專利名稱：中華按蚊抗藥性TaqMan PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種中華按蚊抗藥性TaqMan PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中華按蚊(Anopheles sinensis)分布于我國除青海和新疆以外的所有省市，是我國平原水網(wǎng)和水稻種植地區(qū)的優(yōu)勢蚊種，家野兩棲，白天多棲息在村莊四周的作物植棵和蘆葦叢、灌木叢中，部分棲息在牛房畜舍，偏嗜畜血(以牛、馬、豬等大牲畜為主)，兼吸人血，以成蚊越冬。中華按蚊是我國瘧疾的重要傳播媒介，尤其在北緯34°以北的地區(qū)，它是主要的或唯一的傳播媒介。目前，瘧疾尚無有效疫苗可用，控制瘧疾媒介的種群數(shù)量是防治瘧疾的重要手段?；瘜W(xué)防治因其易操作，能夠迅速、有效地控制害蟲種群，在媒介昆蟲防制規(guī)劃中占有重要地位。過去幾十年來，針對中華按蚊的生活習(xí)性，用擬除蟲菊酯類殺蟲劑， 采用滯留噴灑和浸泡蚊帳等滅蚊防瘧措施，取得了顯著效果。然而，化學(xué)防治在充分發(fā)揮其優(yōu)勢的同時，也帶來了負(fù)面效果，導(dǎo)致了中華按蚊抗藥性的產(chǎn)生。九十年代以來，國內(nèi)各地報道的中華按蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性越來越明顯。1993年重慶中華按蚊對溴氰菊酯和DDT達(dá)到初級抗性，1998年在云南采集的10個中華按蚊種群有5個對DDT產(chǎn)生抗性，1999年浙江溫州、寧波等地的中華按蚊種群達(dá)到高抗種群(R/S = 15-20)，2009年，江蘇部分地區(qū)的中華按蚊對溴氰菊酯產(chǎn)生了高度抗性。害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗性以后，化學(xué)防治的效果就會隨著抗藥性的升高而下降，害蟲的防治也會受到嚴(yán)重的影響。為了應(yīng)對害蟲種群的抗性，為了克服抗性達(dá)到預(yù)期的防治效果，殺蟲劑的使用量，包括單位面積的施藥量和施藥次數(shù)，就不得不持續(xù)增加，這無異于在持續(xù)增加殺蟲劑對媒介昆蟲抗性的選擇壓力，而且這種抗藥性還可向遠(yuǎn)距離擴(kuò)散，間接地還可能造成某些媒介疾病的發(fā)生與流行。從這些年對害蟲抗藥性的監(jiān)測來看，抗藥性增長的速度遠(yuǎn)大于新農(nóng)藥、新劑型研發(fā)的速度。因此，如何加強(qiáng)媒介昆蟲的抗藥性治理、延緩抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展、延長現(xiàn)有殺蟲劑的使用壽命是害蟲治理中的重要內(nèi)容。昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性主要是擊倒抗性(knockdown resistance, kdr), kdr基因在中華按蚊對擬除蟲菊酯的抗性中具有重要作用。擬除蟲菊酯的作用靶標(biāo)主要是昆蟲電壓依賴性神經(jīng)細(xì)胞膜上的鈉離子通道，離子通道上的作用靶點(diǎn)對殺蟲劑降低了敏感性而產(chǎn)生擊倒抗性，因此擊倒抗性不同于代謝抗性，不能被酯酶或多功能氧化酶的抑制劑所降低。通過比較敏感、抗性中華按蚊的部分鈉通道序列，發(fā)現(xiàn)para型鈉通道基因中的kdr的LlO 14F (亮氨酸到苯丙氨酸)即TTG — TTT的突變及LlO 14C (亮氨酸到半胱氨酸)即TTG-TGT的突變和擊倒抗性相關(guān)。這是我國關(guān)于中華按蚊擊倒抗性及其基因突變的首次報道。kdr基因可以作為昆蟲對擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性的一個分子標(biāo)記，通過監(jiān)測kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結(jié)構(gòu)中的狀態(tài)。譚偉龍等0011)用特異性等位基因PCR方法，對采江蘇、安徽的11個中華按蚊種群進(jìn)行致死中濃度(LC50)和kdr基因頻率的測定，并且發(fā)現(xiàn)LC5tl為代表的高效氯氰菊酯抗性與中華按蚊kdr等位基因頻率之間存在正相關(guān)關(guān)系。研究說明Kdr基因可以作為中華按蚊對擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性的一 個分子標(biāo)記，通過監(jiān)測kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結(jié)構(gòu)中的狀態(tài)，可以預(yù)測抗性的發(fā)生和發(fā)展。目前我國還沒有成型的針對中華按蚊的kdr抗性分子檢測方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點(diǎn)的專用引物。本發(fā)明提供的專用引物，由引物1和引物2組成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。所述突變位點(diǎn)為L1014F或L1014C。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點(diǎn)的試劑。本發(fā)明提供的試劑，由試劑1和試劑2組成，所述試劑1由所述專用引物、探針2和探針3組成；所述試劑1由所述專用引物、探針1和探針3組成；所述探針1的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述探針2的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；所述探針3的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述探針1、探針2和探針3的3’末端均標(biāo)記MGB基團(tuán)；所述探針1和探針2的5’末端均標(biāo)記FAM基團(tuán)；所述探針3的5’末端標(biāo)記VIC基團(tuán)。所述專用引物、探針1、探針2和探針3均為獨(dú)立包裝。本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點(diǎn)的反應(yīng)試劑。本發(fā)明提供的反應(yīng)試劑，由試劑A和試劑B組成，所述試劑A包括所述試劑1 ；所述試劑B包括所述試劑2。所述試劑A由所述試劑1和TaqMan反應(yīng)緩沖液組成；所述試劑B由所述試劑2和 TaqMan反應(yīng)緩沖液組成；所述試劑中的各引物在對應(yīng)的所述試劑中的濃度均為9 μ M ；TaqMan Universal Master Mix ^ 5 μ 1/10 μ1，_ 自&司，Cogene Biotech :1008757 ；所述試劑中的各條探針在所述對應(yīng)的試劑中的濃度均為5 μ M ；所述試劑A和所述試劑B均為獨(dú)立包裝。本發(fā)明的第四個目的是提供一種制備檢測中華按蚊中kdr基因突變位點(diǎn)的試劑
品.ο本發(fā)明提供的試劑盒，包括所述的反應(yīng)試劑；所述突變位點(diǎn)為L1014F或L1014C。所述專用引物或所述試劑或所述反應(yīng)試劑或所述試劑盒在檢測中華按蚊中kdr 基因突變位點(diǎn)、檢測中華按蚊抗藥性或制備檢測中華按蚊抗藥性產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述突變位點(diǎn)具體為L1014F或L1014C，所述抗藥性為抗菊酯類藥物；所述菊酯類藥物具體為溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。本發(fā)明的第五個目的是提供一種檢測或輔助檢測中華按蚊中kdr基因的突變位點(diǎn)的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述反應(yīng)試劑中的所述試劑A和所述試劑B分別對待測中華按蚊進(jìn)行TaqMan PCR擴(kuò)增，得到A反應(yīng)產(chǎn)物和B反應(yīng)產(chǎn)物；檢測反應(yīng)產(chǎn)物，若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM和VIC通道均無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在FAM 通道有信號，則所述kdr基因不含或候選不含有所述突變位點(diǎn)，突變位點(diǎn)所在位置的堿基為 TTG/TTG ；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道有信號且在VIC通道無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物在FAM和VIC 通道均無信號，則所述kdr基因突變位點(diǎn)為或候選為L1014C，突變位點(diǎn)所在位置的堿基為 TGT/TGT ；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道無信號且在VIC通道有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在VIC通道有信號，則所述kdr基因的突變位點(diǎn)為或候選為L1014F，突變位點(diǎn)所在位置的堿基為TTT/ TTT ；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道有信號且在VIC通道無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在FAM通道有信號，則所述kdr基因的突變位點(diǎn)為或候選為L1014C，突變位點(diǎn)所在位置的堿基為TTG/ TGT ；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道無信號且在VIC通道有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道和VIC通道均有信號，則所述kdr基因突變位點(diǎn)為或候選為L1014F，突變位點(diǎn)所在位置的堿基為 TTG/TTT ；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道和VIC通道均有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在VIC通道有信號，則所述kdr基因突變位點(diǎn)為或候選為L1014F和L1014C ；突變位點(diǎn)所在位置的堿基為 TTT/TGT。本發(fā)明的第六個目的是提供一種檢測或輔助檢測中華按蚊中kdr基因的基因型的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述的反應(yīng)試劑中的所述試劑A和所述試劑B分別對待測中華按蚊進(jìn)行 TaqManPCR擴(kuò)增，得到A反應(yīng)產(chǎn)物和B反應(yīng)產(chǎn)物；檢測反應(yīng)產(chǎn)物，若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM和VIC通道均無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在FAM 通道有信號，則所述kdr基因為不含或候選不含有所述突變位點(diǎn)的純合型基因；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道有信號且在VIC通道無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物在FAM和VIC 通道均無信號，則所述kdr基因為或候選為含有突變位點(diǎn)L1014C的純合型基因；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道無信號且在VIC通道有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在VIC通道有信號，則所述kdr基因為或候選為含有突變位點(diǎn)L1014F的純合型基因；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道有信號且在VIC通道無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在FAM通道有信號，則所述kdr基因為或候選為含有突變位點(diǎn)L1014C的雜合型基因；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道無信號且在VIC通道有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道和VIC通道均有信號，則所述kdr基因為或候選為含有突變位點(diǎn)L1014F的雜合型基因；
若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道和VIC通道均有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在VIC通道有信號，則所述kdr基因為或候選為含有突變位點(diǎn)L1014F和L1014C的雜合型基因。所述PCR擴(kuò)增中，以待測中華按蚊的基因組DNA為模板；所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為60°C -65°C，退火溫度具體為60°C。本發(fā)明的實(shí)驗證明，本發(fā)明提供的了一種快捷、簡便、靈敏的中華按蚊kdr突變等位基因檢測試劑盒，用來掌握中華按蚊與擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān)的kdr等位基因的狀況。


圖1為TaqMan-MGB探針檢測kdr等位基因示意2為各種基因型頻率與生物抗性表型的相關(guān)性
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、引物和探針的設(shè)計1、引物及MGB探針設(shè)計針對抗性中華按蚊鈉通道kdr的兩種點(diǎn)突變?nèi)N等位基因(未突變的kdr在 GENBANK的登錄號為JN002364，也為序列表中的序列6，其中包含L1014位點(diǎn)kdr基因為序列表中序列6的第1224-12 位、突變?yōu)長1014F為將序列表中序列6的第1224-12 位 TTG突變?yōu)門TT、突變?yōu)長1014C為將序列表中序列6的第1224-12 位TTG突變?yōu)門GT)的情況，根據(jù)序列特征，利用Express〗.0軟件設(shè)計了三條探針，分別針對三種等位基因類型， 為了提高退火溫度，增加序列的特異性，在探針3’末端增加MGB基團(tuán)提高探針序列的退火溫度。在定量PCR儀的48孔板上，每個樣本設(shè)計平行的兩管擴(kuò)增，第一管加探針P1、P3 和非特異引物F及R，第二管加探針P2、P3和非特異引物F及R，按照乂印01^ realtime-PCR 儀的操作規(guī)程，第一管的FAM基團(tuán)設(shè)計為棕色，VIC基團(tuán)設(shè)計為綠色，第二管的FAM基團(tuán)設(shè)計為紅色，VIC基團(tuán)設(shè)計為綠色，運(yùn)行結(jié)束后讀取兩管的擴(kuò)增曲線，根據(jù)兩管顯示的顏色可以輕松讀出擴(kuò)增的等位基因類型，見圖1 (檢測L1014和L1014C等位基因的探針1和探針2在 5’標(biāo)記FAM發(fā)光基團(tuán)，檢測L1014F等位基因的探針3在5’標(biāo)記VIC發(fā)光基團(tuán)。檢測時將第一管中的FAM設(shè)為紅色，第二管的FAM設(shè)為棕色，VIC均設(shè)為綠色。)。TaqMan Universal Master Mix由上?；瞪锕咎峁?。探針1_3分別對應(yīng)于TGT、TTG和TTT密碼子。表1為涉及的引物及MGB探針
權(quán)利要求
1.一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點(diǎn)的專用引物，由引物1和引物2組成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于 所述突變位點(diǎn)為L1014F或L1014C。
3.—種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點(diǎn)的試劑，由試劑1和試劑2組成， 所述試劑1由權(quán)利要求1所述專用引物、探針2和探針3組成；所述試劑1由權(quán)利要求1所述專用引物、探針1和探針3組成； 所述探針1的核苷酸序列為序列表中的序列3 ； 所述探針2的核苷酸序列為序列表中的序列4 ； 所述探針3的核苷酸序列為序列表中的序列5 ； 所述探針1、探針2和探針3的3’末端均標(biāo)記MGB基團(tuán)； 所述探針1和探針2的5’末端均標(biāo)記FAM基團(tuán)； 所述探針3的5’末端標(biāo)記VIC基團(tuán)。
4.一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點(diǎn)的反應(yīng)試劑，由試劑A和試劑B組成，所述試劑A包括權(quán)利要求3所述試劑中的所述試劑1 ；所述試劑B包括權(quán)利要求3所述試劑中的所述試劑2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的反應(yīng)試劑，其特征在于所述試劑A由權(quán)利要求3所述試劑中的所述試劑1和TaqMan反應(yīng)緩沖液組成；所述試劑B由權(quán)利要求3所述試劑中的所述試劑2和TaqMan反應(yīng)緩沖液組成； 所述試劑中的各引物在對應(yīng)的所述試劑中的濃度均為9μ M ； 所述試劑中的各條探針在所述對應(yīng)的試劑中的濃度均為5 μ M ； 所述試劑A和所述試劑B均為獨(dú)立包裝。
6.一種制備檢測中華按蚊中kdr基因突變位點(diǎn)的試劑盒，為包括權(quán)利要求4或5所述的反應(yīng)試劑的試劑盒；所述突變位點(diǎn)為L1014F或L1014C。
7.權(quán)利要求1或2所述專用引物或權(quán)利要求3所述的試劑或權(quán)利要求4或5所述反應(yīng)試劑或權(quán)利要求6所述試劑盒在檢測中華按蚊中kdr基因突變位點(diǎn)、檢測中華按蚊抗藥性或制備檢測中華按蚊抗藥性產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述突變位點(diǎn)具體為L1014F或L1014C，所述抗藥性為抗菊酯類藥物；所述菊酯類藥物具體為溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
8.一種檢測或輔助檢測中華按蚊中kdr基因的突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟 用權(quán)利要求4或5所述的反應(yīng)試劑中的所述試劑A和所述試劑B分別對待測中華按蚊進(jìn)行TaqMan PCR擴(kuò)增，得到A反應(yīng)產(chǎn)物和B反應(yīng)產(chǎn)物；檢測反應(yīng)產(chǎn)物，若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM和VIC通道均無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在FAM通道有信號，則所述kdr基因不含或候選不含有所述突變位點(diǎn)；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道有信號且在VIC通道無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物在FAM和VIC通道均無信號，則所述kdr基因突變位點(diǎn)為或候選為L1014C ；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道無信號且在VIC通道有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在VIC通道有信號，則所述kdr基因的突變位點(diǎn)為或候選為L1014F ；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道有信號且在VIC通道無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在FAM通道有信號，則所述kdr基因的突變位點(diǎn)為或候選為L1014C ；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道無信號且在VIC通道有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道和VIC 通道均有信號，則所述kdr基因突變位點(diǎn)為或候選為L1014F ；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道和VIC通道均有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在VIC通道有信號，則所述kdr基因突變位點(diǎn)為或候選為L1014F和L1014C。
9.一種檢測或輔助檢測中華按蚊中kdr基因的基因型的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求4或5所述反應(yīng)試劑中的所述試劑A和所述試劑B分別對待測中華按蚊進(jìn)行I1aqMan PCR擴(kuò)增，得到A反應(yīng)產(chǎn)物和B反應(yīng)產(chǎn)物；檢測反應(yīng)產(chǎn)物，若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM和VIC通道均無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在FAM通道有信號，則所述kdr基因為不含或候選不含有所述突變位點(diǎn)的純合型基因；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道有信號且在VIC通道無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物在FAM和VIC通道均無信號，則所述kdr基因為或候選為含有突變位點(diǎn)L1014C的純合型基因；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道無信號且在VIC通道有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在VIC通道有信號，則所述kdr基因為或候選為含有突變位點(diǎn)L1014F的純合型基因；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道有信號且在VIC通道無信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在FAM通道有信號，則所述kdr基因為或候選為含有突變位點(diǎn)L1014C的雜合型基因；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道無信號且在VIC通道有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道和VIC 通道均有信號，則所述kdr基因為或候選為含有突變位點(diǎn)L1014F的雜合型基因；若A反應(yīng)產(chǎn)物在FAM通道和VIC通道均有信號，且B反應(yīng)產(chǎn)物僅在VIC通道有信號，則所述kdr基因為或候選為含有突變位點(diǎn)L1014F和L1014C的雜合型基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增中，以待測中華按蚊的基因組DNA為模板； 所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為60°C -65°C，退火溫度具體為60°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中華按蚊抗藥性TaqMan PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的引物，由引物1和引物2組成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。所述突變位點(diǎn)為L1014F或L1014C。本發(fā)明的實(shí)驗證明，本發(fā)明提供的了一種快捷、簡便、靈敏的中華按蚊kdr突變等位基因檢測試劑盒，用來掌握中華按蚊與擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān)的kdr等位基因的狀況。
文檔編號C12Q1/68GK102373281SQ20111034445
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者劉美德, 張映梅, 李春曉, 汪中明, 董言德, 譚偉龍, 趙彤言, 邢丹, 郭曉霞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所