專利名稱：用于檢測(cè)egfr外顯子21多態(tài)性的引物組及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)EGFR外顯子21多態(tài)性的引物組以及所述引物組的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
已經(jīng)認(rèn)為表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在肺癌中起重要作用。能夠阻抑(suppress) EGFR功能的藥物已被用于肺癌治療的領(lǐng)域。被用于治療非小細(xì)胞肺癌患者的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(如吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)等等)作為此類藥物已知。 這些藥物不僅被用于肺癌，也被嘗試用于腺癌。然而，在一些患者組中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果有時(shí)似乎不夠。另外，在另一組患者中，盡管EGFR酪氨酸激酶抑制劑在開始誘導(dǎo)反應(yīng)，但是存在EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果逐漸降低的情況，這與預(yù)期相反。因?yàn)檫@些原因，已針對(duì)抑制劑的使用研究了預(yù)測(cè)EGFR酪氨酸激酶抑制劑效果的因素，并已發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變是此類重要因素。已知的預(yù)測(cè)性因素的例子包括EGFR外顯子在密碼子 790 處的突變(T790M) (JP2008-529532, Cancer Research, Vol. 66，No. 16，2006， pp. 7854-7858)，外顯子 18 在密碼子 719 處的突變(G719X) (Cancer Research, Vol. 66， No.16，2006，pp.7854-7858)。EGFR外顯子21在密碼子858處由亮氨酸到精氨酸的突變(EGFR外顯子21L858R) 已被明確地認(rèn)為能增強(qiáng)吉非替尼的腫瘤減小效應(yīng)。因?yàn)樵诟甙俜直?約45%)的肺癌中發(fā)現(xiàn)了 EGFR突變，所以EGFR突變作為在給藥前要考慮的預(yù)測(cè)性因素來(lái)說(shuō)是重要的。直接測(cè)序方法(J.Clin. Oncology, Vol 23，No 11 (April 10) ,2005 pp. 2513-2520)或 SMAP(SMart-Abplification Process)方法(Clin Cancer Res2007 ； Vol. 13 (17) September 1,2007 :pp. 4974-4983)已知是檢測(cè) EGFR 外顯子 21L858R 的技術(shù)。同時(shí)，突變檢測(cè)方法已知是容易、靈敏并且可靠的檢測(cè)突變的方法，該方法包括， 通過(guò)在一個(gè)反應(yīng)中既使用突變型又使用野生型(正常型)引物，來(lái)優(yōu)先擴(kuò)增具有突變的堿基的核酸序列(W0 2010/001969)。

發(fā)明內(nèi)容
實(shí)際測(cè)試中使用的樣品是來(lái)自血漿或血清的可溶的DNA。在此類DNA中檢測(cè)突變需要高特異性。然而，在直接測(cè)序方法中，特異性通常被認(rèn)為是約10%，這可能不足以檢測(cè)可溶DNA中的突變。同時(shí)，盡管SMAP方法在靈敏度的角度來(lái)看可能是足夠的，但是對(duì)材料 (例如引物)的設(shè)計(jì)可能不容易，實(shí)際的操作可能是復(fù)雜的?？紤]這些情況進(jìn)行了本發(fā)明。本發(fā)明涉及提供下述探針以及所述探針的應(yīng)用，所述探針能夠以高靈敏度容易地檢測(cè)EGFR外顯子21多態(tài)性的探針。本發(fā)明第一方面的一個(gè)示例性實(shí)施方式是[1]用于檢測(cè)EGFR外顯子21中多態(tài)性的引物組，所述引物組包含Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且能夠通過(guò)使用SEQ ID NO 1 中的區(qū)域作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，所述區(qū)域包含SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基，Pl寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且具有胞嘧啶作為與SEQ IDNO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基，P2寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且具有腺嘌呤作為與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基，和Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸滿足下述相關(guān)性中的至少一種P1寡核苷酸的解鏈溫度高于P2寡核苷酸的解鏈溫度；或Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸長(zhǎng)一個(gè)或多個(gè)堿基。本發(fā)明的第一方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[2] [1]的引物組，其中Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個(gè)在不同于與SEQ ID NO :1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含至少一個(gè)與SEQ ID NO :1的堿基序列不互補(bǔ)的堿基。本發(fā)明的第一方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[3] [1]或[2]的引物組，其中Pl 寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個(gè)在不同于與SEQ ID NO :1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含額外的序列，所述額外的序列由連續(xù)的2到10個(gè)與SEQ ID NO 1的堿基序列不互補(bǔ)的堿基形成，并且位于所述寡核苷酸鏈的5'末端。本發(fā)明的第一方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是W] [1]到[3]中任一項(xiàng)的引物組，其中Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個(gè)在不同于與SEQID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含錯(cuò)配堿基或包含與SEQ ID NO :1的堿基序列不互補(bǔ)的2到 20個(gè)錯(cuò)配堿基的序列，所述位置。本發(fā)明的第一方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[5] [1]到[4]中任一項(xiàng)的引物組，其中Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個(gè)在從其3'末端起的第1位到第3位中的一處包含與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基。本發(fā)明的第一方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是W] [1]到[5]中任一項(xiàng)的引物組，其中，Pl寡核苷酸的解鏈溫度比P2寡核苷酸的解鏈溫度高0. 1°C到20°C。本發(fā)明的第一方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[7] [1]到W]中任一項(xiàng)的引物組，其還包含與下述序列同源的引物，所述序列處于SEQ ID NO :1堿基序列中較模板核酸序列更靠5'末端側(cè)的區(qū)域中，其中所述模板核酸序列與Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸互補(bǔ)。本發(fā)明的第一方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[8] [1]到[7]中任一項(xiàng)的引物組，其包含SEQ ID NO :2到SEQ ID NO :11的寡核苷酸中的至少一個(gè)作為Pl寡核苷酸，和 SEQ ID NO 12到SEQ ID NO 21的寡核苷酸中的至少一個(gè)作為P2寡核苷酸。本發(fā)明的第二方面的一個(gè)示例性實(shí)施方式是[9]用于檢測(cè)EGFR外顯子21中多態(tài)性的引物，所述引物能夠通過(guò)使用SEQ ID NO :1中的區(qū)域作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，所述區(qū)域包含SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基，并且所述引物是下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有10 個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且具有胞嘧啶作為與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基。本發(fā)明的第二方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[10] [9]的引物，其在不同于與 SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含至少一個(gè)與SEQ ID NO 1的堿基序列不互補(bǔ)的堿基。本發(fā)明的第二方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[11] [9]或[10]的引物，其在不同于與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含一個(gè)或多個(gè)與SEQ ID NO 1的堿基序列不互補(bǔ)的堿基，其中所述一個(gè)或多個(gè)不互補(bǔ)的堿基選自下組，所述組由額外的序列，其由連續(xù)的2到10個(gè)堿基形成，并且位于所述引物5'末端；
錯(cuò)配堿基；和2到20個(gè)錯(cuò)配堿基的序列組成。本發(fā)明的第二方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[12] [9]到[11]的引物，其在從其3'末端起的第1位到第3位中的一處包含與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基。本發(fā)明的第三方面的一個(gè)示例性實(shí)施方式是[13]檢測(cè)EGFR基因中多態(tài)性的方法，所述方法包括(I)通過(guò)使[1]到[8]中任一項(xiàng)的引物組與包含核酸的核酸樣品接觸并使用所述核酸作為模板，來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增；(II)通過(guò)使單鏈核酸與探針接觸，獲得由所述單鏈核酸和探針形成的雜交體，所述單鏈核酸通過(guò)所述擴(kuò)增獲得，所述探針能夠檢測(cè)EGFR外顯子21中的多態(tài)性；(III)通過(guò)改變包含所述雜交體的樣品的溫度從而解離所述雜交體，測(cè)量基于所述雜交體的解離的信號(hào)的改變；(IV)基于所述信號(hào)變化測(cè)定作為解鏈溫度的、所述雜交體解離的溫度；和(V)基于所述解鏈溫度檢查EGFR外顯子21L858R的存在或評(píng)價(jià)具有EGFR外顯子 21L858R的核酸的豐度比。本發(fā)明的第三方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[14] [13]的方法，其中所述擴(kuò)增和所述雜交體的獲得同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明的第四方面的一個(gè)示例性實(shí)施方式是[15]評(píng)價(jià)EGFR酪氨酸激酶抑制劑的方法，所述方法包括用[13]或[14]的方法檢測(cè)EGFR基因中的多態(tài)性；和基于所述檢測(cè)的結(jié)果評(píng)價(jià)核酸樣品來(lái)源對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑的抗性，或 EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果。本發(fā)明的第五方面的一個(gè)示例性實(shí)施方式是[16]可用于在[13]或[14]的方法中的引物，所述引物是SEQ ID NO :2到SEQ ID NO 11中任一的Pl寡核苷酸，或SEQ ID NO: 12到SEQ ID NO 21中任一的P2寡核苷酸。本發(fā)明的第六方面的一個(gè)示例性實(shí)施方式是[17]包含[1]到[8]中任一的引物組的試劑盒。本發(fā)明的第六方面的另一個(gè)示例性實(shí)施方式是[18] [17]的試劑盒，其還包含能夠檢測(cè)EGFR外顯子21L858R的探針。


圖IA是核酸混合物解鏈曲線的例子。圖IB是核酸混合物的差異解鏈曲線的例子。圖2是標(biāo)準(zhǔn)曲線的例子。圖3是通過(guò)與本發(fā)明的實(shí)施例相關(guān)的引物組獲得的、不具有突變的核酸混合物的解鏈曲線。圖4是通過(guò)與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式相關(guān)的引物組獲得的、具有0. 突變含量的核酸混合物的解鏈曲線。圖5是通過(guò)與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式相關(guān)的引物組獲得的、具有0.3%突變含量的核酸混合物的解鏈曲線。圖6是通過(guò)與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式相關(guān)的引物組獲得的、具有突變含量的核酸混合物的解鏈曲線。
具體實(shí)施例方式引物組本發(fā)明一個(gè)方面的一個(gè)示例性實(shí)施方式的引物組檢測(cè)EGFR外顯子21中的多態(tài)性。引物組至少具有Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且能夠通過(guò)使用SEQ ID N0:1中的區(qū)域作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，其中所述區(qū)域至少具有SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基。Pl寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且具有胞嘧啶(C)作為與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基。P2寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且具有腺嘌呤(A)作為與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基。Pl寡核苷酸的解鏈溫度(Tm)高于P2寡核苷酸的解鏈溫度，和/或Pl寡核苷酸比 P2寡核苷酸長(zhǎng)一個(gè)或多個(gè)堿基。引物組具有下述Pl寡核苷酸和下述P2寡核苷酸，所述Pl寡核苷酸是突變型引物，其具有C作為與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基，并且可被用于檢測(cè)EGFR 外顯子21多態(tài)性，所述P2寡核苷酸是野生型引物，其具有A作為與SEQ ID NO :1的第 172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基，其中Pl寡核苷酸的解鏈溫度高于P2寡核苷酸，或Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸長(zhǎng)一個(gè)或多個(gè)堿基。通過(guò)在一個(gè)反應(yīng)體系中使用這兩種寡核苷酸作為引物， 可以容易地以高靈敏度檢測(cè)EGFR外顯子21的多態(tài)性?！癊GFR外顯子21L858R”在本文中表示EGFR基因外顯子21中的突變，其中密碼子 858中的亮氨酸被突變成精氨酸。“EGFR外顯子21的多態(tài)性”在本文中表示“EGFR外顯子21L858R”。"EGFR外顯子21的堿基序列”在本文中表示SEQ ID NO 1的序列，其為GenBank 登記號(hào) NC000007(版本:NC000007. 13)，55086724-55275030 的 Gene ID :1956。EGFR外顯子21L858R的突變?cè)诒疚闹斜硎鞠率鐾蛔?，其中SEQ IDNO :1的第 172792個(gè)堿基從胸腺嘧啶(T)突變成鳥嘌呤(G)。SEQ ID NO=I中所示堿基序列的第172792位被特定地稱作“突變位點(diǎn)”。“模板核酸序列”在本文中表示SEQ ID NO=I中所示的堿基序列作為模板的部分， 引物退火到其上，從而進(jìn)行核酸的擴(kuò)增。“解鏈溫度(Tm) ”表示雙鏈核酸解離的溫度。所述溫度通常被定義為下述溫度在所述溫度下波長(zhǎng)260nm處樣品的吸光度提高達(dá)到相對(duì)于通過(guò)提高樣品溫度所能夠到達(dá)的吸光度總提高而言的50%。即，加熱雙鏈核酸(例如DNA溶液)時(shí)，260nm處的吸光度提高。 這由于DNA的解鏈而發(fā)生，所述DNA的解鏈?zhǔn)沁@樣一種現(xiàn)象雙鏈DNA兩條鏈之間的氫鍵通過(guò)加熱而松開，隨后雙鏈DNA解離成單鏈DNA。當(dāng)所有雙鏈DNA解離并變成單鏈DNA時(shí)，其吸光度可以是加熱開始時(shí)吸光度(僅雙鏈DNA的吸光度)的約1. 5倍，從而可以確定解鏈的完成。Tm以所述現(xiàn)象為基礎(chǔ)來(lái)定義。術(shù)語(yǔ)“步驟”不僅包括獨(dú)立的步驟，也包括不能與另一步驟清楚區(qū)分的步驟，前提條件是實(shí)現(xiàn)了所述步驟的預(yù)期效果。使用“從……到……”表示數(shù)字范圍在本文中表示下述數(shù)值范圍，所述范圍包括作為最小值被標(biāo)明為范圍下限的數(shù)值，和作為最大值被標(biāo)明為范圍上限的數(shù)值。除非另有說(shuō)明，涉及組合物中組分含量時(shí)，如果組合物包含屬于組分范圍內(nèi)的多種物質(zhì)，則含量表示組合物中多種物質(zhì)含量的總和。引物組引物組至少具有Pl寡核苷酸(其為突變型引物)和P2寡核苷酸(其為野生型引物)。Pl寡核苷酸能夠通過(guò)使用SEQ ID NO 1中的區(qū)域作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，其中所述區(qū)域包括位于SEQ ID NO 1中第172792位突變位點(diǎn)處的堿基。Pl寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且具有胞嘧啶作為與SEQ ID NO :1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基。P2能夠通過(guò)使用SEQ ID NO=I中的區(qū)域作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，其中所述區(qū)域包括位于SEQ ID NO 1中第172792位突變位點(diǎn)處的堿基。P2寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且具有腺嘌呤作為與SEQ IDNO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基。Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸需要處于下述相關(guān)性中的至少一種P1寡核苷酸具有高于P2寡核苷酸的Tm，或Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸長(zhǎng)一個(gè)或多個(gè)堿基。滿足上述相關(guān)性中的至少一種時(shí)，Pl寡核苷酸可比P2寡核苷酸對(duì)模板核酸序列具有更高的親和力，并且可具有對(duì)模板核酸序列更強(qiáng)的結(jié)合特性。因此，通過(guò)使用Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者作為引物在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增核酸時(shí)，使用Pl寡核苷酸的擴(kuò)增可以是優(yōu)先的，并且由此能夠容易地以高靈敏度檢測(cè)突變型EGFR外顯子21的多態(tài)性?？梢詽M足關(guān)于Tm的相關(guān)性和關(guān)于堿基長(zhǎng)度的相關(guān)性之一或二者。當(dāng)Pl寡核苷酸具有高于P2寡核苷酸的Tm時(shí)，Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸之間的 Tm差異不被特別限制。例如，其可優(yōu)選地從0. 1°C到20°C，更優(yōu)選地從0. 1°C到10°C，進(jìn)一步更優(yōu)選地從0. 1°C到5°C。在該范圍內(nèi)，可以阻抑假陽(yáng)性。Tm在本文中表示雜交體的Tm， 所述雜交體由具有基本完全互補(bǔ)性的堿基序列組成。通過(guò)GC含量調(diào)節(jié)Tm時(shí)，可通過(guò)例如相對(duì)遞增的GC含量建立相對(duì)高的Tm。在實(shí)施方式中，可優(yōu)選將Pl寡核苷酸的GC含量設(shè)定為高于P2寡核苷酸的GC含量。或者，通過(guò)向寡核苷酸序列中并入例如修飾，來(lái)使用LNA作為RNA類似物、使用PNA作為肽核酸、使用 BNA作為交聯(lián)的核酸等等，可以將寡核苷酸的Tm設(shè)定為比不包括此類修飾的另一寡核苷酸相對(duì)更高。當(dāng)Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸長(zhǎng)一個(gè)或多個(gè)堿基時(shí)，Pl寡核苷酸具有更高的對(duì)模板序列的親合力。因此，與使用P2寡核苷酸的擴(kuò)增相比，使用Pl寡核苷酸的擴(kuò)增可優(yōu)先進(jìn)行?？蓛?yōu)選地如下實(shí)現(xiàn)關(guān)于Tm的相關(guān)性和關(guān)于堿基長(zhǎng)度的相關(guān)性P1寡核苷酸或P2 寡核苷酸中的至少一個(gè)，在不同于與SEQ ID NO :1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置上，具有至少一個(gè)與SEQ ID NO :1的堿基序列不互補(bǔ)的堿基。這可使得這些相關(guān)性能夠通過(guò)序列的構(gòu)建被調(diào)節(jié)。
可以通過(guò)針對(duì)與突變位點(diǎn)不同的位置處的非互補(bǔ)性堿基，選擇寡核苷酸中插入或添加的位置、堿基數(shù)量、堿基類型等等，來(lái)調(diào)節(jié)寡核苷酸的Tm或堿基長(zhǎng)度。基于此種考慮， 堿基可被置于Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中，或置于二者中。添加一個(gè)或多個(gè)堿基以延長(zhǎng)Pl寡核苷酸的長(zhǎng)度時(shí)，可優(yōu)選將堿基添加至突變位點(diǎn)的5’末端側(cè)的位點(diǎn)，以及，可更優(yōu)選地將堿基添加至與Pl寡核苷酸的模板核酸序列互補(bǔ)的區(qū)域的5’末端側(cè)的位點(diǎn)，從而可例如阻抑假陽(yáng)性。使得Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸更長(zhǎng)時(shí)，寡核苷酸之間的差異不受具特別限制。 在實(shí)施方式中，差異可以是1個(gè)堿基到20個(gè)堿基，優(yōu)選地1個(gè)堿基到10個(gè)堿基，更優(yōu)選地 1個(gè)堿基到5個(gè)堿基。被添加以延長(zhǎng)Pl寡核苷酸長(zhǎng)度的堿基可以與SEQ ID NO=I中所示堿基序列互補(bǔ)或不互補(bǔ)。當(dāng)堿基與SEQ ID NO :1中所示堿基序列不互補(bǔ)時(shí)，堿基可與下文闡述的額外的序列連續(xù)或不連續(xù)。當(dāng)每條寡核苷酸“能夠通過(guò)使用SEQ ID NO :1中的區(qū)域作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，其中所述區(qū)域包含SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基”時(shí)，這意味著使用寡核苷酸作為擴(kuò)增反應(yīng)例如PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的引物時(shí)，寡核苷酸退火至包括突變位點(diǎn)的預(yù)定區(qū)域上，并且能夠擴(kuò)增與具有突變位點(diǎn)的序列互補(bǔ)的序列。因此，每條寡核苷酸可以是與SEQ ID NO 1 中所示堿基序列完全互補(bǔ)的序列，與SEQ ID NO :1中所示堿基序列部分互補(bǔ)的序列，或具有部分不互補(bǔ)的堿基(錯(cuò)配堿基)的序列，只要其能夠退火至SEQ ID NO 1中所示堿基序列中包括突變位點(diǎn)的預(yù)定區(qū)域即可。錯(cuò)配堿基表示不形成G-C或A-T的正確配對(duì)的核酸堿基， 并且特定地表示產(chǎn)生G-G、G-A、G-T、A-A、A_C、C_T、C-C或T-T的錯(cuò)配堿基對(duì)的核酸堿基。例如，如下文所述，可優(yōu)選每條寡核苷酸是部分互補(bǔ)的序列，或是具有部分錯(cuò)配的堿基的序列，只要關(guān)于Tm的相關(guān)性或關(guān)于堿基長(zhǎng)度的相關(guān)性不被破壞即可。使用此類序列時(shí)，例如，檢測(cè)突變的靈敏度可被提高，并且假陽(yáng)性可被降低。每條寡核苷酸的長(zhǎng)度可以在從10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的范圍內(nèi)，并且可優(yōu)選地在從15個(gè)堿基到40個(gè)堿基的范圍內(nèi)，并可更優(yōu)選地在從18個(gè)堿基到25個(gè)堿基的范圍內(nèi)，只要上文所述關(guān)于Tm的相關(guān)性或關(guān)于堿基長(zhǎng)度的相關(guān)性不被損壞即可。在所述范圍內(nèi)的長(zhǎng)度例如可提高檢測(cè)靈敏度，并且高效地阻抑假陽(yáng)性。堿基長(zhǎng)度可與Pl寡核苷酸的其他結(jié)構(gòu)特征一起被調(diào)節(jié)。不互補(bǔ)的堿基(不是與突變位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基)可以是下述額外的序列，所述序列由連續(xù)的2到10個(gè)堿基形成，并且位于寡核苷酸鏈的5’末端。此類額外的序列例如可提高檢測(cè)靈敏度，或可阻抑假陽(yáng)性?？杀环謩e添加至Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸的額外的序列可以是與SEQ ID NO=I 中所示堿基序列不互補(bǔ)的3個(gè)堿基到10個(gè)堿基，優(yōu)選地4個(gè)堿基到9個(gè)堿基，更優(yōu)選地5 個(gè)堿基到7個(gè)堿基。對(duì)5’末端添加額外的序列時(shí)，例如可提高靈敏度，并且可高效地阻抑每條引物退火至每條其他模板核酸序列，或可提高擴(kuò)增效率。另外，當(dāng)額外的序列的長(zhǎng)度在所述范圍內(nèi)時(shí)，例如假陽(yáng)性可被阻抑，或擴(kuò)增效率可被提高。在Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中，額外的序列可以具有相同或不同的長(zhǎng)度，并且可具有相同或不同的堿基序列。在一些實(shí)施方式中，額外的序列具有不同的堿基序列可以是優(yōu)選的。額外序列的堿基序列的GC含量可優(yōu)選地從約40%到60%，但其不特別限于此。GC含量處于該范圍內(nèi)時(shí)，例如可維持突變型序列或野生型序列的擴(kuò)增效率。另外，對(duì)Pi寡核苷酸和P2寡核苷酸二者添加額外的序列時(shí)，Pl寡核苷酸的額外序列的GC含量可優(yōu)選地更高。在這種情況下，突變型序列檢測(cè)的靈敏度可被提高。Pl寡核苷酸可在其3’區(qū)中具有堿基(胞嘧啶)作為與EGFR外顯子21L858R的突變位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基。在Pl寡核苷酸中，可優(yōu)選地，3’末端中第1個(gè)到第3個(gè)堿基中的任一是與突變位點(diǎn)處堿基互補(bǔ)的堿基。當(dāng)與突變位點(diǎn)處堿基互補(bǔ)的堿基被置于此類位置中時(shí)， 例如檢測(cè)靈敏度可被提高，或假陽(yáng)性可被阻抑。注意，“3’末端的第1個(gè)堿基”在本文中表示3’末端的堿基，“3’末端的第3個(gè)堿基”表示當(dāng)3’末端被定義為第1個(gè)堿基時(shí)從3’到5’方向計(jì)數(shù)的第三個(gè)堿基。在另一方面，P2寡核苷酸可在其3’區(qū)具有堿基(腺嘌呤)作為與EGFR外顯子 21L858R的突變位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基。在Pl寡核苷酸中，可優(yōu)選地，3’末端中第1個(gè)到第3個(gè)堿基中的任一是與突變位點(diǎn)處堿基互補(bǔ)的堿基。當(dāng)與突變位點(diǎn)處堿基互補(bǔ)的堿基被置于此類位置中時(shí)，例如，檢測(cè)靈敏度可被提高，或假陽(yáng)性可被阻抑。Pl寡核苷酸中與突變位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基與3’末端的距離(堿基位置)可與P2寡核苷酸中的相同或不同。在一些實(shí)施方式中，Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中與突變位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基到3’末端的距離可優(yōu)選地是相同的。當(dāng)Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中的距離相同時(shí)，例如，檢測(cè)靈敏度可被提高或假陽(yáng)性可被阻抑。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)堿基或連續(xù)的2-20個(gè)堿基可以是錯(cuò)配堿基，其為位于不是寡核苷酸鏈中突變位點(diǎn)之處的不互補(bǔ)的堿基。引入此類錯(cuò)配堿基時(shí)，例如，檢測(cè)靈敏度可被提高或假陽(yáng)性可被阻抑。盡管此類錯(cuò)配堿基的總數(shù)可根據(jù)組成每條寡核苷酸的堿基序列而變化，但是總數(shù)可優(yōu)選地為10個(gè)或更少、更優(yōu)選地為5個(gè)或更少、進(jìn)一步更優(yōu)選地為3個(gè)或更少。當(dāng)錯(cuò)配堿基的數(shù)量在此類范圍內(nèi)時(shí)，這可以是有利的，例如，檢測(cè)靈敏度可被提高或假陽(yáng)性可被阻抑。此類錯(cuò)配堿基可優(yōu)選地被置于突變位點(diǎn)5’末端側(cè)的位置中。特別地，位于突變位點(diǎn)5’末端側(cè)第3個(gè)到第7個(gè)堿基中的至少1個(gè)堿基可優(yōu)選地被制成錯(cuò)配堿基，位于突變位點(diǎn)5’末端側(cè)第3個(gè)到第5個(gè)堿基中的至少1個(gè)堿基可更優(yōu)選地被制成錯(cuò)配堿基。使用此類位置時(shí)，例如，檢測(cè)靈敏度可被提高或假陽(yáng)性可被阻抑。當(dāng)Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者均具有錯(cuò)配堿基時(shí)，可優(yōu)選地，Pl寡核苷酸中錯(cuò)配堿基的位置與P2寡核苷酸中錯(cuò)配堿基的位置不彼此對(duì)應(yīng)。錯(cuò)配堿基的位置可以是不同的。其可優(yōu)選地偏離1-6個(gè)堿基，更優(yōu)選地偏離2-3個(gè)堿基。另外，例如當(dāng)Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸均具有錯(cuò)配堿基時(shí)，可優(yōu)選地與P2寡核苷酸中錯(cuò)配堿基的位置相比，Pl寡核苷酸中錯(cuò)配堿基的位置處于更遠(yuǎn)的3’末端側(cè)。當(dāng)Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中錯(cuò)配堿基的位置這樣相關(guān)時(shí)，例如，假陽(yáng)性可被阻抑。與SEQ ID NO=I中所示堿基序列不互補(bǔ)的任何堿基可被用作錯(cuò)配堿基。在實(shí)施方式中，腺嘌呤㈧或胸腺嘧啶⑴可由于它們相對(duì)弱的結(jié)合活性而是優(yōu)選的。使用“A”或 “T”時(shí)，例如，假陽(yáng)性可被阻抑。注意在EGFR外顯子21的突變位點(diǎn)周圍存在多態(tài)性，這與本文要檢測(cè)的多態(tài)性不相關(guān)。需要時(shí)可向Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者中不是檢測(cè)靶標(biāo)的堿基添加突變，從而使得由此類無(wú)關(guān)多態(tài)性導(dǎo)致的影響無(wú)效。此類堿基在本文中被稱作“無(wú)效突變”?？稍赑l寡核苷酸和P2寡核苷酸二者或之一中添加額外的序列。另外，可在Pl寡
核苷酸或P2寡核苷酸二者或之一中添加錯(cuò)配堿基。用于多態(tài)性檢測(cè)的引物組包括至少一個(gè)Pl寡核苷酸和至少一個(gè)P2寡核苷酸。在
實(shí)施方式中，引物組中可包括兩個(gè)或更多的Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者或之一，只要上
文所述關(guān)于Tm的相關(guān)性或關(guān)于堿基長(zhǎng)度的相關(guān)性通常不被破壞即可。Pl寡核苷酸的例子在表1中展示，P2寡核苷酸的例子在表2中展示。注意表1
和2中的下劃線的“A”或“T”表示錯(cuò)配堿基，5’末端側(cè)的大寫字母表示額外的序列。表1
和表2中各寡核苷酸3’末端的堿基是與突變位點(diǎn)處的堿基互補(bǔ)的堿基。另外，表1和表2
中的“(a)，，表示無(wú)效突變。注意Tm用MELTCALC 計(jì)算。表 權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)EGFR外顯子21中多態(tài)性的引物組，所述引物組包含Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且所述引物組能夠通過(guò)使用SEQ ID NO :1中的區(qū)域作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，所述區(qū)域包含SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基，所述Pl寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且具有胞嘧啶作為與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基，所述P2寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且具有腺嘌呤作為與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基，和所述Pl寡核苷酸和所述P2寡核苷酸滿足下述相關(guān)性中的至少一種所述Pl寡核苷酸的解鏈溫度高于P2寡核苷酸的解鏈溫度；或所述Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸長(zhǎng)一個(gè)或多個(gè)堿基。
2.權(quán)利要求1所述的引物組，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個(gè)在不同于與SEQ ID NO :1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含至少一個(gè)與SEQ ID NO 1的堿基序列不互補(bǔ)的堿基。
3.權(quán)利要求1所述的引物組，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個(gè)在不同于與SEQ ID NO :1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含額外的序列，所述額外的序列由連續(xù)的2到10個(gè)不與SEQ IDNO 1的堿基序列互補(bǔ)的堿基形成，并且位于寡核苷酸鏈的5'末端。
4.權(quán)利要求1所述的引物組，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個(gè)在同于與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含錯(cuò)配堿基或包含與SEQ ID NO 1的堿基序列不互補(bǔ)的2到20個(gè)錯(cuò)配堿基的序列。
5.權(quán)利要求1所述的引物組，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個(gè)在從其3'末端起的第1位到第3位中的一處包含與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基。
6.權(quán)利要求1所述的引物組，其中所述Pl寡核苷酸的解鏈溫度比所述P2寡核苷酸的解鏈溫度高0. 1°C到20°C。
7.權(quán)利要求1所述的引物組，所述引物組還包含與下述序列同源的引物，所述序列處于位于SEQ ID NO :1堿基序列中的模板核酸序列的5'末端側(cè)的區(qū)域中，其中所述模板核酸序列與所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸互補(bǔ)。
8.權(quán)利要求1所述的引物組，所述引物組包含SEQID NO 2到SEQID NO 11的寡核苷酸中的至少一個(gè)作為Pl寡核苷酸，和SEQ ID N0:12到SEQ ID NO :21的寡核苷酸中的至少一個(gè)作為P2寡核苷酸。
9.用于檢測(cè)EGFR外顯子21中多態(tài)性的引物，所述引物能夠通過(guò)使用SEQID NO :1中的區(qū)域作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，所述區(qū)域包含SEQ ID NO :1的第172792個(gè)堿基，并且，所述引物是下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有10個(gè)堿基到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且具有胞嘧啶作為與 SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基。
10.權(quán)利要求9所述的引物，所述引物在不同于與SEQID NO :1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含至少一個(gè)與SEQ ID NO :1的堿基序列不互補(bǔ)的堿基。
11.權(quán)利要求9所述的引物，所述引物在不同于與SEQID NO :1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基位置的位置包含一個(gè)或多個(gè)與SEQ ID NO :1的堿基序列不互補(bǔ)的堿基，所述一個(gè)或多個(gè)不互補(bǔ)的堿基選自由下組，所述組由額外的序列，所述序列由連續(xù)的2到10個(gè)堿基形成，且位于所述引物5'末端； 錯(cuò)配堿基；和2到20個(gè)錯(cuò)配堿基的序列組成。
12.權(quán)利要求9所述的引物，所述引物在從其3'末端起的第1位到第3位中的一處包含與SEQ ID NO 1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基。
13.檢測(cè)EGFR基因中多態(tài)性的方法，所述方法包括(I)通過(guò)使權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的引物組與包含核酸的核酸樣品接觸并且使用所述核酸作為模板來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增；(II)獲得單鏈核酸和探針形成的雜交體，這通過(guò)使所述單鏈核酸與所述探針接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述單鏈核酸通過(guò)所述擴(kuò)增獲得，所述探針能夠檢測(cè)EGFR外顯子21中的多態(tài)性；(III)通過(guò)改變包含所述雜交體的樣品的溫度從而解離所述雜交體，測(cè)量基于所述雜交體解離的信號(hào)的改變；(IV)基于所述信號(hào)變化測(cè)定作為解鏈溫度的、所述雜交體解離的溫度；和(V)基于所述解鏈溫度檢查EGFR外顯子21L858R的存在或評(píng)價(jià)具有EGFR外顯子 21L858R的核酸的豐度比。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述擴(kuò)增和所述雜交體的獲得同時(shí)進(jìn)行。
15.評(píng)價(jià)EGFR酪氨酸激酶抑制劑的方法，所述方法包括 用權(quán)利要求13所述的方法來(lái)檢測(cè)EGFR基因中的多態(tài)性；和基于所述檢測(cè)的結(jié)果評(píng)價(jià)核酸樣品來(lái)源對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑的抗性，或EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果。
16.可用于權(quán)利要求13所述的方法中的引物，所述引物是SEQID NO :2到SEQ ID NO 11中任一條的Pl寡核苷酸，或SEQ ID NO 12到SEQ IDNO 21中任一條的P2寡核苷酸。
17.包含權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的引物組的試劑盒。
18.權(quán)利要求17所述的試劑盒，其還包含能夠檢測(cè)EGFR外顯子21L858R的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測(cè)EGFR外顯子21多態(tài)性的引物組及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)EGFR外顯子21L858R中多態(tài)性的引物組。所述引物組具有P1寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且可通過(guò)使用包括SEQ ID NO1的第172792個(gè)堿基的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。作為與SEQ ID NO1的第172792個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基，P1寡核苷酸具有胞嘧啶，P2寡核苷酸具有腺嘌呤。P1寡核苷酸的解鏈溫度高于P2寡核苷酸的解鏈溫度，和/或P1寡核苷酸比P2寡核苷酸長(zhǎng)一個(gè)或多個(gè)堿基。本發(fā)明還提供了多態(tài)性檢測(cè)引物，使用所述引物組的多態(tài)性檢測(cè)方法，使用所述引物組評(píng)價(jià)EGFR酪氨酸激酶抑制劑的方法，多態(tài)性檢測(cè)方法中使用的引物和包括所述引物組的試劑盒。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102453764SQ20111034176
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者井口亞希 申請(qǐng)人:愛科來(lái)株式會(huì)社