專利名稱：一種肌內(nèi)脂肪沉積acl基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物分子育種的基因工程技術(shù)，特別是一種與豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的 ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACL)基因技術(shù)。
背景技術(shù)：
目前，我國養(yǎng)豬生產(chǎn)在追求高瘦肉率和低背膘厚的同時(shí)，忽略了豬肉品質(zhì)的下降。 肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat, IMF)含量是豬肉品質(zhì)的重要影響因素,可影響肉品質(zhì)的風(fēng)味、多汁性、嫩度及營養(yǎng)價(jià)值等多個(gè)方面。因此，提高肌內(nèi)脂肪含量以改善豬肉品質(zhì)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。我國的地方品種豬雖然生長速度較慢，但卻具有較優(yōu)良的肉品質(zhì)。如版納微型豬是云南優(yōu)良地方豬種之一，具有體態(tài)勻稱、迅長迅肥、皮薄骨細(xì)、后腿豐滿、背膘分布均勻，肌內(nèi)脂肪豐富等特點(diǎn)，是適合烤乳豬的原料豬。然而，目前對(duì)版納微型豬的生長發(fā)育及脂肪沉積的分子機(jī)制知之甚少。隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，從分子水平上了解版納微型豬脂肪沉積的分子基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)、開發(fā)版納微型豬與脂肪沉積相關(guān)的功能基因，為提高商品豬肌內(nèi)脂肪含量而改善豬肉品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。在豬肌肉組織中，IMF含量的增加主要是甘油三酯(triacylglycerols, TAG)含量的增加，TAG含量的增加主要依賴于肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化與增殖。脂肪細(xì)胞分化和增殖過程中，TAG的合成主要依賴于脂肪酸的從頭合成和轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化與增殖及其代謝是IMF沉積的基礎(chǔ)，調(diào)控肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化與增殖及調(diào)節(jié)脂類代謝的調(diào)控因子對(duì) IMF的沉積都有重要影響。葡萄糖是動(dòng)物體的主要能量來源，當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)的葡萄糖供應(yīng)過剩時(shí)，則會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橹緝?chǔ)存。細(xì)胞膜的生成以及蛋白質(zhì)翻譯后的調(diào)節(jié)也離不開依賴于葡萄糖合成的脂類。ATP 檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACL)是聯(lián)系糖代謝與脂類合成的關(guān)鍵酶，它能夠催化檸檬酸轉(zhuǎn)變成乙酰輔酶A和草酰乙酸。乙酰輔酶A經(jīng)過乙酰輔酶A羧化酶和脂肪酸合酶催化最后生成脂肪酸。因此，ATP檸檬酸裂解酶是重要的脂肪合成酶之一，與豬的脂肪沉積密切相關(guān)。一些資料表明，ATP檸檬酸裂解酶的活性可受到日糧營養(yǎng)及胰島素的調(diào)節(jié)。高碳水化合物營養(yǎng)可提高小鼠ATP檸檬酸裂解酶在肝臟的表達(dá)，其活性主要在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)節(jié)。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，ATP檸檬酸裂解酶可通過調(diào)節(jié)其合成速度來改變體內(nèi)脂肪從頭合成的狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肌內(nèi)脂肪沉積ACL基因，采用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，在對(duì)豬肌肉組織和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn)ACL基因參與肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂類代謝過程，并首次從版納微型豬肌肉組織中克隆了 ACL基因。一種肌內(nèi)脂肪沉積ACL基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的ATP檸檬酸裂解酶(ACL)基因，基因的⑶S序列全長為3276bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I。并且，CDS核苷酸序列編碼1091個(gè)氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID. NO. 2。對(duì)上述特征的肌內(nèi)脂肪沉積ACL基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測ACL基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個(gè)組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示ACL基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，初步表明ACL基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。本發(fā)明克隆得到版納微型豬ACL基因⑶S全序列，全長為3276bp，提交到 Genbank，登錄號(hào)為JN205459。與Genbank提供的豬ACL基因相比較，發(fā)現(xiàn)有五個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)，其中有三個(gè)有義突變，導(dǎo)致氨基酸由丙氨酸突變成纈氨酸、天冬氨酸變?yōu)樘於０贰?蘇氨酸變?yōu)榈鞍彼?。推測該氨基酸位點(diǎn)的突變可能導(dǎo)致版納微型豬ACL蛋白質(zhì)的分子量、 等電點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)等特性都有所改變，而這些性質(zhì)的改變可能與版納微型豬肉品質(zhì)優(yōu)良的特點(diǎn)有關(guān)。ACL蛋白在物種間的同源性較高，通過進(jìn)化樹可以看出，豬與牛、羊的親緣關(guān)系更為接近，其次是人、鼠，ACL編碼的氨基酸序列與牛、羊、人、小鼠和大鼠的同源性分別為 98%、98%、98%、97%和97%?？梢姡珹CL在不同物種間具有高度保守性，這是它在各個(gè)物種中相應(yīng)的生理特點(diǎn)保持不變的分子基礎(chǔ)。另外，ACL基因的RT-PCR表達(dá)模式表明，該基因在脂肪組織中高度表達(dá)，也證明了它在肌內(nèi)脂肪沉積方面具有重要作用。本發(fā)明采用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，在對(duì)豬肌肉組織和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn)ACL基因參與肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂類代謝過程，并首次從豬肌肉組織中克隆了 ACL基因。目前有關(guān)豬ACL基因及其表達(dá)模式的研究還較少。對(duì)人、鼠和梅山、 大白豬脂肪組織ACL基因cDNA序列的克隆與表達(dá)已有研究，但尚未從版納微型豬肌肉組織中克隆到該基因。


圖I是本發(fā)明的PCR擴(kuò)增ACL基因圖示
圖2是本發(fā)明的ACL在不同組織中的表達(dá)水平柱3是本發(fā)明的ACL基因酶切鑒定圖示圖4是本發(fā)明的進(jìn)化樹分析5是本發(fā)明的ACL蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測6是本發(fā)明的ACL蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測7是本發(fā)明的ACL蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)預(yù)測8是本發(fā)明的ACL蛋白質(zhì)疏水性分析圖
具體實(shí)施例方式一種肌內(nèi)脂肪沉積ACL基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACL)基因?；虻腃DS序列全長為 3276bp,其⑶S核苷酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. I。并且，⑶S核苷酸序列編碼1091個(gè)氨基酸，氨基酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2。對(duì)上述特征的肌內(nèi)脂肪沉積ACL基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測ACL基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個(gè)組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示ACL基因在脂肪組織中表達(dá)量最聞，初步表明ACL基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。具體為I、肌肉組織中總RNA的提取
采取50kg成年版納微型豬肌肉組織立即放入液氮中保存?zhèn)溆?。利用RNA提取試劑提取版納微型豬肌肉組織總RNA，具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，_20°C保存，待用。2、PCR引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)條件
根據(jù)GenBank中豬ACL序列信息(GenBank登錄號(hào)ΝΜ_001105302),利用Primer Premier 5. O設(shè)計(jì)引物，并合成。為了得到較佳的擴(kuò)增效果，采用分兩段擴(kuò)增的方法，最后將兩段序列拼接在一起。用于克隆的ACL基因的兩對(duì)引物序列為
上半段，產(chǎn)物長度為2063bp
F:5’ - CCATGTCGGC CAAGGCGATT TT - 3 ’
R:5’ - ATAAACGTGG AGCCGGGGTA - 3，
下半段，產(chǎn)物長度為1337bp
F :5’ - ACAGGTACCC CGGCTCCACG TTTAT - 3’
R:5’ - CCCAGGGGAG GAGTTCTTGT CTTCA - 3’
用于熒光定量的ACL基因的引物序列為
F :5’ - CGAGCAGCAG ACCTATGACT AT -3’
R :5’ - ACTTCTCCCA TCACCCGTAA -3’
內(nèi)參18S rRNA的引物序列為
F :5’ -CTGCCTCCTT GGATGTG-3’
R:5’ -GCGGCTTTGG TGACTCTA-3’
ACL基因克隆的PCR反應(yīng)條件為上半段94°C預(yù)變性3min ;94°C變性O(shè). 5min、53°C 退火lmin、72°C延伸3min (35個(gè)循環(huán))；72°C后延伸IOmin進(jìn)行擴(kuò)增；下半段94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 O. 5min、55°C退火 O. 5min、72°C延伸 2min(35 個(gè)循環(huán));72°C后延伸 7min 進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)后于4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，確認(rèn)擴(kuò)增的產(chǎn)物的長度大小同于目的片段。如說明書核苷酸和氨基酸序列表。熒光定量PCR的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min;94°C變性O(shè). 5min、54°C退火 O. 5min、72°C延伸3min (35個(gè)循環(huán));72°C延伸IOmin。數(shù)據(jù)處理的方法為，檢測心、肝、脾、 肺、腎、肌肉、脂肪七個(gè)組織中ACL基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以18S rRNA作為內(nèi)參，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法處理。結(jié)果顯示，ACL在被檢測的7個(gè)組織中都有表達(dá)，在脂肪中高量表達(dá)， 在肝、肺、肌肉上大量表達(dá)，在心、腎上是多量表達(dá)，在脾上是微量表達(dá)。3、ACL基因的克隆及序列分析
按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒書說明書回收特異性條帶，產(chǎn)物連接于pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至ToplO感受態(tài)細(xì)胞，氨芐篩選挑取陽性克隆，分別接種于IOmL LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振蕩過夜，提取質(zhì)粒經(jīng)Ecor I和Hind III雙酶切鑒定為陽性，進(jìn)行測序?？寺¤b定結(jié)果如說明書核苷酸和氨基酸序列表。4、測序結(jié)果
所得的兩段擴(kuò)增序列經(jīng)過測序，并用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，獲得版納微型豬ACL基因⑶S編碼區(qū)全序列。⑶S全長3276bp，核苷酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表SEQ.ID. NO. I所示，并提交到Genbank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為JN205459。⑶S序列編碼1091個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2所示。
5、測序結(jié)果與Genbank中提供的序列比對(duì)登錄 http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/ 進(jìn)行版納微型豬 ACL 基因的 Q)S 核苷酸序列，以及CDS編碼的氨基酸序列與Genbank提供的豬ACL基因信息(登錄號(hào)為 NM_001105302)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)⑶S的核苷酸序列有五個(gè)突變位點(diǎn)第1117位C變?yōu)門、第 1941位T變?yōu)镃、第2790位T變?yōu)镃、第2911位G變?yōu)锳、第3077位C變?yōu)門。其中第 1117位、第2911位和第3077位是有義突變，引起第373位氨基酸由丙氨酸突變成纈氨酸、 第971位氨基酸由天冬氨酸變?yōu)樘於０?、?026位氨基酸由蘇氨酸變?yōu)榈鞍彼帷Ｈ缯f明書核苷酸和氨基酸序列表。6、ACL基因核苷酸與氨基酸序列同源性分析
登錄http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版納微型豬ACL基因測序結(jié)果與牛(登錄號(hào)為NM_001037457)、羊(登錄號(hào)為NM_001038622)、人(登錄號(hào)為NM_001096)、小鼠 (登錄號(hào)為NM_001199296)和大鼠(登錄號(hào)為NM_016987)⑶S序列進(jìn)行同源性比較。版納微型豬ACL基因的⑶S序列與牛、羊、人、小鼠和大鼠的同源性分別為93%、92%、91%、89%和 89%。版納微型豬CDS序列所編碼氨基酸序列與牛、羊、人、小鼠和大鼠的同源性分別為98%、 98%、98%、97%和97%。如說明書核苷酸和氨基酸序列表。7、ACL基因的進(jìn)化樹分析
利用Meg4軟件的鄰近(Neighbor-joining)方法構(gòu)建版納微型豬、牛、人、小鼠、大鼠以及羊ACL基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示版納微型豬與牛和羊的親緣性較近，其次是人、小鼠、大鼠。8、ACL蛋白分子量、等電點(diǎn)預(yù)測分析
使用ExPASy的在線軟件Compute pi/MW分析版納微型豬ACL蛋白的等電點(diǎn)(pi)為
7.12、理論分子量(pW)為 119843. 23 Da。9、ACL蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析
登陸http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/,對(duì)各物種ACL蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，共有299個(gè)螺旋、173個(gè)延伸和628個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)。10、ACL蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測
登陸 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,對(duì)豬 ACL 蛋白質(zhì)憐酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，共有39個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有19個(gè)、蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)有9個(gè)、酪氨酸磷酸化位點(diǎn)有11個(gè)。11、ACL蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)預(yù)測
登陸 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,對(duì)豬 ACL 蛋白質(zhì)憐酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，共有三個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別在第75位、第346位和第440位。12、ACL蛋白質(zhì)疏水性分析
登陸http://web. expasy. org/protscale/,對(duì)ACL蛋白質(zhì)疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示為親水性蛋白。
權(quán)利要求
1.一種肌內(nèi)脂肪沉積ACL基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACL)基因，其特征在于基因的CDS 序列全長為3276bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I，并且，⑶S核苷酸序列編碼1091個(gè)氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種肌內(nèi)脂肪沉積ACL基因，其特征在于對(duì)上述特征的肌內(nèi)脂肪沉積ACL基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測ACL基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個(gè)組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示ACL基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，初步表明ACL基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。
全文摘要
本發(fā)明公開一種肌內(nèi)脂肪沉積ACL基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的ATP檸檬酸裂解酶(ATPcitratelyase,ACL)基因，基因的CDS序列全長為3276bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。并且，CDS核苷酸序列編碼1091個(gè)氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。檢測ACL基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個(gè)組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示ACL基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，初步表明ACL基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102604978SQ201110339150
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者劉維全, 朱寶利, 潘洪彬, 王聰, 王靜, 趙素梅, 高士爭, 黃英 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)