專利名稱：雜色鮑鈣調(diào)蛋白cDNA序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及功能基因應(yīng)用相關(guān)領(lǐng)域，尤其是涉及雜色鮑鈣調(diào)蛋白 cDNA序列。
背景技術(shù)：
鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)是一種存在于幾乎所有的真核細(xì)胞中的鈣結(jié)合蛋白。它與 Ca2+結(jié)合后可以進(jìn)一步結(jié)合多種目標(biāo)蛋白，從而調(diào)節(jié)包括炎癥反應(yīng)、代謝、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮、胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)、短期和長(zhǎng)期記憶、神經(jīng)生長(zhǎng)及免疫反應(yīng)等多種生理過程。因此，鈣調(diào)蛋白屬于細(xì)胞信號(hào)通路中的上游關(guān)鍵基因，其表達(dá)量的上調(diào)或下降會(huì)引起下游信號(hào)途徑中一系列多種多樣的反應(yīng)和變化。目前，尚未在鮑魚物種中鑒定到鈣調(diào)蛋白相關(guān)基因及產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雜色鮑鈣調(diào)蛋白cDNA序列。本發(fā)明以雜色鮑為材料，提取全組織(肌肉和內(nèi)臟團(tuán))的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后cDNA。然后對(duì)所得的cDNA進(jìn)行sfil酶切，分別割膠回收0. 5 1和廣31Λ之間的片段，并與pDNR-LIB載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB感受態(tài)，建立cDNA文庫(kù)。通過生物信息學(xué)的方法從眾多序列中鑒定到一個(gè)與已知鈣調(diào)蛋白基因序列相似的序列。根據(jù)鑒定得到的基因序列設(shè)計(jì)特異引物，上游引物5 ’ -CGAAACATTTCTGTGAAT-3 ’；下游引物 5 ’ -TGAGGTCATTACATGGAG-3 ’。以文庫(kù)中鈣調(diào)蛋白cDNA序列為模板，采用上述特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到雜色鮑鈣調(diào)蛋白基因序列，其具有鈣調(diào)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及活性中心， 其四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域分別位于蛋白序列的16 — 36、45— 72和84—109和118 —145區(qū)間； 第一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的活性中心包括Asp-20、Asp-22、Asn-24和Glu-31 ；第二個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的活性中心包括Asp-56、Asn-58、Asn-60和Glu_67 ；第三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的活性中心包括Asp-93、Asp-95、Ser-97和Glu-104 ；第四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的活性中心包括Asp_129、 Asn-131、Asp-133 和 Glu-HO0本發(fā)明所得的雜色鮑鈣調(diào)蛋白基因序列，其具體DNA核苷酸如下
cattagattgccgtcttgtataacaaaggcgaaacatttctgtgaatccgagtccgagcg60atgtccaatctgtcgcagagggagaaacagctgtacaccaggttcttccaccaggtggac120attgatggaaacgggtacatcaccctggatgaactagcaaccttgtgcaaaaaactcaag180ctcggcttgacgcgacaacagattgtggacgtgtttatgaacatggacaccgacaacaac240ttgaccattaccttaaacgaattcttgtcggcaatgccaaagattgaacgtgaacaactc300tcgtatggtgagatgaggtgggcatttgaccagatagacacagatggcagcggcctgctt360gacgctgatgagctgaaggaagtgctgctcaaatgtggacgttcattgacgttgtcacaa420gtgaagactatgattgccaaagtcgacatcaacggtgacggcaaattgaactttgatgaa480tttattactctttttggctaagactacgtactccatgtaatgacctcagttcgacgaacg540tcaaagttgagtgatggttgttcctaacgtCgtg574其相應(yīng)的氨基酸序列如下
Met Ser Asn Leu Ser Gln Arg Glu Lys Gln Leu Try Thr Arg Phe
151015 Phe His Gln Val Asp lie Asp Gly Asn Gln Tyr lie Thr Leu Asp
16202530 Glu Leu Ala Thr Leu Cys Lys Lys Leu Lys Leu Gly Leu Thr Arg 31 35 40 45 Gln Gln lie Val Asp Val Phe Met Asn Met Asp Thr Asn Asn Asn 46 50 55 60 Leu Thr lie Thr Leu Asn Glu Phe Leu Ser Ala Met Pro Lys lie 61 65 70 75 Glu Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gly Glu Met Arg Trp Ala Phe Asp 76 80 85 90 Gln lie Asp Thr Asp Gly Ser Gly Leu Leu Asp Ala Asp Glu Leu 91 95 100 105 Lys Glu Val Leu Leu Lys Cys Gly Arg Ser Leu Thr Leu Ser Gln 106 110 115 120 Val Lys Thr Met lie Ala Lys Val Asp lie Asn Gly Asp Gly Lys 121 125 130 135 Leu Asn Phe Asp Glu Phe lie Thr Leu Phe Gly
136140145
本發(fā)明根據(jù)拼接好的鈣調(diào)蛋白基因cDNA全序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，上游引物(e291F56) GGTCGGATCCATGTCCAATCTGTCGCAGAG,引入 BamH I 酶切位點(diǎn)；下游引物 (U91R540):GTCGAAAGCTTGTCATTACATGGAGTACGTAGTCTTAGCC，引入 HindIII 酶切位點(diǎn)。對(duì)雜色鮑的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pRSETA分別同時(shí)用BamHI和HindIII內(nèi)切酶切割，使用T4 DNA Iigase將載體與片段連接，再將連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化到BL21(DE3) PlyS菌株中，然后對(duì)陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，得到鈣調(diào)蛋白融合蛋白，該蛋白具有較強(qiáng)的鈣離子結(jié)合活性。本發(fā)明還通過對(duì)雜色鮑各組織的鈣調(diào)蛋白表達(dá)豐度進(jìn)行了 RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn) 該基因只在鰓中表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)鈣調(diào)蛋白基因在鮑魚中屬于首次發(fā)現(xiàn)，并且只在鮑魚的重要的免疫器官鰓中表達(dá)。


圖1是雜色鮑肌肉和內(nèi)臟團(tuán)總RNA電泳圖； 1 肌肉總RNA ；2 內(nèi)臟團(tuán)總RNA。圖2是雜色鮑cDNA的一鏈和二鏈的合成與均一化電泳圖； M :DL2000 plus ；泳道 1 :LD_PCR 擴(kuò)增 cDNA 雙鏈結(jié)果；
泳道2:11個(gè)循環(huán)的Control ；泳道3 :1/4倍DSN酶處理； 泳道4 1/2倍DSN酶處理；泳道5 1倍的DSN酶處理；泳道6 :1倍DSN處理的樣品再次PCR擴(kuò)增12個(gè)循環(huán)。圖3是菌落PCR鑒定插入片段電泳圖； A圖插入片段為0. 5-lkb的文庫(kù)克??；
B圖插入片段為1-31Λ的文庫(kù)克隆； M: DL2000 plus。圖4是雜色鮑鈣調(diào)蛋白基因與其它物種中鈣調(diào)蛋白基因Clustalw聚類分析結(jié)^ ο圖5是RT-PCR檢測(cè)鈣調(diào)蛋白在鮑魚各組織中的表達(dá)的電泳圖； 其中，actin為內(nèi)參基因。圖6是大腸桿菌(BL21)中誘導(dǎo)表達(dá)鈣調(diào)蛋白的電泳Ihour和Shour分別為鈣調(diào)蛋白表達(dá)載體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)1小時(shí)和8小時(shí)結(jié)果， 箭頭所示20. SkDa處為鈣調(diào)蛋白條帶，CK-為空載體誘導(dǎo)Ihour表達(dá)結(jié)果。圖7是融合表達(dá)的鈣調(diào)蛋白純化的電泳CK+為誘導(dǎo)過夜后的可溶性總蛋白；50mM和IOOmM分別表示用50mmol/L和IOOmmol/ L咪唑洗脫的蛋白產(chǎn)物，其中IOOmM洗脫產(chǎn)物可見目的條帶；箭頭所示為融合表達(dá)的鈣調(diào)蛋白。圖8是鈣調(diào)蛋白活性測(cè)定結(jié)果的曲線圖； Calmodulin為鈣調(diào)蛋白；BSA為牛血清白蛋白，作為對(duì)照。
具體實(shí)施例方式主要試劑
弧菌選擇性培養(yǎng)基(TCBS)購(gòu)自北京路橋生物技術(shù)有限公司；Trizol總RNA提取試劑購(gòu)自 Invitrogen 公司；Creator SMART cDNA Construction Kit 購(gòu)自 Clontech 公司； Trimmer-Director kit S Evrogen ^w] ；Ex Taq DNAdNTP> DL2000 Marker>
pDNR-LIB載體連接試劑盒、膠回收試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司。處理與采樣
雜色鮑暫養(yǎng)于水溫M±rc、鹽度3%的過濾海水中，觀察3天后用于實(shí)驗(yàn)。取哈維氏弧菌B2D接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)24h后，接種于TCBS培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)Mh，用滅菌生理鹽水稀釋至5X 105cfu/mL。取暫養(yǎng)的雌雄各5只雜色鮑，分別注射100 μ L菌液，24h 后，分別取肌肉和內(nèi)臟團(tuán)(包括鰓、肝胰腺、外套膜、性腺等)組織、用于提取總RNA0文庫(kù)的構(gòu)建總RNA提取
按照Trizol操作手冊(cè)提取雜色鮑肌肉總RNA和內(nèi)臟團(tuán)總RNA，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA質(zhì)量和含量，提取結(jié)果見圖1，箭頭所示的上方條帶為28s rRNA,下方為18s rRNA, OD260nm7280nm比值分別為2. 02和2. 05，介于1. 9 2. 2之間，符合RNA 純度要求。然后，等比例混合雜色鮑肌肉總RNA和內(nèi)臟團(tuán)總RNA。按照Creator SMART cDNA Construction Kit的操作手冊(cè)將混合后的總RNA合成一鏈和二鏈，用LD-PCR方法擴(kuò)增一鏈和二鏈。所得的產(chǎn)物再根據(jù) Trimmer-Director kit (Evrogen, Cat. No. NK002)操作，去除高拷貝基因，并對(duì)DSN處理的樣品進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。取5 μ L第二次PCR擴(kuò)增所得的產(chǎn)物，于1. 1%含EB的膠上電泳檢測(cè)cDNA合成結(jié)果(圖2的A圖)?？梢奵DNA長(zhǎng)度大于 5000bp, Smear條帶主要位于0. 5 51Λ之間，尤其在0. 75^2kb處有明顯的高拷貝基因帶， 說明需要對(duì)產(chǎn)物做均一化處理。根據(jù)"Trimmer-Director kit操作說明，進(jìn)行均一化處理。從圖2的B圖中可以看出，1倍DSN處理(泳道5)后，高拷貝基因條帶已全部消除、smear帶很均勻。取1倍DSN處理的樣品進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，12個(gè)循環(huán)后取5 μ L產(chǎn)物電泳檢測(cè)(圖2的C圖)。由第6泳道的結(jié)果可見，cDNA片段長(zhǎng)度比圖B中的結(jié)果提高明顯，達(dá)到了預(yù)期效果。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和文庫(kù)鑒定
將二次PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化后進(jìn)行^fiI酶切，然后分別割膠回收0. 5^1和 r3kb之間的片段，并與pDNR-LIB載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB感受態(tài)。取適量菌液按比例稀釋后涂于氯霉素平板上，37°C培養(yǎng)過夜，統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)并計(jì)算文庫(kù)滴度，兩個(gè)文庫(kù)庫(kù)容均為 2. 5X105cfu/mLo菌落鑒定及隨機(jī)克隆測(cè)序
挑取平板上15個(gè)菌落克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性4分鐘；35 個(gè)循環(huán)94°C變性40秒，53. 6°C退火40秒，72°C延伸4分鐘；72 °C充分延伸10分鐘。取適量 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)并估算片段長(zhǎng)度(圖3)。由圖3的A圖可見插入片段長(zhǎng)度基本在0. 5-lkb 之間，圖3的B圖中插入片段基本在1-31Λ之間，并且PCR陽性率均達(dá)到了 100%。隨機(jī)挑取10000個(gè)克隆送北京華大基因研究中心測(cè)序，使用phrap軟件對(duì)EST序列進(jìn)行拼接，并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blastx比對(duì)分析，以查找目標(biāo)基因序列，發(fā)現(xiàn)其中一條 EST序列與其它物種中已知的鈣調(diào)蛋白序列最相似(氨基酸水平相似性達(dá)到60%)，其序列參見序列表SEQ ID NO. 1，由其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見序列表SEQ ID NO. 2，但聚類結(jié)果表明該序列位于動(dòng)物、植物鈣調(diào)蛋白之外的另一分支(圖4)。鈣調(diào)蛋白特異引物設(shè)計(jì)及測(cè)序驗(yàn)證
根據(jù)NCBI的序列分析結(jié)果，以本發(fā)明的文庫(kù)中鈣調(diào)蛋白cDNA序列為模板，利用NCBI 網(wǎng)站上I^rimer-BLAST軟件設(shè)計(jì)特異引物 上游引物5，-CGAAACATTTCTGTGAAT-3，； 下游引物5’ -TGAGGTCATTACATGGAG-3，。然后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增全組織cDNA樣品。對(duì)擴(kuò)增得到的目的條帶進(jìn)行凝膠回收并送由測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與文庫(kù)序列完全一致，其序列參見序列表SEQ ID NO. 1，由其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見序列表SEQ ID NO. 2，其具有鈣調(diào)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及活性中心，其四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域分別位于蛋白序列的16 — 36、45— 72和84—109和118 —145區(qū)間；第一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的活性中心包括Asp-20、Asp-22、Asn-24和Glu-31 ；第二個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的活性中心包括Asp-56、Asn-58、Asn-60和Glu_67 ；第三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的活性中心包括Asp-93、Asp-95、Ser-97和Glu-104 ；第四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的活性中心包括Asp_129、 Asn-131、Asp-133 和 Glu-HO0鈣調(diào)蛋白在鮑魚各組織中的表達(dá)量
分別切取成熟雜色鮑的血細(xì)胞、外套膜、鰓、性腺、腹足及肝胰腺各組織，提取總RNAji RNA定量后取等量RNA反轉(zhuǎn)錄，以actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，PCR特異擴(kuò)增調(diào)整模板用量使其一致，再使用上述鈣調(diào)蛋白特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，以比較不同組織樣品中鈣調(diào)蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該基因只在鰓中表達(dá)(圖5)。重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)拼接好的鈣調(diào)蛋白基因cDNA全序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，上游引物(M91F56) GGTCGGATCCATGTCCAATCTGTCGCAGAG，引入 BamH I 酶切位點(diǎn)；下游引物(U91R540) =GTCGA AAGCTTGTCATTACATGGAGTACGTAGTCTTAGCC,引入 HindIII 酶切位點(diǎn)，引物由 invitrogen 公司合成，用水配置成lOumol/L的母液。以2.1節(jié)中內(nèi)臟團(tuán)cDNA為模板，使用HS Mix試劑盒(東盛生物，Cat#P1081)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件94°C，5min ;94°C 40sec，55°C 40sec, 72°C 40sec, 30個(gè)循環(huán)；72°C 7min。將擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pRSETA分別同時(shí)用BamHI和 HindIII內(nèi)切酶37°C切割1小時(shí)，使用T4 DNA Iigase將載體與片段16°C連接4小時(shí)，將連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3) plyS菌株中，37°C培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆。融合蛋白的表達(dá)
將陽性克隆菌株和空載體BL21 (DE3) plyS菌株分別接種于5ml含氨芐青霉素50ug/ ml和35ug/ml氯霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C，250r/min振蕩培養(yǎng)過夜。所得的陽性克隆菌液和空載體BL21 (DE3) plyS菌液分別轉(zhuǎn)接于50mL含氨芐青霉素50ug/ml和35ug/ml氯霉素的LB培養(yǎng)液中，它們均按LB培養(yǎng)液總體積的的量進(jìn)行轉(zhuǎn)接。然后于37°C振蕩培養(yǎng)至OD6Cltlnm為0.6左右時(shí)，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)；在誘導(dǎo)后的Ih和各取 ImL樣品。陽性克隆菌液和空載體BL21(DE3)plyS菌液的菌液樣品分別離心，棄上清，收集菌體，將兩種菌體分別懸于200ul含20mmol/L磷酸鈉和500mmol/L氯化鈉的緩沖液中，緩沖液pH=7. 8，超聲波破碎菌體，12000rpm離心5min，于上清液中加入適量SDS裂解液裂解， 該 SDS 裂解液含 0. 6ml pH 為 6. 8 的 1.0M Tris，50% 甘油 5ml，10% SDS 2ml, β-巰基乙醇 0. 5ml，溴酚藍(lán) 1ml，去離子水 0. 9ml，共 10ml。煮沸 5min, Tricine-SDS-PAGE 上樣電泳，電泳配方正極緩沖液:pH =8. 9的0. 2M Tris ；負(fù)極緩沖液0. IM Tris, 0. IM Tricine, 0. 1%SDS ；凝膠緩沖液36. 342g Tris, 0. 3g SDS 加水定容至 100ml pH 8. 45，過濾 4°C保存； AB-3儲(chǔ)存液49. 5%T和3%C ；AB-6儲(chǔ)存液49. 5%T和6%C ；濃縮膠250uL AB-3，凝膠緩沖液 750uL，水 2mL，10%AP 22. 5uL, TEMED 2. 25uL ；分離膠1. 6mL AB-6 ；凝膠緩沖液 2. 67mL ；甘油 630uL ；水 3. ImL ； 10% AP 40uL ；TEMED 4uL。電泳結(jié)果如圖 6 所示。融合表達(dá)蛋白的純化
取200ml陽性克隆菌液誘導(dǎo)過夜后，4°C，5500r/min離心15min，收集菌體，菌體懸于 8ml結(jié)合緩沖液，結(jié)合緩沖液20mmol/L磷酸鈉和500mmol/L氯化鈉，pH=7. 8。超聲波破碎菌體，加入！"riton-lOO、DNase和RNase至它們的終濃度分別為l%、5ug/ml和5ug/ml，4°C 搖床孵育lOmin，4°C，5000r/min離心30min，上清液用0. 45um濾膜過濾備用。將Ni-瓊脂糖凝膠混勻，取2ml裝入Ni-瓊脂糖凝膠6FF層析柱(Sobarbio，Cat#P2010)自然沉降，用 3倍體積無菌水沖洗，用3倍體積結(jié)合緩沖液平衡凝膠，制備成M2+親和柱；將制備的上清液加入M2+親和柱，控制流速為10個(gè)柱體積/h，用6個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液洗柱，用4個(gè)柱體積的洗滌緩沖液洗柱，洗滌緩沖液20mmol/L磷酸鈉，500mmOl/L氯化鈉，Ph=6. 0 ；直至流過液A280<0. 01，然后在層析柱中加入經(jīng)過濾處理的上清液，用6個(gè)柱體積的lOOmmol/L 的咪唑洗脫緩沖液洗脫蛋白，咪唑洗脫緩沖液為咪唑和洗滌緩沖液的混合液。重復(fù)上述操作，洗脫蛋白時(shí)采用6個(gè)柱體積的50mmol/L的咪唑洗脫緩沖液洗脫蛋白。洗脫后的蛋白Tricine-SDS-PAGE上樣電泳檢測(cè)，如圖7所示，箭頭所示即為鈣調(diào)蛋白。
鈣調(diào)蛋白活性檢測(cè)
將純化的鈣調(diào)蛋白和BSA蛋白(牛血清白蛋白，國(guó)產(chǎn)分析純)分別用20mmol/L pH為7. 8 的磷酸二氫鈉配置成500mg/L的溶液，加入5%的離子親和樹脂Analytical Grade Chelex 100 Resin (Biorad, Cat#142_2822，Lot#5532)，室溫?cái)嚢?小時(shí)，以除凈蛋白中結(jié)合的 Ca2+離子干擾。然后5000rpm，離心5min，吸取上清，按比例加入20mmol/L的磷酸二氫鈉 (pH7. 8)，將鈣調(diào)蛋白和 BSA 分別稀釋成 100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L 和 500mg/L 的溶液，向上述溶液中分別加入終濃度為5mmol/L的CaCl2,室溫?cái)嚢?0min，期間校正溶液pH 使其維持在7. 8，使用鈣含量比色檢測(cè)分析試劑盒(Biovision，Cat#K380-250, Lot#95877) 測(cè)定溶液中的鈣離子濃度。如圖8所示，鈣調(diào)蛋白相比于BSA具有很強(qiáng)的鈣離子結(jié)合活性， 而BSA則無鈣離子結(jié)合活性，因此，鈣調(diào)蛋白濃度越高，溶液中的可溶性鈣含量也越高。
權(quán)利要求
1.一種雜色鮑鈣調(diào)蛋白CDNA序列，其特征在于它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜色鮑鈣調(diào)蛋白cDNA序列，其特征在于它的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所述。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜色鮑鈣調(diào)蛋白cDNA序列，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。本發(fā)明提供的鈣調(diào)蛋白基因在鮑魚中屬于首次發(fā)現(xiàn)，并且只在鮑魚的重要的免疫器官鰓中表達(dá)。由于弧菌病原的感染能夠上調(diào)其表達(dá)，說明該鈣調(diào)蛋白基因在鮑魚免疫抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102382840SQ201110345360
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者劉廣鋒, 姜敬哲, 王江勇, 王瑞旋 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所