專利名稱：用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片，具體講是一種用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因
-H-· I I心片。
背景技術(shù)：
心房顫動(atrial fibrillation)簡稱“房顫”，它是一種常見的心律失常，常并發(fā)于風濕性心臟病、冠心病和先天性心臟病。房顫會促發(fā)心力衰竭或血流動力學(xué)障礙，誘發(fā)室速或室顫等致命性心律失常，導(dǎo)致血栓和栓塞事件，增加基礎(chǔ)心臟病的死亡率，使腦卒中發(fā)生的危險增加五倍、心力衰竭的危險提高四倍、死亡或癡呆的危險提高兩倍，房顫本身還可以引起心臟擴大。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的定義，房顫的癥狀表現(xiàn)為心肌喪失了正常有規(guī)律的舒縮活動，而代之以快速而不協(xié)調(diào)的微弱蠕動，致使心房失去正常的有效收縮，導(dǎo)致心房不規(guī)則的、雜亂無章的電活動，房性心動過速，心電圖上P波消失，代之以小f波，頻率約350-600 次/分鐘，即基線上形狀、大小、方向和時程不一的顫動波，在沒有高度或完全性房室傳導(dǎo)阻滯情況下心室率完全不等。按時間劃分，房顫分為急性房顫和慢性房顫，慢性房顫又分為陣發(fā)性、持續(xù)性和永久性房顫，陣發(fā)性、可自行終止的房顫為陣發(fā)性房顫，房顫持續(xù)三周以上、發(fā)作后不能自行終止、但經(jīng)治療后能終止的房顫為持續(xù)性房顫，經(jīng)治療后也不能終止的房顫為永久性房顫。按是否與其他心血管疾病并發(fā)來劃分，房顫可分為孤立性房顫和典型性房顫，孤立性房顫指無明確的心臟病變基礎(chǔ)的心房顫動，即不伴有相關(guān)心血管疾病的房顫；典型性房顫指伴有相關(guān)心血管疾病的房顫，與房顫有關(guān)的心血管基礎(chǔ)疾病包括瓣膜性心臟病(大多為二尖瓣性)、冠心病、高血壓、缺血性心臟病和充血性心衰等。房顫已成為全世界范圍內(nèi)一種新的流行病，據(jù)統(tǒng)計，美國房顫發(fā)病率為 0.4% -0. 9%，隨著年齡的增長，發(fā)病率急劇增高，在65歲以上者則高達3% -5%，而歐洲的房顫發(fā)病率與美國相仿，亞洲的房顫發(fā)病率與前二者相比略低。盡管如此，中國也已有1000 萬房顫患者，而且其發(fā)病率快速上升，并有向年輕人轉(zhuǎn)移的趨勢。房顫嚴重地危害著人類的健康，也給社會帶來了相當?shù)慕?jīng)濟負擔。因此預(yù)防、診斷和治療房顫成為需要迫切解決的重要醫(yī)學(xué)問題。房顫治療的目的是恢復(fù)心臟正常的節(jié)律性搏動，或控制合理的心室速率，防止腦卒中等嚴重并發(fā)癥的出現(xiàn)寸。近20年來，許多學(xué)者嘗試通過外科手術(shù)治愈房顫，取得了很大進展，其中，以迷宮手術(shù)效果最好。1987年美國心臟醫(yī)生發(fā)明迷宮手術(shù)，按精心設(shè)計的線路在右心房、房間隔及左心房分別沿環(huán)形線性切開多處，再縫合起來，形成一個狹窄而彎曲的心房組織通道，即人造一個迷宮，阻止折返，將引起房顫的異常傳導(dǎo)環(huán)路打斷，使房顫不能發(fā)生，卻能引導(dǎo)脈沖從竇房結(jié)傳到房室結(jié)，從而治愈房顫。隨著各種新技術(shù)的發(fā)展完善(例如根據(jù)迷宮手術(shù)原理，在心房中應(yīng)用射頻消融手術(shù)治療房顫)，迷宮手術(shù)不斷得到簡化和改進，其并發(fā)癥少，療效提高，迷宮手術(shù)治療房顫已成為療效比較確切和可靠的一種方法。盡管如此，隨訪的研究表明，迷宮手術(shù)治療后仍有約15%的病人容易復(fù)發(fā)。房顫的術(shù)后復(fù)發(fā)原因顯然是多方面的，如高血壓，糖尿病，心衰，心梗，肥胖和血管性疾病等。目前的研究無法對房顫的發(fā)生機制作清晰的病因?qū)W闡述，它是多種病因的綜合疾病，包括心血管疾病及其他風險因素。房顫與某些急性、暫時性原因有關(guān)，包括飲酒、外科手術(shù)、電擊、心肌炎、肺栓塞、其它肺臟病以及甲狀腺機能亢進，房顫也是心肌梗塞和心胸外科手術(shù)后較常見的早期并發(fā)癥。孤立性房顫沒有明顯結(jié)構(gòu)上的心臟疾病，年輕人也會患有孤立性房顫，孤立性房顫的患者與典型性房顫的年老患者相比，更可能突然性地發(fā)病，家族型聚集和早發(fā)病是孤立性房顫的突出特征，近30%的孤立性房顫家族淵源者有至少一個輕度患有此癥的親屬。典型性房顫的風險因素包括年老、肥胖、高血壓、心力衰竭、心臟瓣膜病、甲狀腺機能亢進和家族病，而且有親屬患有此癥的個體也具有更高的房顫患病風險。大量證據(jù)提示房顫病情的加重是心房內(nèi)不斷積累的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電生理重構(gòu)的結(jié)果，房顫一旦發(fā)生，左心房就按組織學(xué)重構(gòu)、電重構(gòu)規(guī)律發(fā)展下去，即便病因去除，房顫仍然會發(fā)生?？梢哉f它是致命性的，所以做好房顫的預(yù)防是很有必要的。最近的研究提供了遺傳性因素對房顫影響的有力證據(jù)，表明了房顫的發(fā)生和治療轉(zhuǎn)歸可能和患者自身的體質(zhì)即基因的關(guān)系可能更為密切。根據(jù)個體差異判斷迷宮手術(shù)治療房顫的療效、選擇合適的手術(shù)方案并有效地預(yù)防其復(fù)發(fā)，是房顫治療中待解決的重要問題。由于房顫的直接病因到現(xiàn)在仍未明了，迷宮手術(shù)后引起房顫復(fù)發(fā)的直接原因也不清楚，因此預(yù)防房顫復(fù)發(fā)存在一定困難，即人們無法知道術(shù)后哪方面的因素引起房顫的復(fù)發(fā)，也就無法防止其發(fā)生或阻斷其復(fù)發(fā)的某一環(huán)節(jié)。盡管如此，通過各種研究手段和臨床試驗，人們還是發(fā)現(xiàn)一些與迷宮手術(shù)后房顫預(yù)后相關(guān)的遺傳學(xué)因子。人們探索了房顫的致病基因和與房顫顯著相關(guān)的SNP位點，但是以往的報道往往集中在一個或少數(shù)幾個基因及SNP位點，而房顫的術(shù)后復(fù)發(fā)是由多因素調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程， 既往的研究難以反映復(fù)雜的復(fù)發(fā)過程的整體本質(zhì)。如果同時對多種易感基因及多個與房顫顯著相關(guān)的SNP位點進行分析，則有助于闡明各種易感基因之間的相互作用機制及其對房顫術(shù)后復(fù)發(fā)的影響。目前尚無足夠特別、 敏感的針對亞洲人群的房顫復(fù)發(fā)預(yù)測指標和預(yù)測模型，國內(nèi)外也沒有對房顫術(shù)后復(fù)發(fā)的多基因及多個相關(guān)SNP位點預(yù)測芯片的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，此基因芯片可檢測多個與房顫顯著相關(guān)的SNP位點，迅速便捷地對普通人群進行篩查，準確率高，成本較低，可用于批量檢測，能充分滿足大規(guī)?；蚝Y選的要求。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，它包括針對 rs2200733 位點、rsl0033464 位點、rsl3376333 位點、rs6843082 位點、rsl7042171 位點、rs2106261位點和rs7193343位點而設(shè)計的寡核苷酸探針和能特異性擴增出包括上述SNP位點的DNA片段的特異性引物，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用信號物質(zhì)進行標記。
作為優(yōu)選，所述寡核苷酸探針具有SEQ ID NO. 1-N0. 56所示的核苷酸序列。作為優(yōu)選，所述特異性引物具有SEQ ID NO. 57-N0. 70所示的核苷酸序列。作為優(yōu)選，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用熒光素、同位素、生物素或地高辛進行標記。作為優(yōu)選，所述基因芯片還包括固相載體，所述固相載體為經(jīng)過表面化學(xué)基團修飾的玻璃基質(zhì)或尼龍膜，所述寡核苷酸探針的末端帶有修飾氨基，所述固相載體的化學(xué)基團可與寡核苷酸探針的修飾氨基共價結(jié)合。作為改進，所述基因芯片還包括一個陰性對照樣本和一個陽性對照樣本。作為改進，所述基因芯片還包括雜交盒和雜交液。作為進一步改進，所述基因芯片還包括DNA取樣試劑、PCR擴增試劑和PCR產(chǎn)物純化試劑。本發(fā)明的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其制備方法為(1)使用寡核苷酸合成儀制備所述寡核苷酸探針和特異性引物，將特異性引物的 5’端預(yù)先均用信號物質(zhì)進行標記；(2)使用基因芯片點樣儀將所述寡核苷酸探針點制在經(jīng)過醛基修飾的固相載體上，干燥后制得基因芯片。本發(fā)明的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其使用方法為(1)使用所述DNA取樣試劑提取患者DNA ；(2)使用所述特異性引物和所述PCR擴增試劑擴增包括目標SNP位點的DNA片段；(3)將同一樣本的各個PCR擴增產(chǎn)物混合，加入雜交液后與所述芯片雜交；(4)使用掃描儀掃描雜交信號。本發(fā)明選取了全基因組關(guān)聯(lián)研究(6WAS)與房顫顯著相關(guān)的7個SNP位點。染色體4q25基因座為與房顫緊密相關(guān)的一個基因座，rs2200733位點、 rsl003;3464位點、rs6843082位點和rsl7042171位點均在此基因座內(nèi)。其中rs2200733位點、rsl0033464位點位于染色體4q25的一個單一的連鎖不平衡區(qū)域內(nèi)，在年輕患者和患有孤立性房顫的患者中，上述兩個SNP位點與房顫的相關(guān)性尤為顯著。該連鎖不平衡區(qū)域不存在已知基因，卻包含一個剪接的表達序列標簽(DA725631) 和兩個獨立外顯子表達序列標簽(DB324364和AF017091)。對取自各種組織的互補DNA文庫進行逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的聚合酶鏈式反應(yīng)，并沒有檢測到這些表達序列標簽(EST)的表達。 位于該連鎖不平衡區(qū)域毗鄰的上游的PITX2基因是與這兩個風險突變SNP位點距離最近的基因。PITX2基因通過介導(dǎo)心臟不對稱形態(tài)的發(fā)生而在心臟發(fā)育中起重要作用，它編碼的蛋白為成對型同源區(qū)轉(zhuǎn)錄因子 2 ( S卩 paired-liked homeodomain transcription factor 2)，可調(diào)節(jié)心肌細胞、心臟神經(jīng)胚細胞和咽弓間充質(zhì)細胞，其基因突變可引起心臟左右信號傳導(dǎo)改變。rs6843082位點與房顫最為緊密相關(guān)，而rs 17042171位點距離轉(zhuǎn)錄因子基因 PITX2約1501Λ端粒，也與房顫具有顯著相關(guān)性。rsl3376333位點位于染色體lq21上，它與孤立性房顫的相關(guān)性尤為顯著，與典型性房顫也相關(guān)，雖然相關(guān)性不夠緊密。rsl3376333位于KCNN3基因第一和第二外顯子之間的內(nèi)含子上，它沒有與KCNN3基因上任何已知的普通非同義SNP位點連鎖不平衡。KCNN3基因編碼了參與心房復(fù)極化的鉀通道蛋白，此蛋白屬于弱傳導(dǎo)鈣激活鉀通道蛋白家族，此蛋白最大的特點是影響可興奮細胞的放電類型，例如在一些神經(jīng)元中影響相位型放電，而在另一些神經(jīng)元影響連續(xù)型放電，因而此蛋白在許多易興奮組織中被表達，包括大腦和心臟。rs2106261位點和rs7193343位點均位于染色體16q22上的ZFHX3基因(鋅指同源框基因，也稱AT模式綁定銀子，即ATBF1)內(nèi)，這兩個位點均為ZFHX3基因的內(nèi)含子SNP 位點，與孤立性房顫和典型性房顫均緊密相關(guān)。ZFHX3基因編碼一種名為Atbfl的轉(zhuǎn)錄因子，此蛋白是最大的已知DNA結(jié)合蛋白，與一些組織的生長和分化的調(diào)節(jié)有關(guān)，具體來說是調(diào)節(jié)肌源性和神經(jīng)性分化。ZFHX3在許多組織中被表達，例如心臟、肝臟、肺、腎臟、腦下垂體和大腦。Atbfl為POU類1同源框I(POUlFl)基因早期轉(zhuǎn)錄激活的所需蛋白，POUlFl基因是調(diào)節(jié)哺乳動物腦垂體細胞分化和激素表達的POU-同源域轉(zhuǎn)錄因子家族的一員。POUlFl 與PITX2基因相互作用，促進DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性，這兩個基因之間的相互作用具有重要意義，因為之前已確定的染色體4q25上的房顫突變SNP位點位于與PITX2毗鄰的位置，而 PITX2基因?qū)π呐K發(fā)育有關(guān)鍵作用。基因多態(tài)性是指人群中不同個體之間基因核苷酸序列的差異性，而SNP(單核苷酸多態(tài)性)則是指基因核苷酸序列中某個位點上單個核苷酸的變異性，如果一個群體中同一位點存在兩種以上等位基因，并且最低基因頻率彡1%，即認為具有SNP。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均密度約為l/1000bp，其總數(shù)可達300萬個甚至更多。SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，因此SNP可作為第三代的遺傳標記。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入(insertion)或缺失 (deletion)所致。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在編碼序列內(nèi)， 也有可能在非編碼序列上。SNP是基因組DNA序列變異的主要形式，是決定人類疾病(尤其是多基因疾病)易感性和藥物反應(yīng)性個體差異的核心信息。相當一部分SNP的頻率在不同種族、人群中有著顯著差異。SNP本身只輕度或不改變通道蛋白的功能，通常不直接致病，但改變個體對疾病的易感性。SNP可影響其他突變基因的致病性，同一基因突變，在不同多態(tài)性背景下致病性可能不同。需要注意的是，SNP的生物學(xué)作用可能并不被發(fā)現(xiàn)，尤其在多基因疾病中，其他的很多附加因素共同作用影響了疾病的表現(xiàn)型，從而隱藏了多態(tài)性的作用。另外，遺傳異質(zhì)性的問題亦不容忽視。同一個基因的同一種多態(tài)性在不同種族或不同數(shù)量人群中，得出的結(jié)論可能不同甚至完全相反。本發(fā)明所選取的7個SNP位點均為針對亞洲人種的房顫顯著相關(guān)SNP位點。本發(fā)明的技術(shù)方案中，DNA提取、PCR擴增、PCR產(chǎn)物純化和基因芯片等均為常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)。基因芯片技術(shù)是近年迅速發(fā)展起來的一項前沿分子生物學(xué)技術(shù)，它又被稱為DNA 芯片或DNA微陣列，是生物芯片的一種。它通過與計算機圖像分析的有機結(jié)合，在一次實驗中可對樣品中靶分子的質(zhì)量或數(shù)量進行快速、準確、高效的檢測。具體來說，基因芯片是指將大量人工合成的或應(yīng)用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)獲得的核酸片段作為探針，所述探針包含特定的核苷酸序列，采用微量點樣等方法，使所述探針按照特定的排列方式和特定的手段固化于支持物(如玻片、硅片、塑料片、聚丙烯酰胺凝膠篇或尼龍膜等載體)的表面，形成密集二維分子排列。然后與已標記的待測生物樣品中靶分子進行雜交，通過特定的掃描儀如光學(xué)掃描儀、激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯(lián)攝影相機(CCD)對雜交信號進行快速、并行、高效地分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量和質(zhì)量。PCR (即聚合酶鏈式反應(yīng)，Polymerase Chain Reaction)是最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一，是由體外酶催化擴增特異DNA的一種方法。典型的PCR —般包括高溫使模板DNA 變性、引物和模板退火、引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成的循環(huán)，經(jīng)過上述多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速大量擴增。本發(fā)明的寡核苷酸探針根據(jù)房顫術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)基因的各SNP位點和側(cè)翼序列設(shè)計，針對每個SNP位點，正反2條DNA鏈共設(shè)計8條探針；然后再根據(jù)SNP位點兩端的更遠側(cè)翼序列設(shè)計用于PCR擴增的上下游引物，對每對引物之一的5’端預(yù)先進行信號標記，所述標記優(yōu)選為熒光標記、同位素標記、生物素標記或地高辛標記。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本領(lǐng)域常規(guī)方法進行探針合成，并進行氨基修飾或信號標記，然后提取待檢測樣品的DNA，用針對每個待檢測SNP位點設(shè)計的上下游引物對進行 PCR擴增，使得微量待檢測樣品的DNA大量擴增，并在擴增過程中引入熒光標記等信號標記。擴增后含有信號標記物的待測樣品核酸靶分子通過堿基互補配對原則與芯片上的寡核苷酸探針雜交，此后進行芯片掃描，獲得每個位點的信號，對雜交信號強弱和有無進行分析，即可判斷樣品中靶基因的數(shù)量和性質(zhì)。本發(fā)明采用PCR擴增和基因芯片相結(jié)合的技術(shù)， 使得檢測的靈敏度高、通量大。上述DNA提取試劑、PCR擴增試劑、PCR產(chǎn)物純化試劑、雜交試劑均可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的在這些操作過程中需使用的各種試劑，這些試劑必要時可以包括在基因芯片試劑中，也可以將其配方列在基因芯片試劑的說明書中，由使用者按照說明書中的指示自行配制。因此，本發(fā)明的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫的基因芯片，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(1)設(shè)計了針對亞洲人群足夠特別、敏感的房顫復(fù)發(fā)預(yù)測指標和預(yù)測模型，確立 SNP模式和房顫術(shù)后復(fù)發(fā)的對應(yīng)關(guān)系；(2)針對房顫術(shù)后復(fù)發(fā)的不同途徑檢測多個相關(guān)的基因及其多態(tài)性位點，能更準確全面地預(yù)測受檢者不同患病途徑的患病風險，可迅速便捷地對普通人群進行篩查，根據(jù)個體差異判斷迷宮手術(shù)治療房顫的療效、選擇合適的手術(shù)方案并有效地預(yù)防其復(fù)發(fā)；(3)準確率高，成本較低，可用于批量檢測，能充分滿足大規(guī)?；蚝Y選的要求；(4)芯片制作的步驟簡潔方便，檢測靈敏度高，通量大。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于以下實施例，相同領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明的技術(shù)方案框架內(nèi)提出其他的實施例，但這些實施例均包括在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
下列實施例中未注明具體條件的實施放大，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。本發(fā)明的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，它包括針對rs2200733位點、rsl0033464 位點、rsl3376333 位點、rs6843082 位點、rsl7042171 位點、rs2106261 位點和rs7193343位點而設(shè)計的寡核苷酸探針和能特異性擴增出包括上述SNP位點的DNA片段的特異性引物，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用信號物質(zhì)進行標記。作為優(yōu)選，所述寡核苷酸探針具有SEQ ID NO. 1-N0. 56所示的核苷酸序列。作為優(yōu)選，所述特異性引物具有SEQ ID NO. 57-N0. 70所示的核苷酸序列。作為優(yōu)選，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用熒光素、同位素、生物素或地高辛進行標記。作為優(yōu)選，所述基因芯片還包括固相載體，所述固相載體為經(jīng)過表面化學(xué)基團修飾的玻璃基質(zhì)或尼龍膜，所述寡核苷酸探針的末端帶有修飾氨基，所述固相載體的化學(xué)基團可與寡核苷酸探針的修飾氨基共價結(jié)合。作為改進，所述基因芯片還包括一個陰性對照樣本和一個陽性對照樣本。作為改進，所述基因芯片還包括雜交盒和雜交液。作為進一步改進，所述基因芯片還包括DNA取樣試劑、PCR擴增試劑和PCR產(chǎn)物純化試劑。本發(fā)明的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其制備方法為(1)使用寡核苷酸合成儀制備所述寡核苷酸探針和特異性引物，將特異性引物的 5’端預(yù)先均用信號物質(zhì)進行標記；(2)使用基因芯片點樣儀將所述寡核苷酸探針點制在經(jīng)過醛基修飾的固相載體上，干燥后制得基因芯片。本發(fā)明的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其使用方法為(1)使用所述DNA取樣試劑提取患者DNA ；(2)使用所述特異性引物和所述PCR擴增試劑擴增包括目標SNP位點的DNA片段；(3)將同一樣本的各個PCR擴增產(chǎn)物混合，加入雜交液后與所述芯片雜交；(4)使用掃描儀掃描雜交信號。本實施例選取了全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)與房顫顯著相關(guān)的7個SNP位點 rs2200733 位點、rsl0033464 位點、rsl3376333 位點、rs6843082 位點、rsl7042171 位點、 rs2106261位點和rs7193343位點，根據(jù)這7個SNP位點及其側(cè)翼序列設(shè)計寡核苷酸探針和對應(yīng)的特異性引物，針對每個SNP位點設(shè)計4對寡核苷酸探針，即正反兩條DNA鏈共設(shè)計 8條寡核苷酸探針，所述的7對特異性引物可分別擴增出包括上述7個SNP位點在內(nèi)的DNA 片段。具體來說，基因芯片的制備方法可按照如下步驟進行原料準備——醛基芯片(高分子三維基片D，廠商Capitalbio，規(guī)格為75. 5*25. 2*1. 0)基因芯片點樣液(Capitalbio，5ml)或2*Spoting Solution 等1、寡核苷酸探針序列設(shè)計如序列表所述，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法合成5’ 端氨基標記探針，所述寡核苷酸探針與各SNP位點的對應(yīng)關(guān)系如下所示
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其特征在于它包括針對 rs2200733 位點、rsl0033464 位點、rsl3376333 位點、rs6843082 位點、rsl7042171 位點、 rs2106261位點和rs7193343位點而設(shè)計的寡核苷酸探針和能特異性擴增出包括上述SNP 位點的DNA片段的特異性引物，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用信號物質(zhì)進行標記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其特征在于 所述寡核苷酸探針具有SEQ ID NO. 1-N0. 56所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，奇特征在于 所述特異性引物具有SEQ ID N0.57-N0.70所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其特征在于所述特異性引物的5’端預(yù)先均用熒光素、同位素、生物素或地高辛進行標記。
5.根據(jù)1-3任一項所述的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其特征在于 所述基因芯片還包括固相載體，所述固相載體為經(jīng)過表面化學(xué)基團修飾的玻璃基質(zhì)或尼龍膜，所述寡核苷酸探針的末端帶有修飾氨基，所述固相載體上的化學(xué)基團可與寡核苷酸探針的修飾氨基共價結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其特征在于所述基因芯片還包括一個陰性對照樣本和一個陽性對照樣本。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其特征在于所述基因芯片還包括雜交盒和雜交液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，其特征在于 所述基因芯片還包括DNA取樣試劑、PCR擴增試劑和PCR產(chǎn)物純化試劑。
9.一種權(quán)利要求1所述的基因芯片的制備方法，其特征在于它采用如下步驟——(1)使用寡核苷酸合成儀制備所述寡核苷酸探針和特異性引物，將特異性引物的5’端預(yù)先均用信號物質(zhì)進行標記；(2)使用基因芯片點樣儀將所述寡核苷酸探針點制在經(jīng)過醛基修飾的固相載體上，干燥后制得基因芯片。
10.一種權(quán)利要求8所述的基因芯片的使用方法，其特征在于所述方法為(1)使用所述DNA取樣試劑提取患者DNA ； (2)使用所述特異性引物和所述PCR擴增試劑擴增包括目標 SNP位點的DNA片段；C3)將同一樣本的各個PCR擴增產(chǎn)物混合，加入雜交液后與所述芯片雜交；(4)使用掃描儀掃描雜交信號。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于預(yù)測迷宮手術(shù)治療房顫療效的基因芯片，它包括針對rs2200733位點、rs10033464位點、rs13376333位點、rs6843082位點、rs17042171位點、rs2106261位點和rs7193343位點而設(shè)計的寡核苷酸探針和能特異性擴增出包括上述SNP位點的DNA片段的特異性引物，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用信號物質(zhì)進行標記。本發(fā)明的基因芯片可檢測多個與房顫顯著相關(guān)的SNP位點，迅速便捷地對普通人群進行篩查，準確率高，成本較低，可用于批量檢測，能充分滿足大規(guī)?；蚝Y選的要求。
文檔編號C12Q1/68GK102363806SQ20111033826
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者孫早, 王海勇, 符偉紅, 郭興中, 金濤, 陳艷麗 申請人:杭州博泰基因技術(shù)有限公司