專利名稱：昆蟲抗菌肽Drosomycin融合蛋白及其在植物抗病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲抗菌肽Drosomycin融合蛋白及其在植物抗病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
昆蟲是世界上最大的生物種群，除海洋外的所有的生態(tài)環(huán)境都有昆蟲的分布，表明昆蟲適應(yīng)能力和防御能力非常強(qiáng)。昆蟲并不具有高度專一的免疫體系，卻能在自然界占據(jù)極大的優(yōu)勢(shì)，表明其先天性或獲得性免疫能力是非常驚人的，其防御系統(tǒng)也必然有獨(dú)到之處。研究表明，在受到病菌刺激的情況下，昆蟲能夠快速合成大量而多種的抗菌肽，迅速殺滅已侵入的病菌，并阻止病菌的繼續(xù)侵染。到目前為止，在昆蟲中已發(fā)現(xiàn)了大量的抗細(xì)菌肽，抗真菌肽，以及既抗真菌又抗細(xì)菌的抗菌肽。這些抗菌肽不僅對(duì)細(xì)菌、真菌有廣譜抗菌能力，對(duì)病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有作用。抗菌肽是一種具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000 7000D左右，由20 60個(gè)氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)。據(jù) Shai-Matsuzaki-Huanf模型，多數(shù)抗菌肽的作用機(jī)制都是基于多肽與磷脂互作導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂而引起細(xì)胞損傷。由于抗菌肽作用于磷脂類而非酶類，因此，很少有病原對(duì)抗菌肽產(chǎn)生抗性。在全球范圍內(nèi)，植物病害所造成農(nóng)作物產(chǎn)量的損失每年高達(dá)300-500億美元。傳統(tǒng)育種對(duì)抗病品種選育做出了最為重要的貢獻(xiàn)，但由于植物本身抗病基因有限和單個(gè)抗病基因所介導(dǎo)的抗病性具有高度專化性，抗病譜比較窄，只能抗有限的小種，以致病原菌群體發(fā)生變化時(shí)，就面臨抗性喪失的風(fēng)險(xiǎn)，從而無(wú)法滿足農(nóng)作物病害防治的需要。如何將各種生物體基因組的豐富資源系統(tǒng)地應(yīng)用于農(nóng)作物抗性的改良是當(dāng)今轉(zhuǎn)基因工程的一個(gè)熱點(diǎn)和焦點(diǎn)問(wèn)題。植物基因工程可以在不改變植物已有優(yōu)異基因型的情況下引入抗病性表型，為獲得新的抗病品種提供了更為強(qiáng)大的手段，成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的重要策略之一。植物本身可產(chǎn)生多種抗菌肽，但研究發(fā)現(xiàn)植物來(lái)源的抗菌肽基因的表達(dá)只對(duì)病原菌產(chǎn)生中等程度抗性，這是由于經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的病原與寄主的相互作用和進(jìn)化，植物病原菌已經(jīng)對(duì)這些植物抗菌肽產(chǎn)生了耐受性。因此，非植物來(lái)源的抗菌基因在植物抗病中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。昆蟲抗菌肽對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等表現(xiàn)廣譜抗性，抗菌性強(qiáng)、抗菌效果快。這些特點(diǎn)使得抗菌肽在培育抗性作物方面具有誘人的潛力。目前已發(fā)現(xiàn)昆蟲抗菌肽可以抑制許多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中非常重要的植物病原真菌和細(xì)菌，如白粉病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢等真菌和丁香假單孢菌、胡蘿卜軟腐歐氏桿菌、水稻白葉枯病菌等細(xì)菌。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗菌肽導(dǎo)入植物中表達(dá)，可使作物對(duì)植物病原細(xì)菌和真菌產(chǎn)生有效抗性、煙草、水稻、辣椒、番茄等植物中成功表達(dá)并獲得抗病株系的報(bào)道。然而，目前在植物轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用的主要是天蠶素基因，而其他絕大多數(shù)抗菌肽在轉(zhuǎn)基因植物中的抗病功能還沒(méi)有測(cè)試。Drosomycin是來(lái)自于果蠅的抗真菌肽，是第一個(gè)被鑒定的昆蟲誘導(dǎo)型抗真菌肽，對(duì)細(xì)菌、酵母菌無(wú)明顯抗性，但對(duì)多種絲狀真菌顯示很強(qiáng)的抗性。其原始肽含有70個(gè)氨基酸殘基，成熟肽含有44個(gè)氨基酸殘基，包含8個(gè)半胱氨酸殘基，形成4個(gè)二硫橋(Fehlbaum P P, Bulet et al. (1994). “ Insect immunity. Septic injury of Drosophila induces the synthesis of a potent antifungal peptide with sequence homology to plant antifungal peptides. “ J Biol Chem 269(52) :33159_63.)。其序列 MVQIKFLFVFLAVMTIV VLAANMADADCLSGKYKGPCAVWDNEMCRRICKEEGHISGCSPSLKCWCEGC。Drosomyc in 在植物病害控制方面的文獻(xiàn)還未見有報(bào)道。擬南芥(Arabidopsis thaliana)屬十字花科，基因組很小，但其2. 5萬(wàn)基因在功能類別上卻和其他開花植物大致相似；擬南芥生命周期很短，從播種到種子收獲僅需要 6 8周；擬南芥?zhèn)€體較小，適合于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)種植；這些特點(diǎn)使得擬南芥成為一種理想的植物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究材料。此外，擬南芥在接種條件下可以被多種不同的植物病原細(xì)菌、真菌及病毒等侵染，也是研究植物與病原菌互作的模式植物。利用轉(zhuǎn)基因擬南芥研究抗菌肽在植物體內(nèi)表達(dá)后的抗病功能，是一種便捷、有效的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種昆蟲抗菌肽Drosomycin融合蛋白。本發(fā)明所提供的融合蛋白，名稱為ChtSP-Drosomycin，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述融合蛋白的編碼基因。本發(fā)明所提供的所述融合蛋白的編碼基因(命名為ChtSP-Drosomycin)，為如下 1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼所述融合蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述融合蛋白的基因。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列1由270個(gè)堿基組成，自5’端第1位_60位為水稻幾丁質(zhì)酶Cht-I 的信號(hào)肽的編碼序列，第61位-270位為昆蟲抗菌肽Drosomycin的編碼序列。含有所述編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體為在pGWBll載體的attR位點(diǎn)插入了所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述編碼基因轉(zhuǎn)入目的植物中，得到與所述目的植物相比，抗病菌能力提高的轉(zhuǎn)基因植物。所述編碼基因是通過(guò)權(quán)所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。
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所述病菌為擬南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)禾口 /或灰霉菌 (Botrytis cinerea)。將水稻幾丁質(zhì)酶Cht-I的信號(hào)肽連接到Drosomycin的N端，并對(duì)這一融合結(jié)構(gòu)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其有利于在植物中高表達(dá)，再將其構(gòu)建到Gateway載體系列的 PGWBll (C端連FLAG標(biāo)簽)中。抗病性檢測(cè)的結(jié)果顯示，Drosomycin轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)禾口灰霉菌(Botrytis cinerea)等真菌具有明顯的抗性。證明Drosomycin在控制植物真菌病害方面效果明顯，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將序列表中序列1所示的融合基因轉(zhuǎn)入植物提高植物的抗病性，這是傳統(tǒng)育種技術(shù)所無(wú)法做到的。本發(fā)明利用植物源外的基因來(lái)提高植物的抗病性，為植物病害控制提供了一條新途徑，若將其融入到作物育種程序?qū)⒂袕V闊的前景。


圖1為ChtSP-Drosomycin融合基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)分析結(jié)果；其中，圖 1中A為重組載體PGWBll =ChtSP-Drosomycin的部分結(jié)構(gòu)示意圖；圖1中B為對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株Tl的12個(gè)株系用PCR檢測(cè)Drosomycin基因整合到基因組上的結(jié)果；圖1中C為對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株T2的7個(gè)株系用real-time PCR檢測(cè)Drosomycin基因轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果；圖 1中D為選擇轉(zhuǎn)錄水平較高的3個(gè)株系用western blot技術(shù)檢測(cè)ChtSP-Drosomycin-FLAG 的表達(dá)結(jié)果。圖2為ChtSP-Drosomycin轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)白粉菌抗性的檢測(cè)結(jié)果；其中，圖2中 A為接種后12天轉(zhuǎn)基因擬南芥line 3、line 4和line5和野生型Col-O感染白粉菌的表型結(jié)果；圖2中B為接種后6天擬南芥葉片上的原始單孢子；圖2中C為擬南芥葉片上單孢所產(chǎn)生的孢子數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖3為ChtSP-Drosomycin轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)灰霉菌的抗性檢測(cè)結(jié)果；其中，圖3中 A為轉(zhuǎn)基因擬南芥line 3、line 4和line5以及野生型對(duì)照Col-O的表型，圖3中B為轉(zhuǎn)基因擬南芥line 3、line 4和line5以及野生型對(duì)照Col-O的病斑直徑的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例一、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及其檢測(cè)一、ChtSP-Drosomycin融合基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)分析1、遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建采用的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體為gateway系列中的pGWBll載體(公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專利文獻(xiàn)是=Nakagawa, T.，Kurose, T.，Hino，T.，Tanaka, K.，Kawamukai，M.，Niwa, Y.，Toyooka, K.，Matsuoka, K.，Jinbo， T. and Kimura，Τ. (2007)Development of series of gateway binary vectors, pGWBs, for realizing efficient construction of fusion genes for plant transformation. J. Biosci. Bioeng. 104，34-41.)，該載體攜帶能夠組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子 (CaM35S promoter)，能夠組成型表達(dá)目標(biāo)基因。轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌為GV3101菌株(公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專利文獻(xiàn)是Van Larebeke N, Engler G, Holsters Μ, Van den Elsacker S, Zaenen I, Schilperoort RA, Schell J(1974)Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential for crown gall-inducing ability. Nature 252:169-170·)。先>|各寸密碼子在線軟件 http //www, icat. de/ 禾口 http //miracle, igib. res. in/dynavac/優(yōu)化過(guò)的ChtSP-Drosomycin基因融合序列送到genescript公司合成，此序列被連接到PUC57載體(購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為SD1176)上。以 pUC57 =ChtSP-Drosomycin為模板，用以下引物經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，上游引物5’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTGCTCTAGAGCCACCATGAGAGCGCTC-3，禾口下游引物5’ -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGGCTGTACAACATCCTTCACACCAAC-3，。 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C，5min ；94°C，20s ；65°C，15s ；68°C,45s ；33 個(gè)循環(huán)；68°C, IOmin ；所用 Taq酶為K0D(NoVagen公司)。PCR產(chǎn)物在華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，獲得的融合基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，編碼具有序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的融合蛋白，序列表中序列2由90個(gè)氨基酸殘基組成。序列表中序列1自5’端第1位-60位為水稻幾丁質(zhì)酶Cht-I的信號(hào)肽的編碼序列，第61位-270位為昆蟲抗菌肽 Drosomycin的編碼序列。將該融合基因命名為ChtSP-Drosomycin，將其編碼的融合蛋白命名為 ChtSP-Drosomycin。將測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物與pD0NR207載體(購(gòu)自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為I22I3Ol3)以及Gateway BP Clonase酶混合物(購(gòu)自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為 11789-021)于25°C共同孵育，得到重組載體pD0NR207 :ChtSP-Drosomycin。將該重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DHlOB (購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為DP77)， 卡納霉素平板篩選獲得陽(yáng)性克隆，擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒。再將pD0NR207 =ChtSP-Drosomycin, pGWBll 和 Gateway LR Clonase 酶混合物(購(gòu)自 Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為 11791-043)于 25°C共同孵育，獲得重組表達(dá)載體pGWBll =ChtSP-Drosomycin0將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB (購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為DP77)，潮霉素平板篩選陽(yáng)性克隆，擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒并送華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，在PGWBll載體的attR 位點(diǎn)插入了序列表中序列1所示的編碼基因，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖1中A)。將pGWBll =ChtSP-Drosomycin導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，潮霉素平板篩選并通過(guò)菌落PCR反應(yīng)鑒定(引物同上文所述)陽(yáng)性克隆，擴(kuò)繁，用于轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0。2、遺傳轉(zhuǎn)化和Tl代轉(zhuǎn)化植株的分析采用花序浸泡法將GV3101攜帶的pGWBll =ChtSP-Drosomycin轉(zhuǎn)化擬南芥生態(tài)型 Col-O (購(gòu)自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)的生物資源中心(ABRC)，產(chǎn)品目錄號(hào)為CS39005)。將花序在0D600 = 0. 6 0. 8的農(nóng)桿菌懸液(0. 5%蔗糖，0. 02 0. 05% Sliwet L-77)中浸泡30秒左右，轉(zhuǎn)化后的植株用黑色塑料袋避光保濕放置16-24小時(shí)，然后在9小時(shí)光照/15小時(shí)黑暗、溫度為22°C的植物生長(zhǎng)間進(jìn)行培養(yǎng)，直到種子成熟。收獲的種子播種于含潮霉素的平板上，篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株。同時(shí)，用上述方法得到轉(zhuǎn)空載體pGWBll對(duì)照擬南芥植株。設(shè)未轉(zhuǎn)化的擬南芥Col-O為野生型對(duì)照擬南芥植株。對(duì)pGWBl 1 =ChtSP-Drosomycin轉(zhuǎn)化獲得的擬南芥植株Tl代中的12個(gè)株系 (Linel-12)的基因組DNA進(jìn)行Drosomycin的PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)所用的引物序列為 5， -ATGGTTCAAATTAAAT-3，和 5’ -ACATCCTTCACACC-3，。結(jié)果被檢測(cè)的pGWBll =ChtSP-Drosomycin獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株中除了株系1 (Li)夕卜， 其余11個(gè)株系均能擴(kuò)增出目的條帶；野生型對(duì)照擬南芥植株Col-O未擴(kuò)增出目的條帶(圖 1 中 B)。為了解Drosomycin在轉(zhuǎn)基因擬南芥中是否轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對(duì)pGWBll ChtSP-Drosomycin獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株T2中的7株進(jìn)行了 Real-time PCR檢測(cè)，所用的引物序列為5’ -ATGGTTCAAATTAAAT-3，和 5’ -ACATCCTTCACACC-3，。結(jié)果表明目的基因在轉(zhuǎn)基因植物L(fēng)3-L9中均能轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而在野生型對(duì)照擬南芥植株Col-O中不能轉(zhuǎn)錄表達(dá)(圖1中C)。為了進(jìn)一步研究ChtSP-Drosomycin融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的翻譯表達(dá)情況，對(duì)轉(zhuǎn)錄水平較高的株系3 (L3)、株系4(L4)和株系5(L5)進(jìn)行了 western blot檢測(cè)，抗體為鼠抗FLAG抗體(購(gòu)自sigma公司，F(xiàn)1804)。結(jié)果顯示，ChtSP-Drosomycin融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥L3、L4和L5中均能翻譯表達(dá)，而在野生型對(duì)照擬南芥植株Col-O中不能翻譯表達(dá)(圖1中D)。二、ChtSP-Drosomycin轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)白粉菌的抗性分析對(duì)ChtSP-Drosomycin融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中翻譯表達(dá)較高的株系 3(line3))、株系 4(line 4)和株系 5(line 5)接種擬南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)(公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專禾丨J文獻(xiàn)是Yiping Wang, Marc Τ. Nishimura, Ting Zhao，Dingzhong Tang. 2011. ATG2, an autophagy-related protein, negatively affects powdery mildew resistance and mildew-induced cell death in Arabidopsis. The Plant Journal，68，10 :74_87)。接禾中方法為用吹風(fēng)機(jī)將白粉菌孢子吹進(jìn)高1米左右的密閉容器內(nèi)，靜置1小時(shí)以上，孢子可以均勻散落于密閉容器內(nèi)的擬南芥葉片上。接種后6天取葉片用trypan blue染色，(圖2中 B，紅色箭頭所指的是原始單孢子)，在顯微鏡下觀察單孢所產(chǎn)生的孢子數(shù)，計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖2中C，結(jié)果表明ChtSP-Drosomycin轉(zhuǎn)基因擬南芥line3、line4和line5 與野生型Col-O相比對(duì)白粉菌具有顯著的抗性。接種后12天，拍攝Col-OUine 3、line 4 和line5感染白粉菌的表型照片，見圖2中A，從圖中可見，ChtSP-Drosomycin轉(zhuǎn)基因擬南芥line 3、line 4和line5較野生型對(duì)照Col-O具有明顯的抗性。轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株與野生型對(duì)照植株的表型一致。三、ChtSP-Drosomycin轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)灰霉菌的抗性分析對(duì)ChtSP-Drosomycin融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中翻譯表達(dá)較高的株系 3(line3))、株系 4(line 4)和株系 5(line 5)接種灰霉菌(Botrytis cinerea)(公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專利文獻(xiàn)是=YiPing Wang,Marc Τ. Nishimura,Ting Zhao,Dingzhong Tang. 2011. ATG2,an autophagy-related protein， negatively affects powdery mildew resistance and mildew-induced cell death in Arabidopsis. The Plant Journal,68, (10) :74_87)。接種方法為取葉片平鋪于0.8%瓊脂平板上，將濃度為5X105SpOreS/ml的灰霉菌孢子懸浮液10 μ L滴至葉片中央。 22°C保濕3天后觀察表型，拍照并測(cè)量病斑直徑和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見圖3，圖3中A為轉(zhuǎn)基因擬南芥line3、line4和line5以及野生型對(duì)照Col-O的表型，圖3中B為轉(zhuǎn)基因擬南芥line3、line4和line5以及野生型對(duì)照Col-O的病斑面積的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。結(jié)果表明 Drosomycin轉(zhuǎn)基因擬南芥的三個(gè)株系line3、line4和line5較野生型對(duì)照Col-O對(duì)灰霉菌具有顯著的抗性。轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株與野生型對(duì)照植株的表型一致。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在pGWBll 載體的attR位點(diǎn)插入了權(quán)利要求2或3所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入目的植物中， 得到與所述目的植物相比，抗病菌能力提高的轉(zhuǎn)基因植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過(guò)權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述病菌為擬南芥白粉菌 (Golovinomyces cichoracearum)禾口 / 或灰毒菌(Botrytis cinerea) 0
全文摘要
本發(fā)明公開了昆蟲抗菌肽Drosomycin融合蛋白及其在植物抗病中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的昆蟲抗菌肽Drosomycin融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)?？共⌒詸z測(cè)的結(jié)果顯示，Drosomycin轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)和灰霉菌(Botrytis cinerea)等真菌具有明顯的抗性。證明Drosomycin在控制植物真菌病害方面效果明顯，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102382195SQ20111034428
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者吳廷全, 唐定中, 姚愛(ài)玉, 張永清, 陳偉達(dá), 陳永芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所