專利名稱：一種定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物定量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法及其檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化速度的加快，城市向邊緣遷移與擴(kuò)張，城鄉(xiāng)結(jié)合部處在城市發(fā)展和鄉(xiāng)村建設(shè)區(qū)的連接部位，是城市和農(nóng)村的一個(gè)過(guò)渡地帶，更是我國(guó)城市中糧食和蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品的主要供應(yīng)區(qū)域，因此，城鄉(xiāng)結(jié)合部的土壤健康與質(zhì)量問(wèn)題事關(guān)重大，不容忽視。目前專家學(xué)者對(duì)土壤質(zhì)量的研究主要集中于農(nóng)藥殘留，重金屬污染和有機(jī)污染等指標(biāo)方面， 對(duì)于土壤中病原微生物這一生物指標(biāo)關(guān)注不多。來(lái)自于禽畜糞便和污水灌溉土壤病原微生物可以潛伏在土壤中存在很長(zhǎng)一段時(shí)間，并能進(jìn)入蔬菜體內(nèi)，最終影響人類的身體健康。尤其是目前經(jīng)常發(fā)生的因蔬菜被污染病原菌而導(dǎo)致的食物中毒越來(lái)越受到人們的關(guān)注，人們才逐漸認(rèn)識(shí)到這一問(wèn)題的嚴(yán)重性。目前在病原微生物定量檢測(cè)方面主要有平板菌落計(jì)數(shù)法、MPN計(jì)數(shù)法，免疫學(xué)上的方法和以PCR等分子手段為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)上的方法。其中傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有很高的權(quán)威性，但是在操作上具有耗時(shí)耗力麻煩等缺點(diǎn)，而且用于土壤中病原微生物的定量檢測(cè)具有一定的復(fù)雜性和操作上的難度；隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的發(fā)展，PCR技術(shù)因其快速準(zhǔn)確而被廣泛應(yīng)用于食品中病原微生物的定性檢測(cè)中，但是PCR方法不能夠很好地區(qū)分死菌和活菌，而且在定量檢測(cè)中也顯得不足，這就造成結(jié)果上的不準(zhǔn)確。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法，以實(shí)現(xiàn)提供方便、高效、快速的檢測(cè)出土壤中的沙門氏菌，并有效提高檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述方法使用的檢測(cè)試劑盒。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下 一種定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法，包括以下步驟
(1)取土壤，用無(wú)菌水稀釋成5個(gè)稀釋度，分別取5個(gè)稀釋度的稀釋樣品1ml，控溫 300C，用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床震蕩培養(yǎng)Mh，得增菌液；
(2)取少量增菌液，隔水煮沸l(wèi)Omin，常溫靜置3(T40min使其充分復(fù)性，12000r/min離心Imin，得上清液；
(3)取2.5 μ L上清液作為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列為 invA-Ι :5’ -GAAATTATCGCCACGTTCGGGCA-3，，
invA-2 :5’ -TCATCGCACCGTCAAAGGA-3’ ；
(4)同時(shí)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后染色成像，與陽(yáng)性對(duì)照比較，在處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶者為陽(yáng)性結(jié)果，不出現(xiàn)條帶者為陰性結(jié)果。
(5)統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性和陰性結(jié)果個(gè)數(shù)，查MPN表計(jì)算沙門氏菌個(gè)數(shù)；計(jì)算公式活菌數(shù)/ 每克土 =菌數(shù)近似值X數(shù)量指標(biāo)第一位數(shù)的稀釋度。步驟(1)中，稀釋成5個(gè)稀釋度的具體操作為取IOg 土壤加至90ml水中，震蕩搖勻30min，之后取Iml 土壤懸液加至9ml生理鹽水，作為10_2g/mL，再依次進(jìn)行系列稀釋至 1(T3 g/mL、l(T4 g/mL 禾P 1(Γ5 g/mL。步驟(2)中，取少量增菌液的具體操作為取增菌液Iml加入到1. 5ml離心管中， 6000r/min離心5min，去除上清，沉淀溶解于200 μ L無(wú)菌雙蒸水中，取其中的50 μ L進(jìn)行隔水煮沸。步驟(3)中，PCR反應(yīng)體系在25 μ L反應(yīng)體系中，10 XPCR緩沖液2. 5 μ L，20mmol /L Mg2+ 2· 5 μ L，2. 5mmol /L dNTP 2· 0 μ L，2· 0 μ mol/L 引物 1· 0 μ L，2U/ μ L Taq DNA 聚合酶0. 3 μ L，補(bǔ)水至25 μ Lo步驟(3)中，PCR反應(yīng)條件為94°〇預(yù)變性71^11，941變性30s，57°C退火30s，72°C 延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。步驟(4)中，電泳條件為先以60V電壓出孔，再以100V電壓電泳30min。一種定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的試劑盒，包括試劑供量為1次反應(yīng)及以上的試劑 I和試劑II，
試劑I 用于增菌培養(yǎng)沙門氏菌的選擇性培養(yǎng)基，成分為亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，配方為蛋白胨5. Og/L,乳糖4. Og/L,磷酸氫二鈉10. Og/L,亞硒酸氫鈉4. Og/L, L-胱氨酸0. Ig/ L, ρΗ7· 0 士0. 1 ；
試劑II 用于MPN計(jì)數(shù)法中陽(yáng)性管數(shù)確認(rèn)的沙門氏菌PCR反應(yīng)體系，試劑供量為1 次反應(yīng)及以上，試劑包括10XPCR 緩沖液、20_ol /L Mg2+、2. 5mmol/L dNTP ,2. Oymol/ L上游引物、2.0 μ mol/L下游引物、2U/μ L Taq DNA聚合酶和雙蒸水；其中，上游引物為 invA-Ι 引物，序列為5’-GAAATTATCGCCACGTTCGGGCA-3’，下游引物為 invA-2 引物，序列為 5， -TCATCGCACCGTCAAAGGA-3，。本發(fā)明的定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法，是在參考相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，采用MPN 結(jié)合PCR的方法來(lái)定量檢測(cè)土壤中的病原微生物。是一種MPN-PCR定量檢測(cè)病原微生物方法。在建立MPN-PCR定量檢測(cè)病原微生物方法之前，首先進(jìn)行了一個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)探索MPN計(jì)數(shù)法和平板菌落計(jì)數(shù)法之間是否存在一個(gè)相關(guān)性。眾所周知，MPN計(jì)數(shù)法是一種利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)的方法對(duì)樣品中的活菌數(shù)量進(jìn)行估計(jì)，得到的是一個(gè)近似值或者估計(jì)值；平板菌落計(jì)數(shù)法是一種最常規(guī)的活菌定量計(jì)數(shù)法，它具有一定的準(zhǔn)確性和權(quán)威性。對(duì)同一樣品進(jìn)行了 MPN計(jì)數(shù)方法與平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行了回歸分析，建立了兩者之間的定量關(guān)系，使MPN計(jì)數(shù)法具有與平板菌落計(jì)數(shù)法一樣的準(zhǔn)確性，從而為病原微生物，甚至功能微生物的定量計(jì)數(shù)提供更為準(zhǔn)確的結(jié)果。本方法所建立的MPN-PCR方法的關(guān)鍵思路在于利用了 PCR方法快速準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)， 取代了傳統(tǒng)MPN方法中陽(yáng)性結(jié)果的生化鑒定和血清學(xué)鑒定等步驟，從而減少了國(guó)標(biāo)方法中的繁瑣步驟，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)也采用了國(guó)標(biāo)法中的前增菌步驟，來(lái)提高檢測(cè)目的病原菌的準(zhǔn)確性，由于土壤自身的復(fù)雜性，土壤中存在著大量微生物，其中還包括不同名目的各種病原微生物，為了更好更準(zhǔn)確地定量檢測(cè)目的病原菌，采用了選擇性培養(yǎng)目的病原菌來(lái)提高檢測(cè)效率。經(jīng)過(guò)發(fā)明人的創(chuàng)造性的努力以及科學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終在土壤中添加純菌實(shí)驗(yàn)中可以得到沙門氏菌定量檢測(cè)方法的靈敏度為250個(gè)/g 土壤。有益效果與現(xiàn)有的病原微生物定量檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌具有的突出優(yōu)點(diǎn)包括該方法利用了 PCR方法快速準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，取代了傳統(tǒng)MPN方法中陽(yáng)性結(jié)果的生化鑒定和血清學(xué)鑒定等步驟，從而減少了國(guó)標(biāo)方法中的繁瑣步驟，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)也采用了國(guó)標(biāo)法中的前增菌步驟，來(lái)提高檢測(cè)目的病原菌的準(zhǔn)確性，并采用了選擇性培養(yǎng)目的病原菌來(lái)提高檢測(cè)效率，可以實(shí)現(xiàn)沙門氏菌定量檢測(cè)方法的靈敏度為 250個(gè)/g 土壤，具有很好的實(shí)用性，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖1是MPN計(jì)數(shù)法與平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)數(shù)值的相關(guān)性曲線圖2是增菌液直接擴(kuò)增法擴(kuò)增沙門氏菌 Μ基因電泳圖；圖中，泳道1為KT1濃度梯度土壤稀釋液樣品，泳道2為10_2濃度梯度土壤稀釋液樣品，泳道3是10_3濃度梯度土壤稀釋液樣品，泳道4是10_4濃度梯度土壤稀釋液樣品，每個(gè)樣品5個(gè)重復(fù)；CK為陰性對(duì)照，M為 DL-2000 DNA Marker ；
圖3是增菌液沉淀洗滌后擴(kuò)增法擴(kuò)增沙門氏菌 Μ基因電泳圖；圖中，泳道1為10—1 濃度梯度土壤稀釋液樣品，泳道2為10_2濃度梯度土壤稀釋液樣品，泳道3是10_3濃度梯度土壤稀釋液樣品，泳道4是10_4濃度梯度土壤稀釋液樣品，每個(gè)樣品5個(gè)重復(fù)；CK為陰性對(duì)照，M 為 DL-2000 DNA Marker ；
圖4是熱裂解法擴(kuò)增沙門氏菌 Μ基因電泳圖；圖中，泳道1為KT1濃度梯度土壤稀釋液樣品，泳道2為10_2濃度梯度土壤稀釋液樣品，泳道3是10_3濃度梯度土壤稀釋液樣品， 泳道4是10_4濃度梯度土壤稀釋液樣品，每個(gè)樣品5個(gè)重復(fù)；CK為陰性對(duì)照，M為DL-2000 DNA Marker ；
圖5是沙門氏菌引物擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖；圖中，泳道1為枯草芽孢桿菌168，泳道 2為惡臭假單胞菌KTM40，泳道3為土壤桿菌，泳道4為短桿菌，泳道5為纖維微桿菌，泳道 6為微桿菌，泳道7為假單胞菌，泳道8為紅球菌，泳道9為沙門氏菌，泳道10為大腸桿菌 DH5 α，M 為 DL-2000 DNA Marker ；
圖6是土壤添加純沙門氏菌250個(gè)/g 土壤后擴(kuò)增圖譜；圖中，泳道1為KT1濃度梯度土壤稀釋液樣品，泳道2為10_2濃度梯度土壤稀釋液樣品，泳道3是10_3濃度梯度土壤稀釋液樣品，每個(gè)樣品5個(gè)重復(fù)；CK為陰性對(duì)照，M為DL-2000 DNA Marker。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1
以代表性沙門氏菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，制備系列濃度梯度的沙門氏菌添加至滅菌土壤中進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)性分析，首先從平板上刮取純培養(yǎng)的沙門氏菌菌落，接種至IOOml亞硒酸鹽增菌培養(yǎng)基中，30°C，200r/min震蕩培養(yǎng)8h。再通過(guò)十倍稀釋制備成不同濃度的系列稀釋液添加至滅菌土壤中，分別采用平板菌落計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)沙門氏菌個(gè)數(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法參照文獻(xiàn)沈萍，范秀榮，李廣武。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]。北京高等教育出版社，1999，92-94。進(jìn)行，首先對(duì)上述制備的土壤菌懸液分別進(jìn)行梯度稀釋，取合適稀釋度的菌懸液0. Iml涂布于亞硒酸鹽增菌培養(yǎng)基平板上，37°C條件倒置培養(yǎng)，平板培養(yǎng) 1-2天后計(jì)數(shù)。MPN計(jì)數(shù)，首先對(duì)上述制備的土壤菌懸液分別進(jìn)行梯度稀釋，取合適稀釋度的菌懸液Iml加至5ml亞硒酸鹽增菌培養(yǎng)基試管，每個(gè)稀釋度做5管重復(fù)，37°C搖床震蕩培養(yǎng)24h 后統(tǒng)計(jì)每組樣品的陽(yáng)性管數(shù)，據(jù)此通過(guò)MPN表得出待測(cè)樣品的微生物數(shù)目。為了建立MPN計(jì)數(shù)法在微生物計(jì)數(shù)方面與平板菌落計(jì)數(shù)法的回歸方程，首先采用向滅菌土壤中添加不同濃度的沙門氏菌純培養(yǎng)物制備不同梯度的土壤菌懸液，然后采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法分別對(duì)同一樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而建立起兩者之間的回歸方程，并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析以及對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行了 t檢驗(yàn)。采用了 8個(gè)系列濃度的沙門氏菌菌懸液添加至滅菌土壤中進(jìn)行回歸方程的建立， 表1列出了平板菌落計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果。表1平板菌落計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取土壤，用無(wú)菌水稀釋成5個(gè)稀釋度，分別取5個(gè)稀釋度的稀釋樣品1ml，控溫 300C，用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床震蕩培養(yǎng)Mh，得增菌液；(2)取少量增菌液，隔水煮沸l(wèi)Omin，常溫靜置3(T40min使其充分復(fù)性，12000r/min離心Imin，得上清液；(3)取2.5 μ L上清液作為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物序列為invA-Ι :5’ -GAAATTATCGCCACGTTCGGGCA-3，，invA-2 :5’ -TCATCGCACCGTCAAAGGA-3’ ；(4)同時(shí)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后染色成像，與陽(yáng)性對(duì)照比較，在處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶者為陽(yáng)性結(jié)果，不出現(xiàn)條帶者為陰性結(jié)果；(5)統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性和陰性結(jié)果個(gè)數(shù)，查MPN表計(jì)算沙門氏菌個(gè)數(shù)；計(jì)算公式活菌數(shù)/每克土 =菌數(shù)近似值X數(shù)量指標(biāo)第一位數(shù)的稀釋度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法，其特征在于步驟(1)中， 稀釋成5個(gè)稀釋度的具體操作為取IOg 土壤加至90ml水中，震蕩搖勻30min，之后取Iml 土壤懸液加至9ml生理鹽水，作為10_2g/mL，再依次進(jìn)行系列稀釋至10_3 g/mL、10_4 g/mL和 1(Γ5 g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法，其特征在于步驟(2)中， 取少量增菌液的具體操作為取增菌液Iml加入到1. 5ml離心管中，6000r/min離心5min， 去除上清，沉淀溶解于200 μ L無(wú)菌雙蒸水中，取其中的50 μ L進(jìn)行隔水煮沸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法，其特征在于步驟(3) 中，PCR反應(yīng)體系在25 μ L反應(yīng)體系中，10 X PCR緩沖液2.5 μ L，20mmol /L Mg2+ 2. 5 μ L, 2. 5mmol /L dNTP 2. O μ L，2. O μ mol/L 引物 1. O μ L，2U/μ L Taq DNA 聚合酶 0. 3 μ L，補(bǔ)水至 25μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法，其特征在于步驟(3)中， PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性7min，94°C變性30s，57 °C退火30s，72 °C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法，其特征在于步驟(4)中， 電泳條件為先以60V電壓出孔，再以100V電壓電泳30min。
7.一種定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的試劑盒，其特征在于包括試劑供量為1次反應(yīng)及以上的試劑I和試劑II，試劑I 用于增菌培養(yǎng)沙門氏菌的選擇性培養(yǎng)基，成分為亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，配方為蛋白胨5. Og/L,乳糖4. Og/L,磷酸氫二鈉10. Og/L,亞硒酸氫鈉4. 0g/L, L-胱氨酸0. Ig/ L, ρΗ7· 0 士0. 1 ；試劑II 用于MPN計(jì)數(shù)法中陽(yáng)性管數(shù)確認(rèn)的沙門氏菌PCR反應(yīng)體系，試劑包括10XPCR 緩沖液、20mmol /L Mg2+、2. 5mmol/L dNTP、2. Oymol/L 上游弓丨物、 2. 0 μ mol/L下游引物、2U/μ L Taq DNA聚合酶和雙蒸水；其中，上游引物為invA-1引物，序列為5，-GAAATTATCGCCACGTTCGGGCA-3’，下游引物為invA_2弓丨物，序列為 5， -TCATCGCACCGTCAAAGGA-3，。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種定量檢測(cè)土壤中沙門氏菌的方法及其檢測(cè)試劑盒，該方法是在參考相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，采用MPN結(jié)合PCR的方法來(lái)定量檢測(cè)土壤中的病原微生物。利用了PCR方法快速準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，取代了傳統(tǒng)MPN方法中陽(yáng)性結(jié)果的生化鑒定和血清學(xué)鑒定等步驟，從而減少了國(guó)標(biāo)方法中的繁瑣步驟，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)也采用了國(guó)標(biāo)法中的前增菌步驟，來(lái)提高檢測(cè)目的病原菌的準(zhǔn)確性，由于土壤自身的復(fù)雜性，土壤中存在著大量微生物，其中還包括不同名目的各種病原微生物，為了更好更準(zhǔn)確地定量檢測(cè)目的病原菌，采用了選擇性培養(yǎng)目的病原菌來(lái)提高檢測(cè)效率。經(jīng)過(guò)發(fā)明人的創(chuàng)造性的努力以及科學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終在土壤中添加純菌實(shí)驗(yàn)中可以得到沙門氏菌定量檢測(cè)方法的靈敏度為250個(gè)/g土壤。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102337343SQ20111034429
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者崔中利, 曹慧, 李德成, 董麗寧 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所, 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)