35個(gè)循環(huán);72°C,5分鐘;4°C,保溫。然后將PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出500bp大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。用PvuI 酶切 MCK 增強(qiáng)子 DNA 片段,酶切體系為 3μ g DNA,4 μ I 10 X buffer, 3 μ IPvuI酶,加入ddH20補(bǔ)足體積至40μ 1,37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出500bp大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZT2(PvuI/CIP)和MCK增強(qiáng)子DNA片段(PvuI)連接,連接反應(yīng)同上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞中.具體步驟同上,除了只用博萊霉素進(jìn)行抗性篩選??寺∩L(zhǎng)出來(lái)后,挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養(yǎng)液中,37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí),提取質(zhì)粒DNA,用PvuI酶切鑒定,陽(yáng)性克隆中可得到8.5kb和0.5kb的兩條DNA條帶。再通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆的正確性,得到的克隆即為PML5。實(shí)施例4:插入牛Follistatin編碼區(qū)域DNA片段,構(gòu)建pHJ20。將pML5用NdeI和PmeI雙酶切,酶切體系為2yg質(zhì)粒DNA,3y I 10Xbuffer,1.5μ I PmeI酶,1.5μ I NdeI酶,加入ddH20補(bǔ)足體積至30 μ 1,37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出6.9kb大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過(guò)全基因合成(Invitrogen)得到牛Follistatin編碼區(qū)域DNA片段,用NdeI和PmeI 雙酶切,酶切體系為 3μ g質(zhì)粒 DNA,3y I 10Xbuffer,1.5μ I PmeI 酶,L 5μ I NdeI酶,加入ddH20補(bǔ)足體積至30 μ 1,37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離,切出1.0kb大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pML5 (Pmel/Ndel)和牛 Follistatin 編碼區(qū)域 DNA 片段(Pmel/Ndel)連接,連接反應(yīng)同上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。具體步驟同上,除了只用博萊霉素進(jìn)行抗性篩選??寺∩L(zhǎng)出來(lái)后,挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養(yǎng)液中,37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí),提取質(zhì)粒DNA,用EcoRI酶 切鑒定,陽(yáng)性克隆中可得到3.0kb,2.8kb、l.5kb、0.3kb和0.2kb的五條DNA條帶。再通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆的正確性,得到的克隆即為PHJ20。
權(quán)利要求
1.肌肉組織特異性表達(dá)FolliStatin以提高牛瘦肉率的轉(zhuǎn)基因載體,其特征在于,所述轉(zhuǎn)基因載體含有小鼠的肌酸激酶增強(qiáng)子、2.7kb牛的α -骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子、牛的Follistatin的cDNA和牛生長(zhǎng)激素基因的3’端不翻譯區(qū)域,且?guī)в胁溉閯?dòng)物細(xì)胞中篩選用的抗性基因-嘌呤霉素·基因和原核細(xì)胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種肌肉組織特異性表達(dá)Follistatin以提高牛瘦肉率的轉(zhuǎn)基因載體,所述轉(zhuǎn)基因載體含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase,MCK)增強(qiáng)子、2.7kb牛的α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子、牛的Follistatin的cDNA和牛生長(zhǎng)激素基因的3’端不翻譯區(qū)域,且?guī)в胁溉閯?dòng)物細(xì)胞中篩選用的抗性基因-嘌呤霉素基因和原核細(xì)胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體可應(yīng)用于體細(xì)胞克隆,以構(gòu)建高瘦肉率的Follistatinmus轉(zhuǎn)基因牛。
文檔編號(hào)C12N15/85GK103074373SQ20111032931
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者戴一凡, 陳凌懿 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)
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