專利名稱：青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子是真核生物所獨(dú)有的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有堿性/螺旋-環(huán)-螺旋元件，該轉(zhuǎn)錄因子可以與特異順式元件E-box(CANNTG)結(jié)合并參與轉(zhuǎn)錄。研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中普遍存在。在動(dòng)物體內(nèi)，bHLH家族蛋白在生物的生長發(fā)育調(diào)控過程中起著極為重要的作用，它們參與調(diào)控神經(jīng)元發(fā)生、肌細(xì)胞生成、血細(xì)胞生成、 性別決定和腸組織發(fā)育。在植物中，對bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在生化和次生代謝兩個(gè)方面。例如，它參與擬南芥皮毛的分化，并且可以調(diào)控光調(diào)控基因比如CCAl (circadlan clock associated 1)和LHY(late elongated hypocotyl)的表達(dá)。在植物次生代謝研究中發(fā)現(xiàn)， 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)控制常常能夠改變次生代謝物的代謝途徑。比如，bHLH轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)可以使花青素在矮牽牛植株內(nèi)各個(gè)組織中積累；在擬南芥和玉米中也有相似的情況。同時(shí)在對玉米黃酮類生物合成途徑的遺傳分析中發(fā)現(xiàn)bHLH基因家族調(diào)控黃酮類基因的表達(dá)。藥用植物青蒿合成一種倍半萜類次生代謝產(chǎn)物青蒿素，它是我國首創(chuàng)的新型抗瘧疾藥，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為21世紀(jì)替代奎寧的最有效的抗瘧疾藥物。同時(shí)，進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)青蒿素還具有抗癌活性。目前青蒿素的主要來源還是仍然是通過傳統(tǒng)工藝從植物青蒿中進(jìn)行提取，但是植物中青蒿素的含量只有干重的0. -0.8%，無法滿足國內(nèi)外疾病治療的需求。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素合成量的多少主要是由其合成途徑中的多個(gè)合成酶活性表達(dá)所決定的，這些合成酶的活性表達(dá)受到相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子及其它調(diào)控基因的調(diào)節(jié)，其中，轉(zhuǎn)錄因子對合成基因的轉(zhuǎn)錄激活是植物次生代謝最為重要的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)之一。轉(zhuǎn)錄因子通過激活植物次生代謝物合成途徑中多個(gè)合成基因的表達(dá)，可有效地啟動(dòng)或關(guān)閉次生代謝合成途徑， 從而調(diào)節(jié)特定次生代謝物的合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。本發(fā)明所提供的青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子，名稱為AabHLHl，來源于青蒿(Artemisia annua)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與青蒿素合成相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，為如下1)或2)或3)所示1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；
3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中序列1由1950個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列表中序列2由649個(gè)氨基酸殘基組成。含有所述青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體為在表達(dá)載體pBI122的多克隆位點(diǎn)插入所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。擴(kuò)增所述青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。所述青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子、所述編碼基因、所述重組表達(dá)載體或所述表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在如下1)或2)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍1)提高與促進(jìn)青蒿素合成相關(guān)的酶的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用；2)降低與抑制青蒿素合成相關(guān)的酶的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用。所述1)中的應(yīng)用為提高植物組織中與促進(jìn)青蒿素合成相關(guān)的酶的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用；所述2)中的應(yīng)用為降低植物組織中與抑制青蒿素合成相關(guān)的酶的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用；所述植物組織為青蒿葉片。所述與促進(jìn)青蒿素合成相關(guān)的酶為紫穗槐二烯合酶、青蒿醛Δ 11 (13)雙鍵還原酶、細(xì)胞色素Ρ450單加氧酶或醛脫氫酶；所述與抑制青蒿素合成相關(guān)的酶為二氫青蒿醛還原酶。所述青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子、所述編碼基因、所述重組表達(dá)載體或所述表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備青蒿素中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明通過酵母單雜交分析證明bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以與特異順式元件 Ε-box (CANNTG)結(jié)合并參與轉(zhuǎn)錄。將該bHLH轉(zhuǎn)錄因子瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到青蒿植株內(nèi)過表達(dá)，其所調(diào)控的青蒿素生物合成代謝中的關(guān)鍵酶表達(dá)量大幅度提高，可以用來生產(chǎn)青蒿素。本發(fā)明調(diào)控青蒿素合成的方法解決了原料的限制問題，且生產(chǎn)工藝簡單，有利于青蒿素的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。相比一般的用關(guān)鍵酶進(jìn)行青蒿植株基因工程改造，通過bHLH轉(zhuǎn)錄因子對青蒿素次生代謝途徑調(diào)節(jié)有諸多優(yōu)點(diǎn)1)克服了酶底物的負(fù)反饋?zhàn)饔茫?)可以激活青蒿素代謝支路中多個(gè)基因的協(xié)同表達(dá)；幻轉(zhuǎn)錄因子還可激活不同植物中相似次生代謝反應(yīng)途徑。因此，以bHLH轉(zhuǎn)錄因子為工具對青蒿進(jìn)行次生代謝調(diào)控?zé)o疑具有較大的優(yōu)勢。


圖1為pET: AabHLHl原核表達(dá)載體的示意圖。
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圖2為AabHLHl蛋白EMSA電泳圖。圖 3 為 pHIS-E_boxX3 和 pGADT7 AabHLHl 載體示意圖。圖4為AabHLHl在酵母細(xì)胞中與E_box的相互作用。圖5為pBI AabHLHl植物表達(dá)載體示意圖。圖6為青蒿素生物合成途徑示意圖。圖7為AabHLHl瞬時(shí)轉(zhuǎn)化青蒿葉片后對青蒿素代謝合成途徑關(guān)鍵酶進(jìn)行的半定量 RT-PCR分析。CK, pBI121對照；1，AabHLHl瞬時(shí)轉(zhuǎn)化青蒿。圖8為亞細(xì)胞定位植物表達(dá)載體pBI AabHLHl-GFP的示意圖。圖9為AabHLHl的核定位分析結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、與青蒿素合成相關(guān)蛋白及其編碼基因的獲得與功能驗(yàn)證一、獲得與青蒿素合成相關(guān)蛋白及其編碼基因AabHLHl使用天根生物技術(shù)公司植物RNA提取試劑盒提取青蒿(Artemisia annua)(青蒿種子采集自中國重慶市酉陽地區(qū))植株的葉片的總RNA，采用天根生物技術(shù)公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以該cDNA為模板PCR擴(kuò)增AabHLHl轉(zhuǎn)錄因子基因。PCR擴(kuò)增所用引物為PEl和PE2，PEl和PE2的核苷酸序列如下PEl :5，-GATAAGCTTGCATGACGGAGTACCGCATGAATC-3> (下劃線部分表示 HindIII 識(shí)別位點(diǎn))；PE2 :5，-GTAGCGGCCGCCTACAGCTTCGCTAATTGCCTTAAC-3’ (下劃線部分表示 NotI 識(shí)別位點(diǎn))。PCR 反應(yīng)條件為95°C變性 4min ;94°C 30s,54°C 30s,72°C 90s，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin。PCR擴(kuò)增出1950bp的片段，回收后經(jīng)過Hindlll/NotI雙酶切后連接到pET30a載體(購自Novagen公司，產(chǎn)品目錄號69909. 3)上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET: =AabHLHl (圖 1)。將重組質(zhì)粒pET::AabHLHl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(購自hvitrogen公司，產(chǎn)品目錄號 C6000-03)，以PEl和PE2為引物PCR鑒定陽性克隆，擴(kuò)增出1950bp片段的克隆為陽性克隆，命名為BL21-AabHLHl。提取陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，克隆得到的cDNA 序列如序列表中序列1所示，序列表中的序列1由1950個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列 2所示的蛋白質(zhì)。序列表中序列2由649個(gè)氨基酸殘基組成。將該基因命名為AabHLHlJf 其編碼的蛋白命名為AabHLHl。二、AabHLHl蛋白體外轉(zhuǎn)錄活性凝膠阻滯檢測挑取BL21-AabHLHl單克隆接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6，加入IPTG使其終濃度為0. lmmol/L, 16°C誘導(dǎo)培養(yǎng)Mh。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后12000rpm離心 2mim 收集菌體，適量 Binding Buffer A(pH 8. 0 的 25mM Tris-HCL，250mM 氯化鉀，5mM 咪唑，2mM巰基乙醇)重懸菌體，冰浴中超聲破碎，然后12000rpm離心20min，將上清轉(zhuǎn)移至用 binding buffer平衡好的Ni-瓊脂糖柱(購于Novogen公司)中，用5X柱體積bindingbuffer 洗柱，再用 5 X 柱體積 washing buffer (25mM Tris_HCL，pH 8. 0，250mM氯化鉀，20mM 咪唑，2mM 巰基乙醇)洗柱，最后用 3ml elution buffer (pH 8· 0 的 25mM Tris-HCL, 250mM 氯化鉀，500mM咪唑，2mM巰基乙醇)洗脫目的蛋白，收集洗脫液。凝膠阻滯方法是參照 invitrogen 公司 Electrophoretic Mobility Shift Assay 試齊U盒。 順式元件3 X E-box序列正義序列5，AATGCAAATGTTGGGGAGCACGTGTTGGGGAGCACATGGGGAG-3，，反義序列5’ TCCCCATGTGCTCCCCAACACGTGCTCCCCAACATTTGCATT-3’ (下劃線部分是 Ε-box 序列)。取5 μ 1正義和反義序列于0. 5ml的離心管中，力Π滅菌水25 μ 1，IM Tris-HCl (pH7. 6) 28 μ 1, IM MgCl2 5. 6 μ 1, IOOmM EDTA 5. 6 μ 1。然后將混合物在 95°C 下反應(yīng)5min，然后65°C退火10min，37°C保溫lOmin。然后在離心管中加入220 μ 1乙醇，-70°C 沉淀30min至2h之后，12，OOOrpm下離心15min,棄上清。加70%乙醇100 μ 1，12，OOOrpm 下離心5min，棄上清后超凈臺(tái)吹干，重新溶于20 μ 1 ddH20中。順式元件DNA與蛋白反應(yīng)體系組分為DNA(50ng/y 1)4μ 1，Binding Buffer B 3 μ 1，蛋白(25ng/y 1)2-5 泳道分別加 2 μ 1、3. 5 μ 1、5 μ 1 和 7μ 1，用 ddH20 補(bǔ)足 15 μ 1。 其中 Binding Buffer B 成分是20mmol Tris-HCl (pH7. 6),30mmol KC1,0. 2% (w/v) Tween 20，lmmol dithiothreitol (DTT)，IOmmol (NH4) 2S04。DNA 與蛋白在室溫下反應(yīng) 30min,然后跑6%的非變性聚苯酰胺凝膠電泳。泳道1只加E-boxX3元件順式元件DNA ；在泳道2_5 加濃度遞增的AabHLHl蛋白與E_box X 3元件順式元件DNA室溫溫育后的混合物；泳道6加濃度和泳道5相同的AabHLHl重組蛋白；泳道7加BSA牛血清蛋白與E_box X 3元件順式元件DNA室溫溫育混合物作為陰性對照。電泳池之后，凝膠首先用STOR Green EMSA stain 染DNA，凝膠成像儀拍照后，用SYPRO Ruby EMSA stain染蛋白，凝膠成像儀拍照。結(jié)果如圖 2所示，圖2中A為SYBR Green EMSA stain染后的凝膠，只有DNA成像；圖2中B為SYPRO Ruby EMSA stain染后的凝膠，只有蛋白成像。從圖2可見，E_box順式元件可以與AabHLHl 蛋白結(jié)合，形成DNA-蛋白復(fù)合物，其電泳移動(dòng)速度介于DNA和蛋白之間，并且DNA-蛋白復(fù)合物隨著蛋白量的增加而遞增。用牛血清蛋白作對照，E-box順式元件并不與其發(fā)生特異識(shí)別和結(jié)合。三、AabHLHl的酵母單雜交分析在酵母單雜交體系中，轉(zhuǎn)錄因子蛋白被稱作prey (捕獵蛋白)，而該蛋白要結(jié)合的 DNA元件被稱作bait (順式元件誘餌)，通過讓prey是否主動(dòng)與bait發(fā)生結(jié)合來說明轉(zhuǎn)錄因子是否具備識(shí)別特異DNA順式元件的能力。1、Bait酵母表達(dá)載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)帶有粘性末端的3倍E-Box和帶有突變位點(diǎn)的miE-b0X和m2E-box寡聚脫氧核苷酸序列(表1)，連接到用EcoRI和Mel酶切之后的pHIS 2. 1 (購自clontech 公司，產(chǎn)品目錄號630304)，分別構(gòu)建得到三個(gè)hit載體pHIS-E-boXX3(圖3中A)、 PHIS-Iii1E X 3-box 和 pHIS_m2EX 3_box2，并進(jìn)行測序驗(yàn)證無誤。
表1 中為擴(kuò)增 AabHLHl 基因 ORF 引物(bHLHlY-S 和 bHLHlY-A)和 3XE_box 寡聚脫氧核苷酸序列(下劃線表示限制性內(nèi)切酶消化位點(diǎn)和3XE-box以及突變位點(diǎn)序列)。表1擴(kuò)增AabHLHl Orf引物和3xE_box序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與青蒿素合成相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3) 所示1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或其任一片段的引物對，所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
6.權(quán)利要求1所述的蛋白在作為轉(zhuǎn)錄因子中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因或權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在如下1)或幻中的應(yīng)用1)提高與促進(jìn)青蒿素合成相關(guān)的酶的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用；2)降低與抑制青蒿素合成相關(guān)的酶的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述1)中的應(yīng)用為提高植物組織中與促進(jìn)青蒿素合成相關(guān)的酶的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用；所述幻中的應(yīng)用為降低植物組織中與抑制青蒿素合成相關(guān)的酶的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用；所述植物組織為青蒿葉片。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述與促進(jìn)青蒿素合成相關(guān)的酶為紫穗槐二烯合酶、青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶、細(xì)胞色素Ρ450單加氧酶或醛脫氫酶；所述與抑制青蒿素合成相關(guān)的酶為二氫青蒿醛還原酶。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因或權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備青蒿素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的青蒿bHLH轉(zhuǎn)錄因子，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與青蒿素合成相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明將bHLH轉(zhuǎn)錄因子瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到青蒿植株內(nèi)過表達(dá)，其所調(diào)控的青蒿素生物合成代謝中的關(guān)鍵酶表達(dá)量大幅度提高，可以用來生產(chǎn)青蒿素。本發(fā)明調(diào)控青蒿素合成的方法解決了原料的限制問題，且生產(chǎn)工藝簡單，有利于青蒿素的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/21GK102372769SQ201110344258
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者冀云鵬, 李星, 王紅, 郝鶴, 馬東明 申請人:中國科學(xué)院研究生院