專利名稱：一種分離培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種快速分離嗅鞘細(xì)胞的試劑盒、該試劑盒的應(yīng)用以及一種快速分離嗅鞘細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
嗅鞘細(xì)胞是目前所發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以再生的細(xì)胞之。其特點(diǎn)為終身具有神經(jīng)再生功能，還能夠釋放多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)粘附分子，被認(rèn)為是髓鞘化能力最強(qiáng)的膠質(zhì)細(xì)胞，正在逐步用于治療脊髓損傷。嗅鞘細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞、許旺細(xì)胞在表現(xiàn)型上有共同點(diǎn)，它們都能促進(jìn)軸突的再生，主要區(qū)別在于嗅鞘細(xì)胞不但存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于外周神經(jīng)中。嗅黏膜中的神經(jīng)元是唯一出生后才生長(zhǎng)并在成年時(shí)繼續(xù)分化的神經(jīng)元，壽命為4 12周，隨著新細(xì)胞的生長(zhǎng)，又建立了新的神經(jīng)支配關(guān)系。嗅鞘細(xì)胞存在于嗅神經(jīng)及嗅球的神經(jīng)層上，沿嗅神經(jīng)的全長(zhǎng)，從周圍神經(jīng)系統(tǒng)到中樞神經(jīng)分布。嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells, OECs)是在功能上介于施旺細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之間的一種特殊的膠質(zhì)細(xì)胞，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、抑制膠質(zhì)增生、瘢痕形成、成鞘作用等。嗅鞘細(xì)胞為軸突生長(zhǎng)提供了適宜的微環(huán)境，具有較強(qiáng)的遷移特性，使其成為促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的理想候選細(xì)胞之一。目前，對(duì)于嗅鞘細(xì)胞的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)階段用于嗅鞘細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法主要有機(jī)械方法解離嗅球，但經(jīng)過(guò)這種機(jī)械分散方法，細(xì)胞破碎較多，細(xì)胞活性差。在體外神經(jīng)元培養(yǎng)過(guò)程中采用胰蛋白酶生化消化和機(jī)械消化，并在顯微鏡下密切觀察，可以避免消化不充分和過(guò)度，使細(xì)胞活性提高。純化細(xì)胞的方法較多，一般有差速貼壁、化學(xué)藥物法、梯度離心法、免疫親和吸附法。后者純化效果最好，其純度可達(dá)99 %以上，是目前普 遍采用的方法之一。但是此法步驟較為繁瑣，費(fèi)用高，同時(shí)細(xì)胞經(jīng)過(guò)反復(fù)清洗，活性下降，于是給下一步培養(yǎng)帶來(lái)了一定的困難。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決嗅鞘細(xì)胞分離的純度、數(shù)量和時(shí)間的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種快速分離嗅鞘細(xì)胞的試劑盒。利用此試劑盒，能有效純化哺乳動(dòng)物嗅鞘細(xì)胞，快速獲得大量嗅鞘細(xì)胞，以利于下一步的實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的快速分離嗅鞘細(xì)胞的試劑盒包括洗滌液，細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞消化液，其中:所述洗滌液:本發(fā)明所述的洗滌液為ACSF(人工腦脊液)所述培養(yǎng)液:本發(fā)明所述的培養(yǎng)基A為DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基；本發(fā)明所述的培養(yǎng)液B為胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)所述消化液:本發(fā)明所述消化液為89%胰酶，10% DNA酶，I %肝素。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述嗅鞘細(xì)胞源自哺乳動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述洗滌液、培養(yǎng)液以及細(xì)胞消化液是無(wú)菌的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述洗滌液、培養(yǎng)液以及細(xì)胞消化液為獨(dú)立包裝。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，用于嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液是將細(xì)胞培養(yǎng)液按照9:I比例配置的細(xì)胞培養(yǎng)混合液。本發(fā)明的另一目的在于提供了一種快速分離嗅鞘細(xì)胞的方法。該方法將嗅球用洗滌液ACSF洗滌，經(jīng)胰酶消化后，得到嗅球細(xì)胞，經(jīng)原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)最終獲得分離的嗅鞘細(xì)胞。


圖1是原代嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)7天后的細(xì)胞觀察2是原代嗅鞘細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)觀察圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述快速分離嗅鞘細(xì)胞的方法可通過(guò)下述步驟實(shí)現(xiàn):由于主要影響純化的是成纖維 細(xì)胞，因此在培養(yǎng)24-48小時(shí)后加入阿糖胞苷，可以優(yōu)先抑制和殺滅進(jìn)入分裂期的成纖維細(xì)胞，但OECs也受到一定程度的抑制。使用BPE (牛腦垂體抽提物)來(lái)促進(jìn)OECs增殖，第8-16d可得到生長(zhǎng)狀態(tài)良好的OECs，純度可達(dá)80%。OECs細(xì)胞表面具有特異性的低親和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(L-NGFR)，可以特異性的與LNGFR抗體結(jié)合，為免疫純化提供了基礎(chǔ)，免疫純化后純度可以提高到98%。本發(fā)明的培養(yǎng)方法采用培養(yǎng)24小時(shí)首次半量換液方法，利用在原代培養(yǎng)24_48h后加入阿糖胞苷，可以有效抑制和殺滅進(jìn)入分裂期的成纖維細(xì)胞，但OECs也受到一定程度的抑制。使用BPE(牛腦垂體抽提物)來(lái)促進(jìn)OECs增殖，從而確保了細(xì)胞培養(yǎng)和傳代過(guò)程中的生長(zhǎng)和純化效果。實(shí)施例2根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述快速分離嗅鞘細(xì)胞的方法可包括:嗅鞘細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)利用洗滌液將細(xì)胞清洗,消化液消化后,收集細(xì)胞、離心、棄去上懸液,用細(xì)胞培養(yǎng)混合液充分吹打成單細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)。接種24小時(shí)后，半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)混合液。7天即可完成原代培養(yǎng)。嗅鞘細(xì)胞的傳代培養(yǎng)棄除原代培養(yǎng)的培養(yǎng)混合液，用洗滌液充分清洗細(xì)胞，去除懸浮在貼壁細(xì)胞表面的圓形細(xì)胞，加入細(xì)胞消化液，待細(xì)胞回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，加入細(xì)胞培養(yǎng)混合液，充分吹打、離心，棄上清液，然后接種、培養(yǎng)。嗅鞘細(xì)胞的收獲細(xì)胞密度達(dá)90%，棄去原培養(yǎng)液，加入細(xì)胞消化液進(jìn)行消化，收獲培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種分離培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞的試劑盒，包括: 洗滌液:本發(fā)明所述的洗滌液為ACSF(人丁腦脊液)，4°C保存。
培養(yǎng)液A:本發(fā)明所述的培養(yǎng)基A為DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
培養(yǎng)液B:本發(fā)明所述的培養(yǎng)液B為胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)。
細(xì)胞消化液:本發(fā)明所述消化液為89%胰酶，10% DNA酶，1%肝素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述洗滌液、培養(yǎng)液以及細(xì)胞消化液是無(wú)菌的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述洗滌液、培養(yǎng)液以及細(xì)胞消化液是獨(dú)立包裝。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述嗅鞘細(xì)胞源自于哺乳動(dòng)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述培養(yǎng)液的技術(shù)指標(biāo)如下:滲透壓(240-340m0sm/kg)、ρΗ(7.0-7.5)、總蛋白含量(3-3.5g/100ml)、血紅蛋白((20mg/100ml)
6.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述培養(yǎng)液為培養(yǎng)液A與培養(yǎng)液B的混合培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的試劑盒，其特征在于:所述磷酸鹽緩沖液為0.01M，所述細(xì)胞消化液以質(zhì)量/體積百分比濃度0.25%的胰蛋白酶液為主，內(nèi)含DNA酶和肝素。
8.一種分離嗅球細(xì)胞的方法，包括: 1)利用傳統(tǒng)分離法獲得嗅鞘細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)混合液培養(yǎng)獲得原代細(xì)胞的嗅球細(xì)胞。
2)利用洗滌液沖洗步驟I)獲得的嗅球細(xì)胞，隨后用細(xì)胞消化液消化，經(jīng)傳代培養(yǎng)獲得傳代培養(yǎng)的嗅球細(xì)胞； 3)利用細(xì)胞消化液對(duì)步驟2)獲得的傳代培養(yǎng)的嗅球細(xì)胞進(jìn)行消化，獲得分離的嗅球細(xì)胞，其中洗滌液為ACSF (人工腦脊液)；細(xì)胞培養(yǎng)混合液為按照9: I體積比來(lái)配制的培養(yǎng)液A與培養(yǎng)液B，其中培養(yǎng)液A為DMEM，B為胎牛血清；以及細(xì)胞消化液(89%胰酶，10%DNA酶，I %肝素)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在步驟I)中，采用24小時(shí)半量更換細(xì)胞培養(yǎng)混合液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在步驟2)中，傳代培養(yǎng)使細(xì)胞密度達(dá)到90%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速分離嗅鞘細(xì)胞的試劑盒及方法。該試劑盒包括洗滌液、細(xì)胞培養(yǎng)液A、細(xì)胞培養(yǎng)液B和細(xì)胞消化液。其中洗滌液為人工腦脊液，細(xì)胞培養(yǎng)液A為DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)液B為胎牛血清，細(xì)胞消化液為89％胰酶、10％DNA酶和1％肝素。與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法相比，采用此試劑盒，培養(yǎng)24小時(shí)后，通過(guò)半量換液方式進(jìn)行培養(yǎng)和純化，所得到的細(xì)胞純度更高，增殖更快，一般7天即可完成原代細(xì)胞培養(yǎng)。將原代細(xì)胞傳代，利用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，一般2-3天細(xì)胞密度即可達(dá)到90％，為使用嗅鞘細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究提供了豐富的細(xì)胞來(lái)源。
文檔編號(hào)C12N5/079GK103087988SQ20111033760
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者田杰 申請(qǐng)人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細(xì)胞科技有限公司