專利名稱：一種核苷類抗生素a201a高產(chǎn)菌株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋微生物基因工程和代謝工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過基因工程對(duì) M. thermotolerans SCSIO 00652的鏈霉素中核苷類抗生素A201A的生物合成基因簇進(jìn)行遺傳改造，使mtdA的基因失活而獲得核苷類抗生素A201A高產(chǎn)的M. thermoto lerans SCSIO 00652 突變株 Ju3001。
背景技術(shù)：
在過去的十年間，海洋放線菌已成為新穎生物活性天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的新源泉。例如，Salinispora屬放線菌，可產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)新穎和生物活性廣泛的化合物，如海洋放線菌 Salinispora tropica可產(chǎn)生化合物salinosporamide A，作為高效的蛋白酶體抑制劑該化合物已經(jīng)進(jìn)入癌癥治療的臨床試驗(yàn)了。本研究單位(中國科學(xué)院南海海洋研究所)從中國南海北部深海海溝的沉積土里分離得到一個(gè)放線菌新屬菌種M. thermoto lerans SCSIO 00652，該菌株的發(fā)酵液對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑制作用。與抗生素生物合成相關(guān)的基因往往成簇排列，包括自我抵抗基因、轉(zhuǎn)運(yùn)基因和調(diào)控基因?？股厣锖铣苫虼爻晒寺『螅衫梅肿由飳W(xué)基礎(chǔ)上的組合生物合成 (combinatorialbiosynthesis)禾口代謝工禾呈(metabolic engineering)技術(shù)來定向創(chuàng)造新結(jié)構(gòu)、新活性化合物或者提高抗生素的產(chǎn)量，這無疑將大大豐富已有的資源，從而為解決或部分解決臨床上病原微生物的耐藥性日益嚴(yán)重的問題。近年來發(fā)展起來的PCR-Targeting技術(shù)和接合轉(zhuǎn)移技術(shù)已在多種鏈霉菌中成功應(yīng)用。PCR-Targeting技術(shù)是以RED重組技術(shù)為基礎(chǔ)的，RED同源重組系統(tǒng)由源于λ噬菌體的exo、bet、gam基因組成，在這3個(gè)基因產(chǎn)物的作用下，該系統(tǒng)能介導(dǎo)36bp以上的同源片段產(chǎn)生同源重組。接合轉(zhuǎn)移技術(shù)是發(fā)生在大腸桿菌與鏈霉菌之間，可以避開胞外核酸酶的影響，使DNA免遭核酸酶的降解，在某種程度上可以克服宿主對(duì)外源DNA的限制性修飾從而提高轉(zhuǎn)化效率，而且操作程序簡單，因此應(yīng)用較為廣泛。PCR-Targeting技術(shù)和接合轉(zhuǎn)移技術(shù)為通過基因工程對(duì)鏈霉素中抗生素生物合成基因簇進(jìn)行遺傳改造提供了一種方便而有效的途徑。核苷類抗生素A201A，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示，具有廣譜抑菌性，對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抑制作用，對(duì)Maphylococcus aureus具有抗菌活性，對(duì)鹵蟲(Artemia salina)
具有致死性。
權(quán)利要求
1.一種核苷類抗生素A201A高產(chǎn)菌株M. thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001， 其特征在于，該核苷類抗生素A201A高產(chǎn)菌株Μ. thermotolerans SCSIO 00652突變株 Ju3001是mtdA基因失活的Μ. thermotolerans SCSIO 00652，所述的mtdA基因的序列如 SEQ IDN0. 1 所示。
2.一種權(quán)利要求1所述的核苷類抗生素A201A高產(chǎn)菌株M. thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001的構(gòu)建方法，其特征在于，是將M. thermotolerans SCSIO 00652的 mtdA基因失活，由此獲得核苷類抗生素A201A高產(chǎn)菌株M. thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001，所述的mtdA基因的序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷類抗生素A201A高產(chǎn)菌株MthermotoleransSCSIO 00652突變株Ju3001的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的將Μ. thermotolerans SCSIO 00652 的 mtdA 基因失活是以 MtdAdelF 5' -gccgacctgctggagaccttctccgtcctggccgaggtgattccg gggatccgtcgacc-3 ； MtdAdelR 5' -gcacagccagttctcgacctccaggacgtgcatggtggctgtaggct ggagctgcttc-3'作為mtdA基因敲除引物，用PCR-Targeting進(jìn)行同源重組，將同源重組的 cosmid與野生型的M. thermotolerans SCSIO 00652進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移對(duì)mtdA基因進(jìn)行閱讀框取代，而構(gòu)建得到mtdA基因失活的M. thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001。
4.一種在抗生素A201A生物合成作為負(fù)性調(diào)控子發(fā)揮作用的mtdA基因，其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
5.一種權(quán)利要求4所述的mtdA基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDN0. 2 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開一種核苷類抗生素A201A高產(chǎn)菌株及其構(gòu)建方法。核苷類抗生素A201A高產(chǎn)菌株M.thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001是mtdA基因失活的M.thermotolerans SCSIO 00652，所述的mtdA基因的序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的通過失活M.thermotolerans SCSIO 00652的核苷類抗生素A201A生物合成基因簇上游的負(fù)性調(diào)控子mtdA基因而得到mtdA基因失活的M.thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001，該M.thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001的核苷類抗生素A201A產(chǎn)量是野生型的M.thermotolerans SCSIO 00652菌株的25倍。因此，該抗生素A201A高產(chǎn)菌株M.thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001的成功構(gòu)建使抗生素A201A的產(chǎn)業(yè)化成為可能。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102373171SQ20111034090
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者張長生, 朱清華, 李軍, 田新朋, 鞠建華, 馬俊英 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所