專利名稱：可誘導(dǎo)和激活癌靶向t細(xì)胞的融合蛋白及制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白及制備方法及用途，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
表皮生長因子(Epidermal growth factor, EGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascularendothelial cell growth factor, VEGF)、促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasinghormone, GnRH)禾口促胃液素釋放妝(gastrin-releasingpeptide, GRP)等的受體在各種腫瘤組織中大量表達(dá)，例如在腸黏膜腫瘤中的EGF受體比正常組織高出300倍(Gastroenterology，98，961-967，1990)。所以，異常高表達(dá)的EGF受體、VEGF受體、GnRH受體、GRP受體等成為引人注目的癌治療靶點。轉(zhuǎn)化生長因子-a (Transforming growth factor- α , TGF- α )的受體與 EGF 的受體相同。上面這些細(xì)胞因子以及激素和多肽等可以與癌細(xì)胞上的相對應(yīng)的受體(Receptor)相互作用。所以在它們的后面連接一個效應(yīng)物例如毒素蛋白而形成融合蛋白，就可以靴向性攻擊癌細(xì)胞(J Biol Chem, 267, 24034-24040,1992 ；Proc Natl AcadSci USA,99,7866-7871,2002 ；Cancer Res，54，5154-5159，1994；J Biol Chem,272,11597-11603，1997 ；Cancer Res，57，290-294，1997)。T細(xì)胞的有效活化需要兩個信號的參與，即需要抗原肽-MHC復(fù)合物與T細(xì)胞上的TCR-CD3結(jié)合提供第1信號，以及共刺激分子(Costimulatory molecules) B7介導(dǎo)的第2信號。最基本的共刺激信號由抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)的B7. 1(⑶80)、B7. 2(^86)分子與T細(xì)胞上表達(dá)的相應(yīng)受體(C^8*CTLA-4)提供(Amj Respir Crit Care Med，162，5164-5168，2000 ；Immunol CellBiol,77,304-311,1999 ；Clin Cancer Res,13,5271-5279, 2007 ；TrendsImmunol，24，313-318，2003)。B7. 1表達(dá)在活化的DC、B細(xì)胞和單核細(xì)胞上，B7. 2在B細(xì)胞、T細(xì)胞、DC和巨噬細(xì)胞上呈低水平表達(dá)，但B7. 2可被誘導(dǎo)快速上調(diào)，而B7. 1被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)時間比B7. 2晚。初始T細(xì)胞上的⑶觀與APC上的B7. 1/B7. 2結(jié)合，可以促進(jìn)IL-2轉(zhuǎn)錄，同時使IL-2受體在T細(xì)胞上表達(dá)增加，從而促進(jìn)T細(xì)胞增殖，還可以通過增加Bcl-xl的表達(dá)途徑使T細(xì)胞免于凋亡。作為藥物的應(yīng)用，B7. I-Fc和B7. 2-Fc可以誘導(dǎo)和激活抗癌的T細(xì)胞，顯示出抗腫瘤的生物活性(Cancer Res, 59,4964-4972,1999 ；Clin Cancer Res，11，8492-8502，2005 ；JImmunol,172，1347-1354,2004 ；Cancer Res，62，5727-5735，2002)。在抗癌的靶向性藥物中，抗體是很流行的手段，但是抗體只是封閉癌細(xì)胞，與T淋巴細(xì)胞無關(guān)。腫瘤組織富含大血管和毛細(xì)血管，這些血管不僅給腫瘤輸送營養(yǎng)，而且血管中有大量的淋巴細(xì)胞，其中70-80%是T淋巴細(xì)胞，但是這些T細(xì)胞是沒有癌細(xì)胞特異性，是不會攻擊腫瘤的。利用這些沒有癌細(xì)胞特異性的T細(xì)胞來靶向性攻擊癌細(xì)胞，是一種抗癌領(lǐng)域中的新的強(qiáng)有力的手段，這樣的藥物是不同于抗體的，現(xiàn)在沒有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白。本發(fā)明的第二個目的是提供一種含有可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的編碼融合蛋白的核苷酸序列的重組載體。本發(fā)明的第三個目的是提供一種可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白的制備方法。本發(fā)明的第四個目的是提供一種可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白，包括與癌細(xì)胞作用的肽和共刺激分子B7. 2 (又名CD86)，所述與癌細(xì)胞作用的肽選自縮寫為TGF- α的轉(zhuǎn)化生長因子_ α、縮寫為EGF的表皮生長因子、縮寫為VEGF的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、縮寫為&iRH的促性腺激素釋放激素或縮寫為GRP的促胃液素釋放肽，TGF-α -Β7. 2由SEQ ID Νο4所示；EGF-B7. 2由SEQ ID Νο6 所示；VEGF-B7. 2 由 SEQ ID Νο8 所示；GnRH_B7. 2 由 SEQ ID NolO 所示；GRP-B7. 2由 SEQ IDNo 12 所示。一種重組載體，含有編碼上面所述融合蛋白的核苷酸序列，編碼SEQ ID No4的核苷酸序列為SEQ ID No3所示；編碼SEQ ID No6的核苷酸序列為SEQ ID No5所示；編碼SEQID No8的核苷酸序列為SEQ ID No7所示；編碼SEQ ID NolO的核苷酸序列為SEQ ID No9所示；編碼SEQ ID Nol2的核苷酸序列為SEQ ID Noll所示。一種可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白的變異體或人為改造的突變序列。一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上面所述的重組載體?？烧T導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白的制備方法，培養(yǎng)上面所述宿主細(xì)胞，收集表達(dá)的相應(yīng)的融合蛋白 TGF-α -B7. 2 ；EGF-B7. 2 ；VEGF-B7. 2 ；GnRH_B7. 2 ；GRP-B7. 2。上面所述可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白與癌癥有關(guān)。上面所述可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白能夠誘導(dǎo)和激活T細(xì)胞。上面所述可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白在制備治療癌癥和抗實體腫瘤的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的融合蛋白具有癌靶向作用，一方面可分別與VEGF的受體VEGFR、EGF和TGF-α的受體EGFR、GnRH的受體GnRH-R、或GRP的受體GRP-R作用，另一方面又與T細(xì)胞上表達(dá)的相應(yīng)受體⑶觀和CTLA-4相互作用，這樣就將T細(xì)胞靶向性定位到大量表達(dá)VEGFR、EGFR、GnRH-R、或GRP-R的癌細(xì)胞周圍，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞攻擊癌細(xì)胞。T細(xì)胞可分泌的細(xì)胞因子例如干擾素-Y (Interferon- γ，IFN- y )、穿孔素和顆粒酶并誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生Fas等導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡，所以上面的融合蛋白對于實體腫瘤有著很明顯的殺傷作用。實驗證明，本發(fā)明的融合蛋白能夠抑制腫瘤生長和引起癌細(xì)胞的凋亡。


圖1表示三種本發(fā)明的融合蛋白抑制肉瘤腫瘤SarCOma(S180)生長，圖中表示的是小鼠的腫瘤重量。
圖2利用常規(guī)免疫組化檢測到的T細(xì)胞，棕色小點是T細(xì)胞。(圖中2-1為對照；
2-2為 B7. 2 ； 2-3 為 TGF- α -Β7. 2 ；2-4 為 EGF-B7. 2 ； 2-5 為 VEGF-B7. 2)圖3利用常規(guī)免疫組化檢查3種本發(fā)明的融合蛋白與腫瘤的結(jié)合能力。(圖中
3-1為 TGF- α -Β7. 2 ;3_2 為 EGF-B7. 2 ；3-3 為 VEGF-B7. 2)圖4利用常規(guī)免疫組化檢測干擾素-Y (IFN- y )，棕色部分就是T細(xì)胞分泌的 IFN- Y。(圖中4-1 為對照；4-2 為 B7. 2 ；4-3 為 TGF- α -Β7. 2 ；4-4 為 EGF-B7. 2 ；4-5 為 VEGF-B7. 2)圖5顯示的是被T細(xì)胞攻擊的癌細(xì)胞，大細(xì)胞是癌細(xì)胞，小細(xì)胞是T細(xì)胞。(圖中 5-1肝癌細(xì)胞；5-2肺癌細(xì)胞)圖6顯示的是凋亡的癌細(xì)胞，大細(xì)胞是癌細(xì)胞，小細(xì)胞是T細(xì)胞，顏色深的大細(xì)胞即癌細(xì)胞正在凋亡。(圖中6-1肝癌細(xì)胞；6-2肺癌細(xì)胞)
具體實施例方式小鼠腫瘤中的一種S180癌細(xì)胞上表達(dá)大量的EGFR和VEGFR(Clin Cancer Res 13，2998-3005，2007 ;PLoS One 5，el5368，2010)，所以這里采用小鼠腫瘤 S180 用于小鼠荷瘤模型實驗。人和小鼠的細(xì)胞因子例如VEGF、EGF和TGF-α在結(jié)構(gòu)上有很大的相似性， 可以發(fā)生交叉反應(yīng)(Biochemistry 40，8930-8939，2001 ； J Control Release，82，71-82， 2002 J Biol Chem 270,4334-4340,1995 ;J Biol Chem 276,19166-19171,2001；Dev Dyn 204，228-239，1995)。同樣，人來源的B7. 1 (CD80)和B7. 2 (CD86)也可以在小鼠中發(fā)揮作用 (ClinCancer Res, 11,8492-8502，2005)。所以這里可以在小鼠荷瘤模型中分析融合蛋白的生物活性，下面通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1 B7. 2 (⑶86)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的人來源的B7. 2基因(又名⑶86)的信息(NM_175862和 L25259)，委托TAKARA公司合成一個核酸序列片段包括一個連接肽和一個B7. 2基因(編碼細(xì)胞外部分的222個氨基酸)和在整個片斷的前面HindIII及后面B10I限制酶切點的幾個堿基，將這個合成好的核酸片段插入T載體并進(jìn)行DNA測序鑒定，然后再用雙酶切方法即用HindIII和B10I處理后，把這片段插入pET22b質(zhì)粒上，這樣就產(chǎn)生了表達(dá)載體 pET2^-B7. 2，可表達(dá)B7. 2蛋白。序列表(SEQ ID N0. 2)僅僅是B7. 2蛋白，前面的連接肽可見另一個序列表(SEQ IDN0. 14)。實施例2 TGF- α -Β7. 2表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的人來源的TGF-α基因的信息(ΝΜ_003236)，委托TAKARA 公司合成一個核酸序列片段包括TGF-α基因及在TGF-α前面再增加限制內(nèi)切酶位點 BamHI和EcoRI的幾個堿基，在片斷的后面包含了 MlI和HindIII的限制內(nèi)切酶位點。 將這個合成好的核酸片段插入T載體并進(jìn)行DNA測序鑒定，然后再用雙酶切方法即用 BamHI和HindIII處理后，把這個片段插入pET2^_B7. 2質(zhì)粒上，這樣就產(chǎn)生了表達(dá)載體 pET22b-TGF-a-B7. 2，可表達(dá) TGF- a-B7. 2 融合蛋白(見序列表 SEQ ID N0. 4)。實施例3 EGF-B7. 2表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的人來源的EGF基因的信息(NM_001963和NM_001178130)， 委托TAKARA公司合成一個核酸序列片段包括EGF基因及在EGF前面再增加限制內(nèi)切酶位點BamHI和EcoRI的幾個堿基，在片斷的后面包含了 Mil和HindIII的限制內(nèi)切酶位點。將這個合成好的核酸片段插入T載體并進(jìn)行DNA測序鑒定，然后再用雙酶切方法即用 BamHI和HindIII處理后，把這個片段插入ρΕΤ2^_Β7. 2質(zhì)粒上，這樣就產(chǎn)生了表達(dá)載體 pET22b-EGF-B7. 2，可表達(dá) EGF-B7. 2 融合蛋白(見序列表 SEQ ID NO. 6)。實施例4 VEGF-B7. 2表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的人來源的VEGF基因的信息(NM_003376)以及參考論文 (J. Biol. Chem. ,266,11947-11954，1991)，委托TAKARA公司合成一個核酸序列片段包括 VEGF基因(121個氨基酸)及在VEGF前面再增加限制內(nèi)切酶位點BamHI和EcoRI的幾個堿基，在片斷的后面包含了 Mil和HindIII的限制內(nèi)切酶位點。將這個合成好的核酸片段插入T載體并進(jìn)行DNA測序鑒定，然后再用雙酶切方法即用BamHI和HindIII處理后， 把這個片段插入pET2^-B7. 2質(zhì)粒上，這樣就產(chǎn)生了表達(dá)載體pET2^-VEGF-B7. 2，可表達(dá) VEGF-B7. 2融合蛋白(見序列表SEQ ID NO. 8)。實施例5 GnRH_B7. 2表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的人來源的GnRH基因的信息(NM_021081和NM_000825等)， 委托TAKARA公司合成一個核酸序列片段包括&iRH基因及在&iRH前面再增加限制內(nèi)切酶位點BamHI和EcoRI的幾個堿基，在片斷的后面包含了 Mil和HindIII的限制內(nèi)切酶位點。將這個合成好的核酸片段插入T載體并進(jìn)行DNA測序鑒定，然后再用雙酶切方法即用 BamHI和HindIII處理后，把這個片段插入ρΕΤ2^_Β7. 2質(zhì)粒上，這樣就產(chǎn)生了表達(dá)載體 pET22b-GnRH-B7. 2，可表達(dá) GnRH_B7. 2 融合蛋白(見序列表 SEQ ID NO. 10)。實施例6 GRP-B7. 2表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的人來源的GRP基因的信息(NM_002091、NM_001012512和 NM_001012513等)，委托TAKARA公司合成一個核酸序列片段包括GnRH基因及在GnRH前面再增加限制內(nèi)切酶位點BamHI和EcoRI的幾個堿基，在片斷的后面包含了 Mil和HindIII 的限制內(nèi)切酶位點。將這個合成好的核酸片段插入T載體并進(jìn)行DNA測序鑒定，然后再用雙酶切方法即用BamHI和HindIII處理后，把這個片段插入ρΕΤ2^_Β7. 2質(zhì)粒上，這樣就產(chǎn)生了表達(dá)載體pET22b-GRP-B7. 2，可表達(dá)GRP-B7. 2融合蛋白(見序列表SEQ ID NO. 12)。實施例7各種蛋白的表達(dá)、變性和復(fù)性以及純化將各種表達(dá)質(zhì)粒pET22b-B7. 2、pET22b-TGF-a-B7. 2、pET22b-EGF-B7. 2、 pET22b-VEGF-B7. 2、pET22b-GnRH_B7. 2 和 pET2^_GRP_B7. 2 分別用電穿孔法轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)，利用抗生素Amp(Ampicillin)篩選陽性菌。接下來各種蛋白的表達(dá)、變性和復(fù)性以及純化的過程大致相同，操作如下含有表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE!3)先進(jìn)行大規(guī)模37°C培養(yǎng)，然后加入IPTG (Isopropylthio- β -D-galactoside)使之濃度達(dá)到ImM并過夜30 °C培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。第2天離心培養(yǎng)液和收集菌體，用超聲波法破細(xì)胞壁，離心收集包含體沉淀，這里的蛋白是以包含體形式存在。包含體蛋白用6M尿素變性溶解，然后進(jìn)行多階段透析，透析溶液是逐步稀釋的尿素例如3M、2M和1M，接下來是0. 5M尿素，0. 4M L-精氨酸，375 μ M氧化型谷胱甘肽GSSG，1. 875mM還原型谷胱甘肽GSH，透析后進(jìn)行離心，所得上清液就是蛋白的復(fù)性溶液。用His. Bind Purification Kit試劑盒(Novagen公司)對于蛋白進(jìn)行純化， 先用Binding Buffer沖洗凝膠柱，同時也在蛋白溶液里加入Binding Buffer，將蛋白樣品上柱，用Wash Buffer漂洗，然后用Elute Buffer洗脫，用蛋白質(zhì)電泳進(jìn)行鑒定，將純度為一條帶的蛋白用于以后的實驗。這樣得到6種高純度蛋白B7. 2、TGF- α -Β7. 2、EGF-B7. 2、 VEGF-B7. 2、GnRH-B7. 2和GRP-B7. 2，其中B7. 2是用于對照實驗的。實施例8抑制腫瘤實驗首先選擇雄性ICR小鼠，4-5周，18_22g，分成5組，每組30只小鼠。小鼠肉瘤細(xì)胞S180是從ATCC購買，先進(jìn)行體外培養(yǎng)，再注射到ICR小鼠腹腔，進(jìn)行體內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)，最后，取出腹腔內(nèi)的S180細(xì)胞，將2xl06小鼠肉瘤細(xì)胞S180接種于另外五組的ICR小鼠的右側(cè)腋下，然后隔天往腹腔內(nèi)分別注射B7. 2、TGF- α -Β7. 2、EGF-B7. 2和VEGF-B7. 2蛋白溶液 0. 2ml (250pmol) /只，而對照組注射等量生理鹽水(0. 9% NaCl)，9天后處死小鼠。觀察小鼠腫瘤生長情況以及處死后腫瘤的重量。圖1表示各組小鼠解剖后的腫瘤的重量，結(jié)果表明TGF- α -Β7. 2、EGF-B7. 2和VEGF-B7. 2融合蛋白很有效地抑制腫瘤生長，而注射Β7. 2的效果不太好。實施例9腫瘤組織內(nèi)T淋巴細(xì)胞的檢測TGF- α -Β7. 2、EGF-B7. 2和VEGF-B7. 2融合蛋白和Β7. 2蛋白處理以及對照組生理鹽水的小鼠S180腫瘤組織切成小塊，用石蠟包埋制成石蠟切片，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)實驗。為了檢測腫瘤組織內(nèi)的T細(xì)胞，使用Santa Cruz Biotechnolog公司的抗 CD3 抗體，然后用二抗以及 avidin-biotin-perxidase complex(Zymed 公司),最后用 Diaminobenzidine (DAB)顯色。經(jīng) TGF- α -Β7. 2、EGF-B7. 2 和 VEGF-B7. 2 注射的小鼠腫瘤組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量的T細(xì)胞(圖2顯示的棕色小點為T細(xì)胞)，這說明在TGF-α -Β7. 2、 EGF-B7. 2和VEGF-B7. 2誘導(dǎo)下，腫瘤組織內(nèi)充滿了浸潤性(Infiltrating) T細(xì)胞。而B7. 2 處理小組的腫瘤內(nèi)只有少量的T細(xì)胞，而生理鹽水處理的對照組幾乎沒有什么T細(xì)胞。這里的結(jié)果表明融合蛋白能夠靶向性的將T細(xì)胞富集到實體腫瘤的組織內(nèi)部。實施例10三種融合蛋白對于癌細(xì)胞的結(jié)合能力的檢查 由于pET22b載體上有6個組氨酸的標(biāo)簽，所以本發(fā)明的融合蛋白的C末端都帶有這個標(biāo)簽，所以可用抗6個組氨酸抗體(Santa Cruz Biotechnolog公司)來檢測融合蛋白的存在。用TGF- α -Β7. 2、EGF_B7. 2和VEGF-B7. 2融合蛋白溶液孵育腫瘤組織石蠟切片，然后用抗6個組氨酸抗體進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)TGF- α -Β7. 2、EGF-B7. 2和VEGF-B7. 2融合蛋白都可以與S180癌細(xì)胞結(jié)合(圖3中的棕色部分)，表明融合蛋白中的人來源的TGF- α、EGF和 VEGF可與小鼠癌細(xì)胞上的EGFR和VEGFR先后作用。實施例11腫瘤組織內(nèi)干擾素-γ (IFN- y )的檢測用免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織內(nèi)由T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ，抗體是 SantaCruz Biotechnolog公司的抗IFN- γ抗體。圖4是測定的結(jié)果，表明在TGF- α -Β7. 2、 EGF-B7. 2和VEGF-B7. 2誘導(dǎo)下，腫瘤組織內(nèi)的T細(xì)胞分泌了大量的IFN- Y (圖4中4_3、 4-4和4-5中的棕色部分)，而Β7. 2組只有很少的陽性反應(yīng)(圖4-2)，生理鹽水組(圖4-1) 沒有什么IFN-Y分泌。實施例12 GnRH-B7. 2和GRP-B7. 2誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活性外周血細(xì)胞購自天津血液中心，用Ficoll密度離心和尼龍毛柱方法取得T淋巴細(xì)胞(JClin Invest，91，1490-1498，1993)，這些T細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。然后分別加入 B7. 2、GnRH-B7. 2 和 GRP-B7. 2。
在6孔板上用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)T細(xì)胞，然后加入5pmol量的3種蛋白，然后用 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)的 IFN-γ 試齊Ll盒(R&D Systems 公司)來檢測培養(yǎng)基中的IFN-γ的含量。表1為分析B7. 2、GnRH-B7. 2和GRP-B7. 2蛋白刺激T細(xì)胞的能力，檢測的是細(xì)胞因子IFN-γ。表1 IFN- y (pg/ml)
權(quán)利要求
1.一種可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白，其特征是包括與癌細(xì)胞作用的肽和共刺激分子B7.2，所述與癌細(xì)胞作用的肽選自縮寫為TGF-α的轉(zhuǎn)化生長因子-α、縮寫為EGF的表皮生長因子、縮寫為VEGF的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、縮寫為&iRH的促性腺激素釋放激素或縮寫為GRP的促胃液素釋放肽，TGF-α -Β7. 2由SEQ ID Νο4所示；EGF-B7. 2由SEQ IDΝο6 所示；VEGF-B7. 2 由 SEQ ID Νο8 所示；GnRH_B7. 2 由 SEQ ID NolO 所示；GRP-B7. 2 由 SEQID Nol2 所示。
2.一種重組載體，其特征在于含有編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，編碼SEQ IDNo4的核苷酸序列為SEQ ID No3所示；編碼SEQ ID No6的核苷酸序列為SEQ ID No5所示；編碼SEQ ID No8的核苷酸序列為SEQ ID No7所示；編碼SEQ ID NolO的核苷酸序列為SEQ IDNo9所示；編碼SEQ ID Nol2的核苷酸序列為SEQ ID Noll所示。
3.權(quán)利要求1所述一種可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白的變異體或人為改造的突變序列。
4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于該宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求2所述的重組載體。
5.權(quán)利要求1所述可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白的制備方法，其特征在于培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，收集表達(dá)的權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
6.權(quán)利要求1所述的融合蛋白與癌癥有關(guān)。
7.權(quán)利要求1所述的融合蛋白能夠誘導(dǎo)和激活T細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備治療癌癥和抗實體腫瘤的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可誘導(dǎo)和激活癌靶向T細(xì)胞的融合蛋白及制備方法及用途，該蛋白包括與癌細(xì)胞作用的肽和共刺激分子B7.2，所述與癌細(xì)胞作用的肽選自轉(zhuǎn)化生長因子-α、表皮生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、促性腺激素釋放激素或促胃液素釋放肽，本發(fā)明的融合蛋白具有癌靶向作用，一方面可分別與VEGFR、EGFR、GnRH-R、或GRP-R作用，另一方面又與T細(xì)胞上表達(dá)的相應(yīng)受體CD28和CTLA-4相互作用，這樣就將T細(xì)胞靶向性定位到大量表達(dá)VEGFR、EGFR、GnRH-R、或GRP-R的癌細(xì)胞周圍，實驗證明，本發(fā)明的融合蛋白能夠抑制腫瘤生長和引起癌細(xì)胞的凋亡。
文檔編號C12P21/00GK102382193SQ201110338700
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者孫嘉琳 申請人:孫嘉琳