專利名稱：微生物膠發(fā)酵液菌膠分離的一種方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域中細(xì)菌發(fā)酵液預(yù)處理的改良方法，具體涉及細(xì)菌代謝產(chǎn)物膠與細(xì)胞分離的方法及裝置。
背景技術(shù)：
微生物膠也稱微生物代謝膠，是指微生物在生長代謝過程中合成的一種生物聚合物，其組成通常為雜多糖。這種代謝產(chǎn)物膠粘附在微生物細(xì)胞表面或以不定形粘液狀分泌到培養(yǎng)液中，對微生物起到保護(hù)作用。微生物產(chǎn)生的聚合物除了對其自身的生物學(xué)意義之夕卜，由于它具有安全無毒、理化性質(zhì)獨(dú)特、生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)和地理環(huán)境條件的限制，具有較強(qiáng)的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景。一些生物聚合物已經(jīng)成為重要的生物技術(shù)產(chǎn)品，例如黃原膠、結(jié)冷膠、沃侖膠等已作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑和膠凝劑，廣泛應(yīng)用于石油、化工、制藥和食品等多個領(lǐng)域。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，微生物合成代謝膠的分子機(jī)理得到了充分認(rèn)識，許多代謝膠的合成基因簇已解析，越來越多的研究者嘗試?yán)没蚬こ痰姆椒ㄌ岣呶⑸锬z產(chǎn)量，或者控制膠的分子組成從而提高微生物膠的性能。但微生物膠合成菌的基因工程改造存在轉(zhuǎn)基因效率低的問題，其主要原因是細(xì)胞表面被代謝膠包裹從而阻礙外源DNA的進(jìn)入。在微生物膠發(fā)酵液中，由于產(chǎn)物膠的分子量大，發(fā)酵液粘度高，微生物細(xì)胞會聚集形成含有幾百至幾萬個細(xì)胞的巨大片層，而且產(chǎn)物膠與細(xì)胞緊密結(jié)合，用稀釋和離心的方法無法脫除細(xì)胞表面的代謝膠，酸水解或高溫加熱的方法雖然能使菌膠分離，但同時破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。為了提高基因工程操作中轉(zhuǎn)基因的效率，需要一種高效易行的方法，可脫除微生物膠發(fā)酵培養(yǎng)過程中緊密包裹在細(xì)胞表面的代謝膠，進(jìn)而獲得一種便于外源DNA進(jìn)入的培養(yǎng)狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在不影響代謝膠合成菌存活的前提下，實(shí)現(xiàn)菌膠分離的方法和裝置，適用于黃原膠、結(jié)冷膠、溫輪膠和鞘氨醇膠Ss等微生物膠發(fā)酵液中細(xì)胞與細(xì)菌代謝膠的分離。微生物膠降解菌的富集馴化方法。降解菌馴化培養(yǎng)基A (g/L):微生物膠2.0,葡萄糖5.0,磷酸氫二銨1.0,酵母粉0.5。降解菌馴化培養(yǎng)基B (g/L):微生物膠5.0，葡萄糖1.0，磷酸氫二銨1.0，酵母粉
0.5。降解菌馴化培養(yǎng)基C (g/L):微生物膠10.0，磷酸氫二銨1.0，酵母粉0.5。取好氧活性污泥法城市污水處理廠的曝氣池污泥，靜置30min后，去掉上層清液，使污泥的揮發(fā)性懸浮固體(MLVSS)達(dá)5000mg/L以上，將此污泥樣品按10%接種量接入馴化培養(yǎng)基A中，37°C搖床培養(yǎng)7 12天，至培養(yǎng)液的粘度< 50mpa.s將此培養(yǎng)液接種于馴化培養(yǎng)基B，相同條件下培養(yǎng)至粘度< 30mpa.s ;然后轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基C中，并反復(fù)傳代，直至富集到的降解菌能在3天內(nèi)將I %的微生物膠溶解水化至粘度< IOmpa.S。本發(fā)明所述微生物膠發(fā)酵液的菌膠分離反應(yīng)器。分離反應(yīng)器由微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐和降解液培養(yǎng)罐兩部分組成，整個反應(yīng)器置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。降解液培養(yǎng)罐由磁力攪拌子實(shí)現(xiàn)溶液的均勻混合，在罐底部的空氣分布器通過連接管與設(shè)于降解液培養(yǎng)罐外部的轉(zhuǎn)子流量計和空氣壓縮機(jī)連接，曝氣量由轉(zhuǎn)子流量計控制；在罐頂部設(shè)有進(jìn)料管和排氣管，罐壁上設(shè)有I個補(bǔ)料口，通過補(bǔ)料管向罐內(nèi)流加微生物膠溶液，流加速度由蠕動泵控制。微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐通過磁力攪拌實(shí)現(xiàn)溶液混合，在罐底部的空氣分布器通過連接管先與一個0.22 μ m規(guī)格的的空氣過濾器連接，然后接轉(zhuǎn)子流量計和空氣壓縮機(jī)；在罐頂部設(shè)有進(jìn)料管和排氣管，罐壁上設(shè)有I個取樣口，取樣管一端置于液面下，一端延伸至罐外。微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐和降解液培養(yǎng)罐用0.22 μ m規(guī)格的微孔濾膜分隔，連接后用密封條和固定螺栓進(jìn)行密封固定。本發(fā)明所述微生物膠發(fā)酵液的菌膠分離方法。安裝完成整套菌膠分離反應(yīng)器后，通過進(jìn)料口向裝置中加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，裝料系數(shù)為50%，121°C 30min滅菌后，自然冷卻至培養(yǎng)溫度；向微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐中接入微生物膠合成菌，接種量為2%，攪拌曝氣培養(yǎng)；向降解液培養(yǎng)罐中接入馴化成功的降解菌群，接種量為10 %，然后通過蠕動泵向降解液培養(yǎng)罐中流加微生物膠液，誘導(dǎo)產(chǎn)生代謝膠水解酶；水解酶通過兩個培養(yǎng)裝置間的濾膜，進(jìn)入微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐，并降解脫除微生物膠合成菌表面的膠層；而降解菌細(xì)胞被濾膜阻擋無法進(jìn)入另一側(cè)的培養(yǎng)裝置，因此不會污染微生物膠合成菌。分別控制上述2個培養(yǎng)裝置的曝氣量，以及微生物膠液的流加方式，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中菌膠的有效分 離。本發(fā)明所述菌膠分離效果的測定方法。在分離裝置運(yùn)行過程中，通過微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐的取樣管定時取樣，結(jié)晶紫染色后，鏡檢觀察微生物膠發(fā)酵液中細(xì)胞表面的膠層是否完全消失。同時向微生物膠發(fā)酵液中加入提取劑，觀察是否有微生物膠沉淀析出。


圖1是微生物膠發(fā)酵液的菌膠分離反應(yīng)器。在圖1中，I為空氣壓縮機(jī)，2為轉(zhuǎn)子流量計，3為取樣口，4為空氣過濾器，5為排氣管，6為進(jìn)料口，7為磁力攪拌轉(zhuǎn)子，8為空氣分布器，9為密封條，10為過濾膜，11為固定螺栓，12為補(bǔ)料口。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 本發(fā)明提供的微生物膠樣品的制備。
取一定量的黃原膠、結(jié)冷膠、溫輪膠和鞘氨醇膠Ss粉末，加入水使膠溶液達(dá)到設(shè)定濃度，充分?jǐn)嚢枋怪稚⒕鶆颍?°C溶脹過夜，恢復(fù)至室溫待用。
實(shí)施例2本發(fā)明提供的微生物膠降解菌馴化培養(yǎng)基的配制。按實(shí)施例1的方法配制0.4%、1.0%、2.0%的微生物膠溶液，充分溶脹后，按照培養(yǎng)基配方將葡萄糖、磷酸氫二銨和酵母粉溶解于相同體積的水中，兩者混合并攪拌均勻，無需滅菌，即可用作馴化培養(yǎng)基。實(shí)施例3本發(fā)明提供黃原膠發(fā)酵液的菌膠分離方法。 通過進(jìn)料口向微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐中加入培養(yǎng)基，其組成為(g/L):可溶性淀粉20.0，蛋白胨2.0，牛肉粉1.0，酵母粉1.0 ;向降解液培養(yǎng)罐中加入的培養(yǎng)基組分為(g/L):蛋白胨2.0，牛肉粉1.0，酵母粉1.0。分別接種后，一次性向降解液培養(yǎng)罐中流加0.4%的黃原膠溶液，使降解液培養(yǎng)罐的裝料系數(shù)達(dá)到70% ;控制黃原膠發(fā)酵培養(yǎng)的通氣量為
0.3vvm,降解液培養(yǎng)的通氣量為0.6vvm ;30°C恒溫培養(yǎng)24h后，以0.lmL/min的流速向降解液培養(yǎng)罐中流加黃原膠溶液。培養(yǎng)36h后,每隔4h取樣一次,每次取樣體積為20mL,鏡檢觀察細(xì)菌細(xì)胞周圍膠層的脫除情況，加入3倍體積的90%乙醇溶液，應(yīng)無黃原膠沉淀現(xiàn)象；整個培養(yǎng)周期為52 60h。實(shí)施例4本發(fā)明提供結(jié)冷膠發(fā)酵液的菌膠分離方法。微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐中加入的培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖15.0，硝酸鈉3.0，磷酸氫二鉀0.5，酵母粉0.5 ;降解液培養(yǎng)罐中加入的培養(yǎng)基組分為(g/L):硝酸鈉3.0，磷酸氫二鉀0.5，酵母粉0.5。分別接種后，一次性向降解液培養(yǎng)罐中流加0.5%的結(jié)冷膠溶液，使降解液培養(yǎng)罐的裝料系數(shù)達(dá)到70%;控制結(jié)冷膠發(fā)酵培養(yǎng)的通氣量為0.4vvm,降解液培養(yǎng)的通氣量為0.5vvm ;30°C恒溫培養(yǎng)24h后，以0.lmL/min的流速向降解液培養(yǎng)罐中流加結(jié)冷膠溶液。培養(yǎng)24h后，每隔4h取樣一次，每次取樣體積為20mL，鏡檢觀察細(xì)菌細(xì)胞周圍膠層的脫除情況，加入3倍體積的90%乙醇溶液，應(yīng)無結(jié)冷膠沉淀現(xiàn)象；整個培養(yǎng)周期為48h左右。實(shí)施例5本發(fā)明提供溫輪膠發(fā)酵液的菌膠分離方法。微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐中的培養(yǎng)基組成為(g/L):蔗糖20.0，蛋白胨2.0，硫酸銨0.9，酵母粉0.2 ;降解液培養(yǎng)罐中的培養(yǎng)基組分為(g/L):蛋白胨2.0，硫酸銨0.9，酵母粉0.2。分別接種后，一次性向降解液培養(yǎng)罐中流加0.3%的溫輪膠溶液，使降解液培養(yǎng)罐的裝料系數(shù)達(dá)到70% ;控制溫輪膠發(fā)酵培養(yǎng)的通氣量為0.2vvm,降解液培養(yǎng)的通氣量為
0.6vvm ;30°C恒溫培養(yǎng)30h后，以0.lmL/min的流速向降解液培養(yǎng)罐中流加溫輪膠溶液。培養(yǎng)42h后，每隔4h取樣一次，每次取樣體積為20mL，鏡檢觀察細(xì)菌細(xì)胞周圍膠層的脫除情況，加入2.5倍體積的90%乙醇溶液，應(yīng)無溫輪膠沉淀現(xiàn)象；整個培養(yǎng)周期為60 72h。實(shí)施例6本發(fā)明提供鞘氨醇膠Ss發(fā)酵液的菌膠分離方法。微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐中的培養(yǎng)基組成為(g/L):糊精18.0，蛋白胨2.0，牛肉粉
0.5，酵母粉0.5 ;降解液培養(yǎng)罐中加入的培養(yǎng)基組分為(g/L):蛋白胨2.0，牛肉粉0.5，酵母粉0.5。分別接種后，一次性向降解液培養(yǎng)罐中流加0.5%的鞘氨醇膠Ss溶液，使降解液培養(yǎng)罐的裝料系數(shù)達(dá)到70%;控制鞘氨醇膠Ss發(fā)酵培養(yǎng)的通氣量為0.3vvm,降解液培養(yǎng)的通氣量為0.5vvm ;30°C恒溫培養(yǎng)24h后，以0.1mL/min的流速向降解液培養(yǎng)罐中流加鞘氨醇膠Ss溶液。培養(yǎng)24h后，每隔4h取樣一次，每次取樣體積為20mL，鏡檢觀察細(xì)菌細(xì)胞周圍膠層的脫除情況，加入2mo1/L的鹽酸溶液將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)至3.0，應(yīng)無鞘氨醇膠Ss沉淀現(xiàn)象；整個培養(yǎng)周期為48 56h。
權(quán)利要求
1.一種微生物膠發(fā)酵液的菌膠分離反應(yīng)器，適用于黃原膠、結(jié)冷膠、溫輪膠和鞘氨醇膠Ss，其特征在于包括微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐和降解液培養(yǎng)罐。
所述降解液培養(yǎng)罐由磁力攪拌子實(shí)現(xiàn)溶液的均勻混合，在罐底部的空氣分布器通過連接管與設(shè)于降解液培養(yǎng)罐外部的轉(zhuǎn)子流量計和空氣壓縮機(jī)連接，曝氣量由轉(zhuǎn)子流量計控制；罐頂部設(shè)有進(jìn)料管和排氣管；罐壁上設(shè)有I個補(bǔ)料口，通過補(bǔ)料管向罐內(nèi)流加微生物膠溶液，流加速度由蠕動泵控制。
微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐通過磁力攪拌實(shí)現(xiàn)溶液混合，在罐底部的空氣分布器通過連接管先與一個0.22 μ m規(guī)格的的空氣過濾器連接，然后接轉(zhuǎn)子流量計和空氣壓縮機(jī)；在罐頂部設(shè)有進(jìn)料管和排氣管，罐壁上設(shè)有I個取樣口，取樣管一端置于液面下，一端延伸至罐外。
微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐和降解液培養(yǎng)罐用0.22 μ m規(guī)格的微孔濾膜分隔，連接后用密封條和固定螺栓進(jìn)行密封固定。
2.生物膠降解菌的富集馴化方法，包括以下步驟: 將揮發(fā)性懸浮固體(MLVSS)達(dá)5000mg/L以上的活性污泥，按10%接種量接入馴化培養(yǎng)基A中，37°C搖床培養(yǎng)7 12天，至培養(yǎng)液的粘度< 50mpa.s ;將此培養(yǎng)液接種于馴化培養(yǎng)基B，相同條件下培養(yǎng)至粘度< 30mpa.s ;然后轉(zhuǎn)接入培養(yǎng)基C中，并反復(fù)傳代，直至富集到的降解菌能在3天內(nèi)將I %的微生物膠溶解水化至粘度< IOmpa.S。
3.按權(quán)利要求2所述的微生物膠降解菌的富集馴化中，其特征在于馴化培養(yǎng)基每升溶液中的組分和濃度為:降 解菌馴化培養(yǎng)基A(g/L):微生物膠2.0，葡萄糖5.0，磷酸氫二銨1.0，酵母粉0.5 ;降解菌馴化培養(yǎng)基B(g/L):微生物膠5.0，葡萄糖1.0，磷酸氫二銨1.0，酵母粉0.5 ;降解菌馴化培養(yǎng)基C(g/L):微生物膠10.0，磷酸氫二銨1.0，酵母粉0.5。
4.生物膠發(fā)酵液的菌膠分離方法，包括以下步驟:其特征在于向微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐中接入產(chǎn)膠菌種，攪拌曝氣培養(yǎng)；向降解液培養(yǎng)罐中接入馴化成功的降解菌群，并流加微生物膠液，誘導(dǎo)產(chǎn)生代謝膠水解酶；降解菌細(xì)胞被濾膜阻擋，由其產(chǎn)生的水解酶通過兩個培養(yǎng)裝置間的濾膜，進(jìn)入微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐，降解脫除微生物膠合成菌表面的膠層。
5.按權(quán)利要求4所述的微生物膠發(fā)酵液的菌膠分離方法中，其特征在于黃原膠菌膠分離步驟中，向降解液培養(yǎng)罐中流加的黃原膠溶液濃度為0.4%。黃原膠發(fā)酵培養(yǎng)的通氣量為0.3vvm,降解液培養(yǎng)的通氣量為0.6vvm。
6.按權(quán)利要求4所述的微生物膠發(fā)酵液的菌膠分離方法中，其特征在于結(jié)冷膠菌膠分離步驟中，向降解液培養(yǎng)罐中流加的結(jié)冷膠溶液濃度為0.5%。結(jié)冷膠發(fā)酵培養(yǎng)的通氣量為0.4vvm,降解液培養(yǎng)的通氣量為0.5vvm。
7.按權(quán)利要求4所述的微生物膠發(fā)酵液的菌膠分離方法中，其特征在于溫輪膠菌膠分離步驟中，向降解液培養(yǎng)罐中流加的溫輪膠溶液濃度為0.3%。溫輪膠菌發(fā)酵培養(yǎng)的通氣量為0.2vvm,降解液培養(yǎng)的通氣量為0.6vvm。
8.按權(quán)利要求4所述的微生物膠發(fā)酵液的菌膠分離方法中，其特征在于鞘氨醇膠Ss菌膠分離步驟中，向降解液培養(yǎng)罐中流加的鞘氨醇膠Ss溶液濃度為0.5%。鞘氨醇膠Ss發(fā)酵培養(yǎng)的通氣量為0.3vvm,降解液培養(yǎng)的通氣量為0.5vvm。
全文摘要
微生物膠發(fā)酵液菌膠分離的一種方法及裝置，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括一種微生物膠降解菌富集馴化方法，以及利用降解菌群的作用實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中細(xì)菌代謝膠與細(xì)胞分離的方法及裝置，適用的微生物膠包括黃原膠、結(jié)冷膠、溫輪膠和鞘氨醇膠Ss。反應(yīng)裝置由微生物膠發(fā)酵液培養(yǎng)罐和降解液培養(yǎng)罐兩部分組成，分別設(shè)有曝氣、攪拌、進(jìn)料和排氣裝置。在降解液培養(yǎng)罐中流加相應(yīng)的微生物膠，誘導(dǎo)降解菌產(chǎn)生代謝膠水解酶，水解酶通過兩個培養(yǎng)裝置間的濾膜進(jìn)入發(fā)酵液培養(yǎng)罐，并降解脫除微生物膠合成菌表面的膠層；同時降解菌被濾膜阻擋無法進(jìn)入另一側(cè)的培養(yǎng)裝置，因此不會污染微生物膠合成菌。
文檔編號C12M1/02GK103087897SQ201110338699
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者黃海東, 韓孝強(qiáng), 周吉東 申請人:天津農(nóng)學(xué)院