專利名稱：：昆蟲抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及昆蟲抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物在完成其生活史的過程中，隨時(shí)面臨著環(huán)境病原微生物的威脅。在全球范圍內(nèi)，由細(xì)菌、真菌和病毒引起的植物病害所造成農(nóng)作物產(chǎn)量的損失每年高達(dá)300-500億美元。化學(xué)藥劑防治仍是控制農(nóng)作物病害的一項(xiàng)重要策略，但這一策略給人類健康和環(huán)境保護(hù)帶來明顯的威脅。傳統(tǒng)育種方法對抗病品種選育做出了最為重要的貢獻(xiàn)，但由于植物本身抗病基因有限和單個(gè)抗病基因所介導(dǎo)的抗病性具有高度?；?，抗病譜較窄，只能抗有限的小種，以致病原菌群體發(fā)生變化時(shí)，就面臨抗性喪失的風(fēng)險(xiǎn)，從而無法滿足農(nóng)作物病害防治的需要。如何將當(dāng)今各種生物基因組的豐富資源和高效的基因操作技術(shù)，系統(tǒng)地應(yīng)用于農(nóng)作物抗性的改良，是當(dāng)今轉(zhuǎn)基因工程的一個(gè)熱點(diǎn)和焦點(diǎn)問題。更為重要的是，植物基因工程可以在不改變植物已有優(yōu)異基因型的情況下引入抗病性表型，為獲得新的抗病品種提供了更為強(qiáng)大的手段，成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的重要策略之一。植物本身可產(chǎn)生多種抗菌肽，但研究發(fā)現(xiàn)植物來源的抗菌肽基因的表達(dá)只對病原菌產(chǎn)生中等程度抗性，這是由于經(jīng)過長期的病原與寄主的相互作用和進(jìn)化，植物病原菌已經(jīng)對這些植物抗菌肽產(chǎn)生了耐受性。因此，非植物來源的抗菌肽基因在植物抗病領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到重視。昆蟲抗菌肽對細(xì)菌、真菌、病毒等表現(xiàn)廣譜抗性，抗菌性強(qiáng)、抗菌效果快。據(jù)Shai-Matsuzaki-Huanf模型，多數(shù)抗菌肽的作用機(jī)制都是基于多肽與磷脂相互作用引起細(xì)胞膜破裂而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。由于抗菌肽作用于磷脂類而非酶類，因此，很少有病原對抗菌肽產(chǎn)生抗性。這些特點(diǎn)使得抗菌肽在培育抗性作物方面具有誘人的潛力。目前已發(fā)現(xiàn)昆蟲抗菌肽可以抑制許多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中非常重要的植物病原真菌和細(xì)菌，如白粉病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢等真菌和丁香假單孢菌、胡蘿卜軟腐歐氏桿菌、水稻白葉枯病菌等細(xì)菌。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗菌肽導(dǎo)入植物中表達(dá)，可使作物對植物病原細(xì)菌和真菌產(chǎn)生有效抗性。在我國，已有將抗菌肽基因在馬鈴薯、煙草、水稻、辣椒、番茄等植物中成功表達(dá)并獲得抗病株系的報(bào)道。然而，目前應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物中的昆蟲抗菌肽主要是天蠶素基因，而其他絕大多數(shù)抗菌肽在轉(zhuǎn)基因植物中的抗病功能還沒有測試。Thanatin是目前發(fā)現(xiàn)的最小的抗菌肽，僅含有21個(gè)氨基酸殘基，它來自于半翅目昆蟲刺肩蝽(Podisusmaculiventris)。Hianatin具有廣譜的抗菌活性，對真菌、G+和G-均表現(xiàn)出抗菌活性(FehlbaumPP,Buletetal.(1994).“Insectimmunity.S印ticinjuryofDrosophilainducesthesynthesisofapotentantifungalpeptidewithsequencehomologytoplantantifungalpeptides."JBiolChem269(52)33159-63.)。其氨基酸序列為GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM，前三個(gè)氨基酸對抗菌活性影響不大，而后六個(gè)氨基酸(C端疏水區(qū))形成一個(gè)環(huán)，對抗菌活性影響較大；對不同的菌具有濃度效應(yīng)?？赡茏饔糜诩?xì)菌的脂多糖，形成沉淀。將T換成S或去除，活性增強(qiáng)(Wu，G.Q.，J.X.Ding,etal.,2009)0沒有溶血性，對人和動(dòng)物沒有毒性。目前，對于Thanatin在植物病害控制方面研究的較少。擬南芥(Arabidopsisthaliana)屬十字花科，基因組很小，但其2.5萬基因在功能類別上卻和其他開花植物大致相似；擬南芥生命周期很短，從播種到種子收獲僅需要68周；擬南芥?zhèn)€體較小，適合于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)種植；這些特點(diǎn)使得擬南芥成為一種理想的植物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究材料。此外，擬南芥在接種條件下可以被多種不同的植物病原細(xì)菌、真菌及病毒等侵染，這非常有利于研究植物與病原菌互作。小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，對其進(jìn)行基因工程操作以提高其抗病能力將對小麥的抗病育種起到較大的推動(dòng)作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種昆蟲抗菌肽thanatin(S)融合蛋白。本發(fā)明所提供的融合蛋白，名稱為ChtSP-Thanatin(S)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；幻將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述融合蛋白的編碼基因。本發(fā)明所提供的所述融合蛋白的編碼基因(命名為ChtSP-Thanatin(S)),為如下1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼所述融合蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述融合蛋白的基因。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC,0.5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。序列表中的序列1由123個(gè)堿基組成，自5’端第1位_60位為水稻幾丁質(zhì)酶Cht-I的信號肽的編碼序列，第61位-123位為昆蟲抗菌肽thanatin(S)的編碼序列。含有所述編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體為在pGWBll載體的attR位點(diǎn)插入了所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體為在pAHC25載體的SmaI和McI酶切位點(diǎn)間插入了所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述編碼基因轉(zhuǎn)入目的植物中，得到與所述目的植物相比，抗病菌能力提高的轉(zhuǎn)基因植物。所述編碼基因是通過權(quán)所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥；所述單子葉植物為小麥。fff^MM^lM^^Y^f^M(Golovinomycescichoracearum)>^(Botrytiscinerea)、丁香假單胞桿菌番爺致病變種(Pseudomonassyrmgaepv.tomato)禾口/或小麥白粉菌(Erysiphegrammis)。將水稻幾丁質(zhì)酶Cht-I的信號肽連接到thanatin(S)的N端，并對這一融合結(jié)構(gòu)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其有利于在植物中高表達(dá)，隨后，將其構(gòu)建到(Gateway載體系列的pGWBll(C端連FLAG標(biāo)簽)以及小麥轉(zhuǎn)化載體pAHC25中?？共⌒詸z測的結(jié)果顯示，ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因植物對白粉病菌(Golovinomycescichoracearum禾口Erysiphegrammis)、灰霉菌(Botrytiscinerea)及丁香假單胞菌(Pseudomonassyrmgae)皆具有明顯的抗性。證明thanatin(S)在控制植物真菌和細(xì)菌病害方面效果顯著，具有一定應(yīng)用前景。本發(fā)明采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將序列表中序列1所示的融合基因轉(zhuǎn)入植物提高植物的抗病性，這是傳統(tǒng)育種技術(shù)所無法做到的。本發(fā)明利用植物源外的基因來提高植物的抗病性，為植物病害控制提供了一條新途徑，若將其融入到作物育種程序?qū)⒂袕V闊的前景。圖1為ChtSP-Thanatin(S)融合基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)分析結(jié)果；其中，圖1中A為重組載體pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)的部分結(jié)構(gòu)示意圖；圖1中B為對轉(zhuǎn)基因擬南芥植株Tl的15個(gè)株系用PCR檢測Thanatin(S)基因整合到基因組上的結(jié)果；圖1中C為對轉(zhuǎn)基因擬南芥植株T2的7個(gè)株系用real-timePCR檢測Hianatin(S)基因轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果；圖1中D為選擇轉(zhuǎn)錄水平較高的3個(gè)株系用westernblot技術(shù)檢測ChtSP-Thanatin(S)-FLAG的蛋白水平表達(dá)結(jié)果。圖2為ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因擬南芥對白粉菌抗性的檢測結(jié)果；其中，圖2中A為接種后12天轉(zhuǎn)基因擬南芥lineKline6和line7和野生型Col-O感染白粉菌的表型結(jié)果；圖2中B為接種后6天擬南芥葉片上的原始單孢子；圖2中C為擬南芥葉片上單孢所產(chǎn)生的孢子數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖3為ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因擬南芥對灰霉菌的抗性檢測結(jié)果；其中，圖3中A為轉(zhuǎn)基因擬南芥lineKline6和line7以及野生型對照Col-O的表型，圖3中B為轉(zhuǎn)基因擬南芥lineKline6和line7以及野生型對照Col-O的病斑面積的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。圖4ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因擬南芥對丁香假單胞桿菌番茄致病變種DC3000的抗性檢測結(jié)果；其中，圖4中A為轉(zhuǎn)基因擬南芥line1、line6和line7以及野生型對照Col-O的葉片接種后2天的表型，圖4中B為轉(zhuǎn)基因擬南芥lineKline6和line7以及野生型對照Col-O葉片接種后2天化學(xué)發(fā)光光子數(shù)的測定結(jié)果。圖5為重組載體ρAHC25=ChtSP-Thanatin(S)-FLAG的部分結(jié)構(gòu)示意圖。圖6轉(zhuǎn)ChtSP-Thanatin(S)-FLAG融合基因的小麥接種小麥白粉菌(Erysiphegrammis)7天后的抗病表型。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例一、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及其檢測-,ChtSP-Thanatin(S)融合基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)分析1、遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建采用的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體為gateway系列中的pGWBll載體(公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是=Nakagawa,T.，Kurose,T.，Hino,T.，Tanaka,K.，Kawamukai,M.，Niwa,Y.，Toyooka,K.，Matsuoka,K.，Jinbo,T.andKimura，Τ.(2007)Developmentofseriesofgatewaybinaryvectors,pGWBs,forrealizingefficientconstructionoffusiongenesforplanttransformation.J.Biosci.Bioeng.104，34-41.)，該載體攜帶能夠組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(CaM35Spromoter)，能夠組成型表達(dá)目標(biāo)基因。轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌為GV3101菌株(公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是VanLarebekeN,EnglerG,HolstersΜ,VandenElsackerS,ZaenenI,SchilperoortRA,SchellJ(1974)LargeplasmidinAgrobacteriumtumefaciensessentialforcrowngall-inducingability.Nature252:169-170·)。先>|各寸密碼子在線軟件http//www,icat.de/禾口http//miracle,igib.res,in/dynavac/優(yōu)化過的ChtSP-Thanatin(基因融合序列委托g(shù)enescript公司合成，此序列被連接到PUC57載體(購自南京金斯瑞生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為SD1176)上。以pUC57=ChtSP-Thanatin(S)為模板，用以下引物經(jīng)過PCR擴(kuò)增，上游引物:5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTGCTCTAGAGCCACCATGAGAGCGCTC-3，和下游引物5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGGCTGTACACATTCTTTGACATTTTC-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物在華大基因公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，獲得的融合基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，編碼具有序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的融合蛋白，序列表中序列2由41個(gè)氨基酸殘基組成。序列表中序列1自5’端第1位-60位為水稻幾丁質(zhì)酶Cht-I的信號肽的編碼序列，第61位-123位為昆蟲抗菌肽thanatin(S)的編碼序列。將該融合基因命名為ChtSP-Thanatin(S)，將其編碼的融合蛋白命名為ChtSP-Thanatin(S)。將測序正確的PCR產(chǎn)物與pD0NR207載體(購自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號為I22I3Ol3)以及GatewayBPClonase酶混合物(購自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號為11789-021)于25°C共同孵育，得到重組載體pD0NR207:ChtSP_Thanatin(S)。將該重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DHlOB(購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為DP77)，卡納霉素平板篩選獲得陽性克隆，擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒。再將PD0NR207=ChtSP-Thanatin(S)、pGWB11和GatewayLRClonase酶混合物(購自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號為11791-043)于25°C共同孵育，獲得重組表達(dá)載體pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)0將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB(購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為DP77)，潮霉素平板篩選陽性克隆，擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒并送華大基因公司測序。測序結(jié)果表明，在PGWBll載體的attR位點(diǎn)插入了序列表中序列1所示的編碼基因，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖1中A)。將pGWBllChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，潮霉素平板篩選并通過菌落PCR反應(yīng)鑒定(引物同上文所述)陽性克隆，擴(kuò)繁，用于轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0。2、遺傳轉(zhuǎn)化和Tl代轉(zhuǎn)化植株的分析采用花序浸泡法將GV3101攜帶的pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)化擬南芥生態(tài)型6Col-O(購自美國俄亥俄州立大學(xué)的生物資源中心(ABRC)，產(chǎn)品目錄號為CS39005)?；ㄐ蚪莘ň唧w步驟為將花序在0D600=0.60.8的農(nóng)桿菌懸液(0.5%蔗糖，0.020.05%SliwetL-77)中浸泡30秒左右，轉(zhuǎn)化后的植株用黑色塑料袋避光保濕放置16-24小時(shí)，然后在9小時(shí)光照/15小時(shí)黑暗、溫度為22°C的植物生長間進(jìn)行培養(yǎng)，直到種子成熟。收獲的種子播種于含潮霉素的平板上，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化株。同時(shí)，用上述方法得到轉(zhuǎn)空載體pGWB11對照擬南芥植株。設(shè)未轉(zhuǎn)化的擬南芥Col-O為野生型對照擬南芥植株。對獲得的pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)化獲得的擬南芥Tl代中的15個(gè)株系(Linel-15)的基因組DNA進(jìn)行Thanatin(S)的PCR檢測。PCR檢測所用的引物序列為:5，-ATCTAAAAAACCTGTTC-3‘和5，-CATTCTTTGACATTTTCCAG-3，。結(jié)果被檢測的pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株中除了株系5(L5)夕卜，其余14個(gè)株系均能擴(kuò)增出目的條帶；野生型對照擬南芥Col-O植株未擴(kuò)增出目的條帶(圖1中B)。為了解Hianatin(S)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中是否轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對PGWBllChtSP-Thanatin(S)獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株T2中的7株進(jìn)行了Real-timePCR檢測，所用的引物序列如下5，-ATCTAAAAAACCTGTTC-3‘和5，-CATTCTTTGACATTTTCCAG-3，。結(jié)果表明目的基因在轉(zhuǎn)基因植物L(fēng)1-L8中均能轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而在野生型對照擬南芥植株Col-O中不能轉(zhuǎn)錄表達(dá)(圖1中C)。為了進(jìn)一步研究ChtSP-Thanatin(S)融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的翻譯表達(dá)情況，對轉(zhuǎn)錄水平較高的株系I(Ll)、株系6(L6)和株系7(L7)進(jìn)行了westernblot檢測，抗體為鼠抗FLAG抗體(購自sigma公司，F(xiàn)1804)。結(jié)果顯示，ChtSP-Hianatin(S)融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥L1、L6和L7中均能翻譯表達(dá)，而在野生型對照擬南芥植株Col-O中不能翻譯表達(dá)(圖1中D)。二、ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因擬南芥對白粉菌的抗性分析對ChtSP-Thanatin⑶融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中翻譯表達(dá)較高的株系Kline1))、株系6(line6)和株系7(line7)接種擬南芥白粉菌(Golovinomycescichoracearum)(公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專禾丨J文獻(xiàn)是YipingWang,MarcΤ.Nishimura,TingZhao，DingzhongTang.2011.ATG2,anautophagy-relatedprotein,negativelyaffectspowderymildewresistanceandmildew-inducedcelldeathinArabidopsis.ThePlantJournal，68，10:74-87)。接禾中方法為用吹風(fēng)機(jī)將白粉菌孢子吹進(jìn)高1米左右的密閉容器內(nèi)，靜置1小時(shí)以上，孢子可以均勻散落于密閉容器內(nèi)的擬南芥葉片上。接種后6天取葉片用trypanblue染色(圖2中B,紅色箭頭所指的是原始單孢子)，在顯微鏡下觀察單孢所產(chǎn)生的孢子數(shù)，計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖2中C，結(jié)果表明ChtSP-Hianatin(S)轉(zhuǎn)基因擬南芥lineKline6和line7與野生型Col-O相比對白粉菌具有顯著的抗性。接種后12天，拍攝COl-0、lineKline6和line7感染白粉菌的表型照片，見圖2中A，從圖中可見，ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因擬南芥lineUline6和line7較野生型對照Col-O具有明顯的抗性。轉(zhuǎn)空載體對照植株與野生型對照植株的表型一致。三、ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因擬南芥對灰霉菌的抗性分析對ChtSP-Thanatin⑶融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中翻譯表達(dá)較高的株系1(Iinel)、株系6(line6)和株系7(line7)接種灰霉菌(Botrytiscinerea)(公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是=YipingWang，MarcΤ.Nishimura,TingZhao,DingzhongTang.2011.ATG2,anautophagy-relatedprotein,negaivelyaffectspowderymildewresistanceandmildew-inducedcelldeathinArabidopsis.ThePlantJournal,68,(10):74-87)。接種方法為取葉片平鋪于0.8%瓊脂平板上，將濃度為5X105SpOreS/ml的灰霉菌孢子懸浮液10μL滴至葉片中央。22°C保濕3天后觀察表型，拍照并測量病斑直徑和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見圖3，圖3中A為轉(zhuǎn)基因擬南芥lineKline6和line7以及野生型對照Col-O的葉片病斑表型，圖3中B為轉(zhuǎn)基因擬南芥line1、line6和line7以及野生型對照Col-O的病斑直徑的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。結(jié)果表明Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因擬南芥的三個(gè)株系line1、line6和line7較野生型對照Col-O對灰霉菌具有顯著的抗性。轉(zhuǎn)空載體對照植株與野生型對照植株的表型一致。四、ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因擬南芥對丁香假單胞桿菌番茄致病變種的抗性分析所用菌株為帶有化學(xué)發(fā)光報(bào)告基因的丁香假單胞桿菌番茄致病變種菌株DC3000(luxCDABE-taggedPseudomonassyrmgaepv.tomatoDC3000)(公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是JimFan,CaseyCrooks,ChrisLamb.2008.High—throughputquantitativeluminescenceassayofthegrowthinplantaofPseudomonassyrmgaechromosomalIytaggedwithPhotorhabdusluminescensluxCDABE.ThePlantJournal,53,(2):393-399,January2008)。用Iml無針頭注射器將濃度為0D600=0.002的菌懸液注射接種Thanatin(轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型的葉片，2天后取葉片，拍照并測定菌量。菌量的測定方法如下用打孔器取3枚面積為0.6cm2的葉片置于1.5ml離心管，加入200ulIOmMMgCl2溶液，將葉片研磨成均勻的懸液，直接放入FB12luminometer(BertholdDetectionSystems,http//www.berthold~ds.com/)測定光子數(shù)。結(jié)果如圖4所示，圖4中A為轉(zhuǎn)基因擬南芥line1、line6和line7以及野生型對照Col-O的葉片接種后2天的表型，圖4中B為轉(zhuǎn)基因擬南芥line1、line6和line7以及野生型對照Col-O葉片接種后2天化學(xué)發(fā)光光子數(shù)的測定(請說明圖4中B縱坐標(biāo)所示的熒光量的計(jì)算公式)，結(jié)果顯示，ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因擬南芥的三個(gè)株系line1、line6和line7比野生型對照Col-O對丁香假單胞桿菌番茄致病變種具有明顯的抗性。轉(zhuǎn)空載體對照植株與野生型對照植株的表型一致。實(shí)施例2、Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因小麥的獲得及其對小麥白粉菌的抗性分析一、遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建轉(zhuǎn)化小麥采用的載體為pAHC25(公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是ChristensenAH,QuailPH.1996.Ubiquitinepromoter-basedvectorsforhighlevelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch5:213-218.)。首先采用限制性內(nèi)切酶SmaI和Mcl雙酶切，將pAHC25中的GUS序列去除，回收載體大片段；以pGWBll=ChtSP-Thanatin(S)為模板，PCR擴(kuò)增為ChtSP-Thanatin(-FLAG融合基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物也用SmaI和SacI雙酶切，PCR擴(kuò)增所用引物為5，-TATCCCCCGGGAACAAGTTTG-3，和5’-TACGAGCTCCTAAGCCTTGTC-3’。然后將酶切后的PCR產(chǎn)物與回收的載體大片段用T4連接酶鏈接，即獲得含有目的基因的重組轉(zhuǎn)化載體PAHC25=ChtSP-Thanatin(S)-FLAG。將該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB(購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為DP77)，氨芐平板篩選陽性克隆，擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒并送華大基因公司測序。測序結(jié)果表明，在PAHC25載體的SmaI和McI酶切位點(diǎn)間插入了序列正確的序列表中序列1所示的編碼基因(圖5中A)。將載體pAHC25ChtSP-Thanatin(S)-FLAG用基因槍法轉(zhuǎn)化小麥品種科農(nóng)199(KN199)(國審麥2006017，良種繁育階段)(公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是李俊明，張相岐，張愛民，王志國，安調(diào)過，紀(jì)軍，王靜，2007，高產(chǎn)廣適小麥新品種一科農(nóng)199.麥類作物學(xué)報(bào)，27(:368)，最終獲得14個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，PCR方法檢測證明有8個(gè)株系為陽性(圖5中B)，所用的引物序列為5，-ATCTAAAAAACCTGTTC-3‘和5，-CATTCTTTGACATTTTCCAG-3，。同時(shí)，用上述方法得到轉(zhuǎn)空載體pAHC25對照小麥植株。設(shè)未轉(zhuǎn)化的小麥科農(nóng)199為野生型對照小麥植株。二、ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因小麥TO對小麥白粉菌的抗性分析將TO代的5個(gè)株系(L5、L8、L10、LlUL13)的轉(zhuǎn)基因小麥苗和對照KN199采用離體葉段法接種小麥白粉菌(Erysiphegrammis)(公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是萬平，令利軍，周文娟，張文俊，凌宏清，朱立煌，張相岐。2004.小麥鋅指蛋白基因的克隆、序列與表達(dá)分析。遺傳學(xué)報(bào)，Vol31，(9)895-900)。首先制備含50mg/L苯并咪唑的0.5%瓊脂平板切除中部3cm寬的部分，剪取km左右的待接種葉片，兩端插入瓊脂切面，將白粉菌孢子均勻抖落至葉片上，于17°C、85%相對濕度、20001χ光照強(qiáng)度培養(yǎng)，7天后，觀察抗病表型并拍照。有5個(gè)株系(L5、L8、L10、L11、L13)的葉片，對小麥白粉菌的抗性顯著高于對照KN199，結(jié)果如圖6所示。轉(zhuǎn)空載體對照植株與對照KN199植株的表型一致。權(quán)利要求1.一種融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因。4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在pGWBll載體的attR位點(diǎn)插入了權(quán)利要求2或3所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在PAHC25載體的SmaI和Mcl酶切位點(diǎn)間插入了權(quán)利要求2或3所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入目的植物中，得到與所述目的植物相比，抗病菌能力提高的轉(zhuǎn)基因植物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過權(quán)利要求4-6中任一所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥；所述單子葉植物為小麥。10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述病菌為擬南芥白粉菌(Golovinomycescichoracearum)、灰霉菌(Botrytiscinerea)、丁香假單胞桿菌番前致病變禾中(Pseudomonassyrmgaepv.tomato)禾口/或小麥白粉菌(Erysiphegraminis)。全文摘要本發(fā)明公開了昆蟲抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的昆蟲抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)?？共⌒詸z測的結(jié)果顯示，ChtSP-Thanatin(S)轉(zhuǎn)基因植物對白粉病菌(Golovinomycescichoracearum和Erysiphegraminis)、灰霉菌(Botrytiscinerea)及丁香假單胞桿菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000)皆具有明顯的抗性。證明Thanatin(S)在控制植物真菌和細(xì)菌病害方面效果顯著，具有一定應(yīng)用前景。文檔編號C12N15/62GK102372781SQ201110344260公開日2012年3月14日申請日期2011年11月3日優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日發(fā)明者吳廷全,唐定中,姚愛玉,張永清,鄒聲浩,陳偉達(dá),陳永芳申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所