專利名稱：纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶復(fù)合酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種液態(tài)混合菌發(fā)酵纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的方法。
背景技術(shù)：
纖維質(zhì)原料中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素分別占30 40%、15 30%、10 20%。 纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產(chǎn)物，是地球上最為豐富的可再生性天然資源。據(jù)估計，地球上纖維素中所蘊藏的能量大約相當(dāng)于6400億噸的石油所含的能量，而且纖維素的可再生性是石油等礦質(zhì)能源所不可比擬的。充分利用纖維素酶處理纖維素，有可能從根本上解決人類所面臨的能源與糧食問題，其深遠(yuǎn)影響是不可低估的。然而，目前約80%纖維素未被開發(fā)利用，具有極為誘人的前景。纖維素酶的生產(chǎn)和其它酶制劑一樣，主要有固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵兩種，國內(nèi)外在這方面做了許多有價值的工作。固體發(fā)酵法是以玉米等農(nóng)作物秸稈為主要原料，其投資少，工藝簡單，產(chǎn)品價格低廉，目前國內(nèi)絕大部分纖維素酶生產(chǎn)廠家均采用該技術(shù)生產(chǎn)纖維素酶。但是固體發(fā)酵法存在著一定的缺陷，以秸稈為原料的固體發(fā)酵法生產(chǎn)的纖維素酶自動化程度低，勞動強(qiáng)度大，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。因此，隨著液體發(fā)酵酶工藝的發(fā)展及菌種性能的提高，采用液體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維酶素是必然趨勢。木聚糖在植物細(xì)胞壁中的含量僅次于纖維素，是半纖維素中含量最豐富的一種。 木聚糖是由D-木糖主鏈(以0_1，4鍵相連)和L-阿拉伯糖分枝(a-l，2和a-l，3相連) 所組成的聚合物。半纖維素木聚糖在木質(zhì)組織中占總量的50%，它結(jié)合在纖維素微纖維的表面，并且相互連接，這些纖維構(gòu)成了堅硬的細(xì)胞相互連接的網(wǎng)絡(luò)。這種堅硬的網(wǎng)絡(luò)阻礙了纖維素酶對纖維素吸附，從而影響了纖維素的降解速率。在天然纖維素水解成葡萄糖的過程中，必須依靠3種組分的協(xié)同作用才能完成。 纖維素大分子首先在C1酶和Cx酶的作用下逐步降解成纖維二糖，而纖維二糖酶則進(jìn)一步將纖維二糖水解成2個葡萄糖。由于高濃度的纖維二糖對C1酶和Cx酶活力有強(qiáng)烈的抑制作用，而在低濃度時則是纖維素酶的誘導(dǎo)物，如果纖維素酶復(fù)合組分中缺乏纖維二糖酶組分就會嚴(yán)重影響纖維素的降解速率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復(fù)合酶及其制備方法。本發(fā)明提供的纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復(fù)合酶的制備方法，其為將制備的綠色木霉液體種子和黑曲霉液體種子先后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復(fù)合酶。在本發(fā)明的一個實施方案中，先將綠色木霉液體種子以體積比1 5%的接種量接種后發(fā)酵3 8天后，以體積比1 5%的接種量接入黑曲酶液體種子，再共同發(fā)酵3 8天。優(yōu)選的，先將綠色木霉液體種子以體積比5%的接種量接種后發(fā)酵3 8天后，以體積比3%的接種量接入黑曲酶液體種子，再共同發(fā)酵3 8天。其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基。優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基含有微晶纖維素 20-30wt %、玉米漿5-10wt %、尿素5-10wt %、硫酸銨5_10wt %、磷酸氫二鉀5_10wt %、硫酸鎂 Tween800. l_lwt%，其余為水。本發(fā)明中，優(yōu)選的發(fā)酵條件為pH維持在5 7，溫度25 30°C，轉(zhuǎn)速200 400 轉(zhuǎn)/min，罐壓0. 05 0. 15Mpa，通風(fēng)比(發(fā)酵液體積氣體體積)1 0. 5 1 1.5。其中，用于培養(yǎng)綠色木霉液體種子的種子培養(yǎng)基含有葡萄糖3-5wt%、玉米漿 2-4wt %、尿素l_3wt %、硫酸銨%、磷酸氫二鉀%，硫酸鎂0. 5-lwt %，其余組分為水。用于培養(yǎng)黑曲霉液體種子的種子培養(yǎng)基含有麩皮3-5wt%、尿素l-3wt%、硝酸銨 l-3wt%、磷酸二氫鉀l_3wt%、碳酸鈣l_3wt%，其余組分為水。本發(fā)明中，綠色木霉液體種子的制備方法如下將綠色木霉的孢子接入液體種子培養(yǎng)基中，20 30°C培養(yǎng)48小時。黑曲霉液體種子的制備方法如下將黑曲霉孢子接入液體種子培養(yǎng)基中，20 30°C培養(yǎng)48小時。本發(fā)明中，所述的綠色木霉優(yōu)選為綠色木霉CGMCC 3. 3744，所述的黑曲霉優(yōu)選為黑曲霉 CGMCC 3. 3150。本發(fā)明的關(guān)鍵點在于所得酶系豐富，各酶之間相互協(xié)同作用，促進(jìn)酶活增加。用單一綠色木霉菌種發(fā)酵所得到纖維素酶活為20IU/ml，用單一黑曲霉菌種發(fā)酵所得到木聚糖酶酶活1000IU/ml，纖維二糖酶酶活50IU/ml，采用本技術(shù)混菌發(fā)酵后增加至纖維素酶活 50IU/ml，木聚糖酶酶活4000IU/ml，纖維二糖酶酶活400IU/ml。本發(fā)明中纖維素酶的測定方法用0. Ig濾紙作為底物，加0. 9mL pH4. 8檸檬酸緩沖液，再加 0. ImL粗酶離心上清液，50°C恒溫水浴搖床反應(yīng)30min，用3，5- 二硝基水楊酸法測定生成的還原糖，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)糖，以每分鐘生成ι μ mol還原糖所需的酶量定義成一個纖維素酶酶活力單位(IU)。液體發(fā)酵好的醪液離心取上清液即為粗酶液。檸檬酸緩沖液為21g無水檸檬酸、7. 8g氫氧化鈉加蒸餾水定容至2L，pH為4. 8。還原糖測定方法采用DNS法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)。木聚糖酶的測定方法是用0. 2g木聚糖作為底物，加0. 9mL pH4. 8檸檬酸緩沖液， 再加0. ImL粗酶稀釋液，50°C恒溫水浴搖床反應(yīng)30min，用3，5- 二硝基水楊酸法測定生成的還原糖，以木糖為標(biāo)準(zhǔn)糖，以每分鐘生成1 μ mol還原糖所需的酶量定義成一個木聚糖酶酶活力單位(IU)。液體發(fā)酵好的醪液離心取上清液即為粗酶液。檸檬酸緩沖液為21g無水檸檬酸、7. 8g氫氧化鈉加蒸餾水定容至2L，pH為4. 8。還原糖測定方法采用DNS法，以木糖為標(biāo)準(zhǔn)。固體培養(yǎng)基水分測定水分測定儀測定。纖維二糖酶的測定方法是在小試管中加入Iml酶液，再加入Iml 二糖底物，用橡皮塞封口。試管放入50°C水浴中，預(yù)熱5min，保溫30min后終止反應(yīng)。一個纖維二糖酶活力國際單位定義為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，每分鐘生成2 μ mol葡萄糖的酶量。液體發(fā)酵好的醪液離心取上清液即為粗酶液。檸檬酸緩沖液為21g無水檸檬酸、7. Sg氫氧化鈉加蒸餾水定容至 2L, pH 為 4. 8。
本發(fā)明中，黑曲霉能高產(chǎn)木聚糖酶和纖維二糖酶，而綠色木霉生產(chǎn)木聚糖酶和纖維二糖酶的能力較弱，生產(chǎn)纖維素酶的能力較強(qiáng)。而纖維素的水解需要多種酶的協(xié)同作用， 故在發(fā)酵過程中，通過木聚糖酶對木聚糖的水解可以降低其和纖維素的連接，從而增加了纖維素酶對纖維素吸附，從而提高了纖維素的利用率，使發(fā)酵液中的糖含量有所增加。而纖維二糖酶則水解產(chǎn)生纖維二糖，會使纖維二糖的含量在發(fā)酵過程中處于低濃度水平，從而誘導(dǎo)纖維素酶降解纖維素。最終使發(fā)酵液中的纖維素酶酶活增加，同時聯(lián)產(chǎn)木聚糖酶和纖維二糖酶。在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，生產(chǎn)出同時含有纖維素酶、木聚糖酶、纖維二糖酶的液體復(fù)合酶。該方法生產(chǎn)的液體、生產(chǎn)周期短、成本低、質(zhì)量穩(wěn)定。本發(fā)明提供的纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復(fù)合酶在造紙、紡織等各種需要纖維素預(yù)處理的環(huán)節(jié)中均可以應(yīng)用。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1以綠色木霉(CGMCC 3. 3744，購自中科院微生物所)為單一菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基含有微晶纖維素20wt%、玉米漿5wt%、尿素10wt%、硫酸銨5wt%、磷酸氫二鉀5wt%、其余為水。選擇長勢良好的綠色木霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有121°C 30min滅菌的綠色木霉液體種子培養(yǎng)基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下190轉(zhuǎn)經(jīng)4 搖床培養(yǎng)。 其中，所述的種子培養(yǎng)基含葡萄糖日襯^^玉米漿-丨^^尿素3wt%、硫酸銨2wt%、磷酸氫二鉀2wt%，硫酸鎂lwt%，其余組分為水。培養(yǎng)結(jié)束后接入70%裝液量的30L發(fā)酵罐中按 5%接種量進(jìn)行發(fā)酵，控制pH 6、溫度30°C、轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/min、罐壓0. 05Mpa、通風(fēng)1 1.4。 維持條件不變發(fā)酵培養(yǎng)7天，得到纖維素酶活為20IU/ml。實施例2以黑曲霉(CGMCC 3. 3150，購自中科院微生物所)為單一菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基含有 玉米漿5wt %、尿素IOwt %、磷酸氫二鉀5wt %、硫酸鎂5wt %和Tween801.0wt%,其余為水。選擇長勢良好的黑曲霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含121°C 30min滅菌的黑曲霉液體種子培養(yǎng)基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下210轉(zhuǎn)經(jīng)4 搖床培養(yǎng)。其中， 黑曲霉液體種子培養(yǎng)基含麩皮5wt%、尿素^^^、硝酸銨；？襯^^磷酸二氫鉀Iwt %、碳酸鈣 3wt%，其余組分為水。培養(yǎng)結(jié)束后按3%接種量接入70%裝液量的30L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，控制PH 5、溫度30°C、轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/min、罐壓0.05Mpa、通風(fēng)1 1。維持條件不變發(fā)酵培養(yǎng)5天，得到木聚糖酶酶活為1000IU/ml，纖維二糖酶酶活為50IU/ml。實施例3制備發(fā)酵培養(yǎng)基微晶纖維素30wt%、玉米漿5wt%、尿素IOwt %、硫酸銨5wt%、 磷酸氫二鉀10wt%、硫酸鎂5 丨％和Tween801. 0wt%，其余為水。選擇長勢良好的綠色木霉(CGMCC 3.3744)菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有121°C 30min滅菌的綠色木霉液體種子培養(yǎng)基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下190轉(zhuǎn)經(jīng)4 搖床培養(yǎng)。其中，所述的種子培養(yǎng)基含葡萄糖5wt %、玉米漿%、尿素3wt %、硫酸銨2wt%、磷酸氫二鉀2wt%，硫酸鎂lwt%，其余組分為水。培養(yǎng)結(jié)束后按3%接種量接入 70%裝液量的30L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，控制pH5、溫度30°C、轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/min、罐壓0. 05Mpa、通風(fēng)1 1.4。選擇長勢良好的黑曲霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含12rC30min滅菌的黑曲霉液體種子培養(yǎng)基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下210轉(zhuǎn)經(jīng)4 搖床培養(yǎng)。其中，黑曲霉液體種子培養(yǎng)基含麩皮5wt%、尿素^^^、硝酸銨；？襯^^磷酸二氫鉀lwt%、碳酸鈣3wt%，其余組分為水。待綠色木霉發(fā)酵3天后按3%接種量接入黑曲霉(CGMCC3. 3150) 液體種子，維持原條件不變繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)5天。得到纖維素酶活為50IU/ml，木聚糖酶酶活為3000IU/ml，纖維二糖酶酶活為300IU/ml。實施例4制備發(fā)酵培養(yǎng)基微晶纖維素20wt%、玉米漿8wt%、尿素5wt%、硫酸銨7wt%、磷酸氫二鉀5wt%、硫酸鎂Tween800. 6wt%，其余為水。選擇長勢良好的綠色木霉(CGMCC 3.3744)菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有121°C 30min滅菌的綠色木霉液體種子培養(yǎng)基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下190轉(zhuǎn)經(jīng)4 搖床培養(yǎng)。其中，所述的綠色木霉種子培養(yǎng)基含葡萄糖3wt%、玉米漿2wt%、尿素 Iwt %、硫酸銨%、磷酸氫二鉀%，硫酸鎂0. 5wt %，其余組分為水。培養(yǎng)結(jié)束后按5 % 接種量接入70%裝液量的30L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，控制pH 6、溫度^TC、轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/min、 罐壓0.07Mpa、通風(fēng)比1 1.2。選擇長勢良好的黑曲霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含121°C 30min滅菌的黑曲霉液體種子培養(yǎng)基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下210轉(zhuǎn)經(jīng) 4 搖床培養(yǎng)。其中，黑曲霉液體種子培養(yǎng)基含麩皮3wt%、尿素3wt%、硝酸銨lwt%、磷酸二氫鉀3wt %、碳酸鈣Iwt %，其余組分為水。待綠色木霉發(fā)酵3天后按1 %接種量接入黑曲霉(CGMCC 3.3150)(購自中科院微生物所)液體種子，維持原條件不變繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4天。 得到纖維素酶活為50IU/ml，木聚糖酶酶活為4000IU/ml，纖維二糖酶酶活為400IU/ml。實施例5制備發(fā)酵培養(yǎng)基微晶纖維素25wt%、玉米漿10wt%、尿素6wt%、硫酸銨10wt%、 磷酸氫二鉀7wt%、硫酸鎂10 丨％和Tween800. lwt%，其余為水。選擇長勢良好的綠色木霉(CGMCC 3.3744)菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有121°C 30min滅菌的綠色木霉液體種子培養(yǎng)基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下190轉(zhuǎn)經(jīng)4 搖床培養(yǎng)。其中，所述的綠色木霉種子培養(yǎng)基含葡萄糖#丨％、玉米漿3wt%、尿素 2wt %、硫酸銨3wt %、磷酸氫二鉀3wt %，硫酸鎂0. 8wt %，其余組分為水。培養(yǎng)結(jié)束后按5 % 接種量接入70%裝液量的30L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，控制pH 7、溫度、轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/min、 罐壓0.09Mpa、通風(fēng)1 1.3。選擇長勢良好的黑曲霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含 121°C 30min滅菌的黑曲霉液體種子培養(yǎng)基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下210轉(zhuǎn)經(jīng)4 搖床培養(yǎng)。其中，黑曲霉液體種子培養(yǎng)基含麩皮^t %、尿素2wt %、硝酸銨2wt %、磷酸二氫鉀2wt %、碳酸鈣2wt %，其余組分為水。待綠色木霉發(fā)酵3天后按3 %接種量接入黑曲霉 (CGMCC 3.3150)液體種子，維持原條件不變繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4天。得到纖維素酶活為40IU/ ml，木聚糖酶酶活為4500IU/ml，纖維二糖酶酶活為400IU/ml。實施例6制備發(fā)酵培養(yǎng)基微晶纖維素30wt%、玉米漿5wt%、尿素IOwt %、硫酸銨6wt%、 磷酸氫二鉀9 丨％、硫酸鎂6 丨％和Tween800. ，其余為水。選擇長勢良好的綠色木霉(CGMCC 3.3744)菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有121°C 30min滅菌的綠色木霉液體種子培養(yǎng)基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下190轉(zhuǎn)經(jīng)4 搖床培養(yǎng)。其中，所述的綠色木霉種子培養(yǎng)基含葡萄糖3wt%、玉米漿3wt%、尿素 2wt%、硫酸銨2wt%、磷酸氫二鉀#t%，硫酸鎂lwt%，其余組分為水。培養(yǎng)結(jié)束后按5% 接種量接入70%裝液量的30L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，控制pH 7、溫度、轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/min、 罐壓0. 13Mpa、通風(fēng)1 1.5。選擇長勢良好的黑曲霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含 121°C 30min滅菌的黑曲霉液體種子培養(yǎng)基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下210轉(zhuǎn)經(jīng)4 搖床培養(yǎng)。其中，黑曲霉液體種子培養(yǎng)基含麩皮5wt %、尿素2wt %、硝酸銨3wt %、磷酸二氫鉀lwt%、碳酸鈣3wt%，其余組分為水。待綠色木霉發(fā)酵3天后按5%接種量接入黑曲霉 (CGMCC 3.3150)液體種子，維持原條件不變繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4天。得到纖維素酶活為40IU/ ml，木聚糖酶酶活為4000IU/ml，纖維二糖酶酶活為400IU/ml。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復(fù)合酶的制備方法，其特征在于，將制備的綠色木霉液體種子和黑曲霉液體種子先后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復(fù)合酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，先將綠色木霉液體種子以體積比1 5%的接種量接種后發(fā)酵3 8天后，以體積比為1 5%的接種量接入黑曲霉液體種子，再共同發(fā)酵3 8天。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，先將綠色木霉液體種子以體積比5% 的接種量接種后發(fā)酵3 8天后，以體積比為3%的接種量接入黑曲霉液體種子，再共同發(fā)酵3 8天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有微晶纖維素20-30wt%、玉米漿5-10wt%、尿素5-10wt%、硫酸銨5_10wt %、磷酸氫二鉀 5-10wt%、硫酸鎂 5-10wt%iP Tween800. l_lwt%，其余為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵條件為pH 維持在5 7，溫度25 30°C，轉(zhuǎn)速200 400轉(zhuǎn)/min，罐壓0. 05 0. 15Mpa，通風(fēng)比 1 0. 5 1 1. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述綠色木霉液體種子的種子培養(yǎng)基含有葡萄糖3_5wt %、玉米漿%、尿素l-3wt %、硫酸銨%、磷酸氫二鉀2-#t%，硫酸鎂0. 5-lwt%，其余組分為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的黑曲霉液體種子的種子培養(yǎng)基含有麩皮3-5wt%、尿素l-3wt%、硝酸銨l-3wt%、磷酸二氫鉀l-3wt%、碳酸鈣 l-3wt%，其余組分為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的綠色木霉為綠色木霉CGMCC 3. 3744，所述的黑曲霉為黑曲霉CGMCC 3.3150。
9.權(quán)利要求1 8任一項所述的制備方法制備的纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復(fù)合酶。
10.權(quán)利要求9所述的纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復(fù)合酶在纖維素類原料預(yù)處理中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶復(fù)合酶及其制備方法。本發(fā)明提供的纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復(fù)合酶的制備方法，其為將制備的綠色木霉液體種子和黑曲霉液體種子先后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復(fù)合酶。該方法生產(chǎn)的液體復(fù)合酶活力高、組分配比合理、生產(chǎn)周期短、成本低、質(zhì)量穩(wěn)定。
文檔編號C12R1/885GK102392004SQ201110332000
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者戴嘉, 李榮杰 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司