專利名稱：一種用于生產(chǎn)新型微生物源殺菌劑的生物工程菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物源農(nóng)藥生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于生產(chǎn)新型微生物源殺菌劑的生物工程菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物病害引起的損失幅度約占總產(chǎn)量的25 75%，以我國主要的糧食作物水稻為例，每年種植面積約4億畝，按畝產(chǎn)量400公斤，水稻病害平均引起減產(chǎn)10%計(jì)，每年造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)300多億元人民幣之巨，嚴(yán)重威脅糧食作物的安全生產(chǎn)。目前，生產(chǎn)上控制植物病害除了選用良種和改進(jìn)栽培措施外，主要依靠噴灑化學(xué)殺菌劑。目前使用的大多化學(xué)殺菌劑對人體和動物具有不同程度的毒害作用，殘留在植物可食部分的有害成份會對人體健康造成潛在威脅，已經(jīng)引起政府和社會各階層的關(guān)注；不僅如此，有些化學(xué)農(nóng)藥難以分解，會長期地累積在生態(tài)系統(tǒng)中，造成對環(huán)境的污染，不利于社會經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展；而且， 現(xiàn)有的化學(xué)農(nóng)藥對某些植物病害并不完全有效。因此，在努力發(fā)展新一代化學(xué)農(nóng)藥的同時(shí)， 還需要大力研究和發(fā)展高效、安全、經(jīng)濟(jì)、對環(huán)境相容性好的生物源農(nóng)藥。目前，在生產(chǎn)上已經(jīng)推廣使用的生物源農(nóng)藥，其種類和數(shù)量都較少，有些品種則由于使用年久，引起了植物病原菌的抗藥性，防治效果不夠理想。以水稻紋枯病為例，防治該病害的藥劑主要依賴于老牌生物源農(nóng)藥井崗霉素。但是，經(jīng)過將近40年的長期使用，部分水稻紋枯病菌的融合群已產(chǎn)生抗藥性；而且，井崗霉素僅對水稻紋枯病菌有效，對其他病原菌沒有明顯的防治效果，使用范圍具有很大的局限性。生物農(nóng)藥促生拈抗菌M18，對植物病害具有高效、安全、廣譜的殺菌作用，與環(huán)境相容性好，易于在環(huán)境中解體。該促生拈抗菌M18已于2000年6月27日在中國專利局指定的保藏單位北京，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為 CGMCCN0. 0462。生物農(nóng)藥促生拈抗菌M18的制備和應(yīng)用，已經(jīng)獲得國家發(fā)明專利，專利號為 00119857. 2。但是，生物農(nóng)藥促生拈抗菌M18是一種活菌菌劑，其作用機(jī)理主要是通過M18 活菌合成抗植物病害的活性成分實(shí)現(xiàn)對農(nóng)作物植物病源菌的抑制作用，其合成的活性成分含量容易受到菌體本身的代謝調(diào)控機(jī)制和環(huán)境條件的影響。因而，對植物病害的防治效果具有不穩(wěn)定性的缺陷，難以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)行大規(guī)模的推廣應(yīng)用。已經(jīng)查明，促生拈抗菌M18防治植物病害的主要活性成分是吩嗪-1-羧酸，從促生拈抗菌M18的發(fā)酵液中提取吩嗪-1-羧酸，利用活性成分而不是活菌對農(nóng)作物病害的防治同樣具有高效、安全、廣譜、與環(huán)境相容性好等特征；同時(shí)，能克服利用促生拈抗菌M18防治病害效果不穩(wěn)定性的缺陷。但是，利用促生拈抗菌M18發(fā)酵，合成活性成分吩嗪-1-羧酸的效價(jià)很低，僅為每升200毫克左右，如何提高發(fā)酵效價(jià)，降低使用成本，成為開發(fā)本產(chǎn)品的瓶頸所在。近年來，我們已經(jīng)運(yùn)用分子生物學(xué)的技術(shù)，對促生拈抗菌M18合成吩嗪-1-羧酸的調(diào)控機(jī)制，開展深入地研究。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用基因工程手段，對促生拈抗菌M18基因組中的雙組分調(diào)控基因gacA開展了定向失活突變，獲得了 M18衍生菌株M18G，大大提高了吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量，使其發(fā)酵效價(jià)達(dá)到每升1500-1700毫克左右。該研究成果的技術(shù)方法已經(jīng)于2004年在《微生物學(xué)報(bào)》44卷第761 765頁公開，論文題目為《假單胞菌gacA插入突變對藤黃綠菌素和吩嗪-1-羧酸合成代謝的差異性調(diào)控》。在2006年，名稱為“利用促生拈抗菌M18衍生菌株制備殺菌劑的方法”的中國發(fā)明專利中(專利號ZL200610023459. 9)， 提供一種了利用促生拈抗菌M18衍生菌株M18G和M18R制備殺菌劑的方法，利用微生物的代謝產(chǎn)物而非微生物活體制備殺菌劑，通過兩種衍生菌株的代謝產(chǎn)物的復(fù)配，達(dá)到提高防治效果的目的。2009年，我們又發(fā)明了利用工程菌株M18G攜帶質(zhì)粒pME6032Phz生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的方法，能使吩嗪-1-羧酸的發(fā)酵效價(jià)達(dá)到每升5700 6600毫克的水平，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模推廣應(yīng)用。該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)獲得國家發(fā)明專利，專利號ZL200910198664.2。以吩嗪羧酸為主要成分的微生物源殺菌劑，我國農(nóng)藥命名單位已經(jīng)定名為申嗪霉素。申嗪霉素原藥和1 %申嗪霉素懸浮劑于2011年獲得了農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的正式登記證(登記號PB20110314和PB20110315)。農(nóng)業(yè)部已經(jīng)將申嗪霉素列入“十二五” 期間全國推廣產(chǎn)品(證書號TG2011-002)。但是，吩嗪-1-羧酸對病源菌的防病作用與使用時(shí)的酸度(pH)值密切相關(guān)，在PH 值7. 0的條件下，其抗菌活性僅為pH值5. 0條件下的20%，大大降低了吩嗪-1-羧酸在堿性條件下的防病效果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，促生拈抗菌M18及其衍生菌株M18G的基因組中，phzH基因是一個(gè)已經(jīng)發(fā)生突變的失活基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種用于生產(chǎn)新型微生物源殺菌劑的生物工程菌株及其應(yīng)用技術(shù)。本發(fā)明利用生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株，攜帶能表達(dá)PhzH基因、編碼產(chǎn)生WizH(glu taminephenazine-l-carboxylic acid amidotransferase, IjtI^ 1 )" W^MiW^!^ 酶，PhzH)的重組表達(dá)質(zhì)粒，補(bǔ)充并添加phzH基因的拷貝數(shù)，并在工程菌株中進(jìn)行表達(dá)，將吩嗪-ι-羧酸轉(zhuǎn)化為吩嗪-ι-羧酸酰胺。吩嗪-ι-羧酸酰胺的抗菌活性不受其使用條件的酸度值影響，從而穩(wěn)定其抗菌活性，能更加有效地防治作物病害。本發(fā)明首先公開了一種用于生產(chǎn)微生物源殺菌劑的生物工程菌株，為將phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株后獲得，所述生物工程菌株產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺。本發(fā)明還公開了所述用于生產(chǎn)該微生物源殺菌劑的生物工程菌株的構(gòu)建方法，包括下列步驟1)擴(kuò)增PhzH基因片段；2)將擴(kuò)增的phzH基因片段插入表達(dá)載體中構(gòu)建成phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒；3)將構(gòu)建的phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株，構(gòu)建成所述用于生產(chǎn)微生物源殺菌劑的生物工程菌株。所述phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒為克隆有phzH基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒。所述phzH 基因重組表達(dá)質(zhì)粒能在所述產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株中表達(dá)phzH基因，編碼產(chǎn)生WizH (谷酰胺吩嗪-ι-羧酸酰胺轉(zhuǎn)移酶)。本發(fā)明所述的phzH基因包含phzH基因的編碼區(qū)及其非編碼區(qū)。
所述的phzH基因片段可以是完整的phzH基因也可以是phzH基因的一部分。本發(fā)明所述的PhzH基因片段應(yīng)至少包含phzH基因的完整編碼區(qū)。較佳的，為利于高效表達(dá)為PhzH，所述phzH基因片段包含phzH基因的完整編碼區(qū)及其5，端的非編碼區(qū)。所述phzH 基因片段所包含的5’端的非編碼區(qū)可以為部分的或是完整的phzH基因5’端非編碼區(qū)。 所述PhzH基因片段所包含的phzH基因5’端非編碼區(qū)應(yīng)當(dāng)有利于WizH的表達(dá)。優(yōu)選的， phzH基因片段所包含的5’端的非編碼區(qū)含有自phzH基因翻譯起始密碼子上游第1位堿基始至其上游第683位堿基止的多核苷酸片段。進(jìn)一步的所述WizH為假單胞菌的WizH。所述phzH基因片段為假單胞菌的phzH
基因片段。優(yōu)選的，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌(I^eudomonas aeruginosa)或綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。具體可選自銅綠假單胞菌株 PAOl、LESB58、PA14、PUPa3 或綠針假單胞菌株P(guān)CL1391。進(jìn)一步的，所述WizH來源于銅綠假單胞菌株P(guān)AOl。如實(shí)施例所列舉的，其氨基酸
序列為SEQ ID NO 1
MCGLAGffVDYTRKLDDEFPAIFAMTDTLALRGPDAEGIWKHRNALLGHRRLAVIDLSGGV60
QPMSYRFPTGQEVTLVYTGEVYNHDALRERLRRAGHEFRTRSDTEVVLHAYLQffGERCCE120
YLTGMFAFAVFDGRDGHLLLVRDRLGI肌YYARHREGLLFGSEIKSILAHPEFMRLDA180
VGLVDLLTLSRGTSQTPFREVQELLPGHLLSffRPNSQAKLRRYWEVRRQEHADDLQSTVQ240
RTRELVTRALGAQLHADVPVCSLLSGGLDSTALTGIAQRIAKAEHGGDINSFSVDFVGQA300
EQFRSDDLRPDQDQPFALLAAQYIGSRHRTVLIDNAELVCERAREEVFRAKDVPFTFGDM360
DTSLHLMFGEIRRHSTVAISGEGADELFGGYGWFRDPQAVAMRFPffASRVRLPAGFIDA420
GFNRRCDLLQYQQASYDDGLRQVEHLAGDSPEERRMREFSHLHLKRWMVLLLERKDRLSM480
CNGLEVRVPYTDHELVEYVYNVPffSIKSRDGEEKffLLKRACADYVPEAVLKRRKSPYPTS540
ANLGYERFLRGSVRRLLEDAVNPVFGIVSREFLMELEHPEGYFNTQVSRHNLETALALE600
GffLRLYGLSA610 進(jìn)一步的，所述phzH基因片段來源于銅綠假單胞菌株P(guān)AOl基因組。如實(shí)施例所列舉的，其堿基序列為SEQ ID NO 2 gtccgaggacccgtgcagcgggccggtgttcggtccgtcgacctgcgaatgcccttgagg60
taggtcgtctggcgggcccggtgcagcgggcccgcttccggatgtatcgctcgctcgaag120
ttgccttctttaattctccattccccgcgccgccctacttttcccgctcgtccatcgtcg180
cgtcgaacgttgccacgaaatcagcgtcgatggacaactcttatattcaatagttgtacg240
atctgagtttgttgtagtcatttgcttagttggctattcatatgattgccgtaaagcaac300
tataagtttaattggattagccttctaagtctttggaaagagccgtgaacgaccctgtaa360
tatctggttgtagagccgcgtaatgatgtttcaggatatttcattaattttgtagattat420
tgtttttcctttgtttttttaaaaacagctaccagatttagatagatattaattaactcg480
gccacgttttttcctgttctatcattggccttccttgggcgcaggcctgccgaaactgct540
tatcttcaggtcctcgaaaagttcatacatcgaccgccttgggcgaagcattcgtacgcc600
ggaaatctgtccggccgcacggatgttttcagcatgttctctggatgagtttcccgataa660
clCclt Cclclt ￡1gaggagtttccctatgtgcggtctcgcgggttgggtggattacacgcgca720
agctcgacgacgaatttccggcgatcttcgccatgaccgatacgctcgccatgcgcgggc780
cggatgccgagggcatctggaagcaccgcaacgccctgctgggtcaccggCggCtggCgg840
tcatcgacctcagcggcggcgtgcagccgatgtcctatcgctttcccaccggccaggagg900
tcaccctcgtctacaccggcgaggtgtacaaccacgatgccctgcgcgagCggttgCgCC960
gggccggacatgagttccgcacccgcagcgataccgaggtggtcctgcacgcctatctgc1020
aatggggcgagcgttgttgcgagtacctgaccgggatgttcgccttcgccgtcttcgatg1080
gccgcgacggccacctgctgCtggtgCgCgaccgcctgggcatcaagccgctgtattacg1140
cgcggcaccgcgagggactgctgttcggctcggagatcaagtccatcctggcgcatccgg1200
aattcgccgccaggctcgacgcggtcggcctggtcgacctcctgacgctgtcccggggca1260
cttcgcagacgccgttccgcgaggtccaggaactgctgcccggccacctgctgtcctggc1320
gtcccaattcccaggcgaagttgcgccgctattgggaggtacgccgccaggagcatgccg1380
acgacctgcagagcaccgtgcagcgcacccgcgaactggtcacccgcgccctgggggcgc1440
aattgcacgccgacgttccggtgtgttcgctgctatcgggtgggctcgattcgaccgccc1500
tgaccggcatcgcccagcgcatcgcgaaggcggagcacggcggcgacatcaattcattct1560
cggtggacttcgtcggccaggccgagtagttccgcagcgacgacctgcgtcccgaccagg1620
accagccgttcgccctgctggccgcgcagtacatcggcagccgtcatcgcaccgtgctca1680
tcgacaatgccgaactggtctgcgaacgagcgcgcgaagaggtattccgggccaaggacg1740
tacctttcaccttcggcgacatggatacctcgctgcacctgatgttcggcgagatccgcc1800
ggcattccacggtggccatctccggtgaaggcgccgacgagctgttcggtggctacggct1860
ggttccgcgatccgcaggcggtggctgcggcgcgcttcccctgggcctccagggtgcgcc1920
tgccagccggcttcatcgacgccggtttcaaccgccgctgcgatctcctccagtaccagc1980
aggccagctacgacgatgggctgcgccaggtcgaacacctggccggcgacagcccggagg2040
agcggcggatgcgcgagttcagccacctgcatctgaagcgctggatggtgctgctgctcg2100
aacgcaaggatcgcctgagcatgtgcaacggcctggaggtgcgggtgccctacaccgacc2160
atgagctggtggagtacgtctacaacgtgccctggtcgatcaagagccgggacggcgagg2220
agaagtggctgctcaagcgggcctgcgccgactatgtcccggaagccgtgctcaagcgcc2280
gcaagagcccttatccgacttctgccaacctcggctacgagcgtttcctgcgcgggagcg2340
tgcggcgtctgctggaggacgcggcgaaccCggtgttCggcatcgtttcgcgagagttcc2400
tggccgccgaactggagcatccggaggggtacttcaacacccaggtgagccgccacaacc2460
tggagaccgcgctggcgctggaaggctggctcaggttgtacgggctctccgcctga2516堿基序列中帶有下劃線并加粗的密碼子分別為phzH基因的起始密碼子和終止密碼子，起始密碼子之前的堿基為PhzH基因的5’端的非編碼區(qū)。進(jìn)一步的，用于構(gòu)建phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)載體為大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒。為了讓phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒能夠正確表達(dá)phzH基因，需要保證插入大腸桿菌 /假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)處的PhzH基因讀碼框正確。較佳的，為了促進(jìn)WizH的高效表達(dá)，所述大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒含有強(qiáng)啟動子，且所述PhzH基因片段克隆于所述強(qiáng)啟動子之后，由該強(qiáng)啟動子控制其表達(dá)。所述強(qiáng)啟動子可為噬菌體啟動子T3prom或T7prom。
在所述質(zhì)粒的特定位置插入目的基因并保證目的基因的讀碼框正確是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)。所述大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)?？蔀閜BBRlMCS系列質(zhì)粒及其衍生的各種表達(dá)質(zhì)粒。如實(shí)施例列舉的，所述大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒為 pBBRlMCS-5。可以通過合適的引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增phzH基因片段在保證讀碼框正確的前提下， 置于pBBRlMCS-5的噬菌體啟動子T3prom控制下獲得基因重組表達(dá)質(zhì)粒pBBRphzH。所述產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株是指可經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的野生型菌株及其衍生的工程菌株。進(jìn)一步的，所述產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株屬于假單胞菌，如M18、M18G。所述M18的保藏號為CGMCC NO. 0462，為一種生物農(nóng)藥促生拈抗菌，可活菌合成抗植物病害的活性成分吩嗪-1-羧酸，M18為現(xiàn)有技術(shù)。所述M18G菌株為M18 (CGMCC NO. 0462)的衍生菌株，為現(xiàn)有技術(shù)。其制備方法已為公知，如2004年在《微生物學(xué)報(bào)》44卷第761 765頁，《假單胞菌gacA插入突變對藤黃綠菌素和吩嗪-1-羧酸合成代謝的差異性調(diào)控》。相比M18，M18G的吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量獲得了很大的提升，因此，本發(fā)明優(yōu)選的產(chǎn)吩嗪-1-羧酸工程菌株為M18G。由于產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的野生型菌株及其衍生的工程菌株能產(chǎn)生吩嗪-1-羧酸，所述phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒又能在產(chǎn)吩嗪-1-羧酸工程菌株中表達(dá)PhzH基因，其編碼產(chǎn)物谷酰胺吩嗪-ι-羧酸酰胺轉(zhuǎn)移酶能將吩嗪-ι-羧酸酰胺化，合成吩嗪-ι-羧酸酰胺(吩嗪-ι-羧酸酰胺的分子結(jié)構(gòu)式見圖1)，因此，本發(fā)明所述生物工程菌株的代謝產(chǎn)物中含有吩嗪-1-羧酸酰胺。phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)吩嗪-1-羧酸工程菌株的方法為常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。本發(fā)明的用于生產(chǎn)微生物源殺菌劑的生物工程菌株可用于發(fā)酵生產(chǎn)本發(fā)明的微生物源殺菌劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種微生物源殺菌劑，所述微生物源殺菌劑為本發(fā)明的生物工程菌株的發(fā)酵液。所述發(fā)酵液中，主要的殺菌活性成分為吩嗪-1-羧酸酰胺。此外，還含有微量的殺菌活性成分藤黃綠菌素。進(jìn)一步的，所述發(fā)酵液中，吩嗪-1-羧酸酰胺的含量為每升2500 觀00毫克。本發(fā)明進(jìn)一步公開了所述微生物源殺菌劑的制備方法，為在合適表達(dá)吩嗪-1-羧酸及WizH的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明的生物工程菌株后獲得。進(jìn)一步的，所述微生物源殺菌劑的制備方法包括下列步驟1.工程菌株的活化；2.種子擴(kuò)大培養(yǎng)先在甘油培養(yǎng)液中搖瓶培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接入產(chǎn)素培養(yǎng)液中放大發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液。所述工程菌株活化可采用固體甘油培養(yǎng)基活化培養(yǎng)。所述的甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨1. 8 2. 2%、甘油1. 3 1. 7%、硫酸鎂0.05 0. 1%、磷酸二氫鉀0.01 0.05%、余量為水，pH 6. 8 7. 2。所述的固體甘油培養(yǎng)基中含有的組分重量百分比為蛋白胨1. 8 2. 2%、甘油 1.3 1.7%、硫酸鎂0. 05 0. 1%、磷酸二氫鉀0.01 0. 05%、瓊脂1. 2-1. 5%、余量為水，pH 6. 8 7. 2。
所述的產(chǎn)素培養(yǎng)液的組分重量百分比為蛋白胨2. 2 3.0%、葡萄糖2.0 2. 5%、硝酸鉀0. 5 0. 7%、余量為水，ρΗ6· 5 7. 0。較佳的，工程菌株的活化條件為將工程菌接入甘油培養(yǎng)基平板，在沈 30°C下， 活化生長20 M小時(shí)；而后再次在甘油培養(yǎng)基的平板上劃菌塊，26 30°C下活化10 12 小時(shí)。較佳的，所述種子擴(kuò)大培養(yǎng)中，在甘油培養(yǎng)液中搖瓶培養(yǎng)條件為將活化后的菌株接入甘油培養(yǎng)液、26 30°C振蕩培養(yǎng)9 11小時(shí)。震蕩培養(yǎng)時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速可為160 180
轉(zhuǎn)/分。較佳的，所述種子擴(kuò)大培養(yǎng)中，接入產(chǎn)素培養(yǎng)液中放大發(fā)酵培養(yǎng)的條件為將甘油培養(yǎng)液中搖瓶培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接入含有產(chǎn)素培養(yǎng)液中，在26 30°C下發(fā)酵培養(yǎng)60 72小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速可為160 180轉(zhuǎn)/分。本發(fā)明所述微生物源殺菌劑可用于防治植物病害或用于制備防治植物病害的藥劑。進(jìn)一步的，用于對農(nóng)作物進(jìn)行噴霧或灌根施用，防治水稻紋枯病、水稻白葉枯病、 水稻稻曲病、小麥赤霉病、黃瓜枯萎病、西瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、棉花枯萎病、炭疽病、立枯病和各種腐霉或疫霉引起的植物病害。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了一種防治植物病害的藥劑，含有殺菌有效量的本發(fā)明所述微生物源殺菌劑或其殺菌活性成分?？蓪⒈景l(fā)明的用于生產(chǎn)微生物源殺菌劑的生物工程菌株的發(fā)酵液直接用作防治植物病害的藥劑；也可將所述發(fā)酵液常規(guī)方法干燥成粉后作為殺菌活性成分原料與其他常規(guī)輔料一并配置防治植物病害的藥劑；或者，也可將發(fā)酵液中的主要?dú)⒕钚猿煞址脏?1-羧酸酰胺分離出后，作為殺菌活性成分原料用于配制防治植物病害的藥劑。本發(fā)明利用產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株攜帶重組表達(dá)載體，生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺的方法的優(yōu)點(diǎn)是1抗菌活性穩(wěn)定性好，不受酸度影響。利用本發(fā)明生產(chǎn)的吩嗪-1-羧酸酰胺，不僅具有高效的抗真菌能力，而且在PH值4. 0至8. 0的范圍內(nèi)，不受使用環(huán)境的酸度影響，無論在種植在酸性還是堿性環(huán)境中的作物上使用，都能獲得穩(wěn)定的防治效果。2轉(zhuǎn)化率高。本發(fā)明中通過構(gòu)建攜帶PhzH基因的完整編碼區(qū)及其5’端的非編碼區(qū)的基因重組質(zhì)粒，將宿主中的吩嗪-1-羧酸轉(zhuǎn)化為吩嗪-1-羧酸酰胺。在優(yōu)選方案中，由于PhzH基因及其5’端的非編碼區(qū)片段置于噬菌體強(qiáng)啟動子T3pr0m的控制下高效表達(dá)，同時(shí)重組質(zhì)粒在宿主M18G具有多個(gè)拷貝，在宿主M18G中phzH基因能大量表達(dá)并合成酰胺化酶，將吩嗪-ι-羧酸全部轉(zhuǎn)化為吩嗪-ι-羧酸酰胺，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)100 %。3生產(chǎn)成本低，經(jīng)濟(jì)效益高。運(yùn)用本發(fā)明生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺，除了研制和構(gòu)建工程菌株所耗費(fèi)的一次性的前期成本外，一旦實(shí)施產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，除了消耗培養(yǎng)基外，不需要進(jìn)一步的添加其他原料和消耗額外的能量，隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大和延續(xù)，單位產(chǎn)量的平均生產(chǎn)成本不斷下降，利于在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中獲得大規(guī)模推廣應(yīng)用。4實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)，保護(hù)環(huán)境。運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺，能將全部吩嗪-1-羧酸轉(zhuǎn)化為吩嗪-1-羧酸酰胺，在生產(chǎn)過程中，除了消耗培養(yǎng)基外，不使用其它特殊的原料，也不形成任何其它的中間產(chǎn)物。所以，不會產(chǎn)生新的污染物釋放到環(huán)境中去，能實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)，保護(hù)環(huán)境生態(tài)。


圖1為本發(fā)明中吩嗪-1-羧酸酰胺的分子結(jié)構(gòu)式。圖2為本發(fā)明中質(zhì)粒pBBRphzH的構(gòu)建示意圖。本發(fā)明涉及一種利用工程菌株M18G攜帶質(zhì)粒pBBRphzH生產(chǎn)吩嗪羧酸酰胺的方法，從銅綠假單胞菌PAOl基因組中擴(kuò)增出phzH基因及其5’端的非編碼區(qū)片段，并將該片段插入表達(dá)質(zhì)粒PBBR1MCS-5中，置于噬菌體啟動子T3prom的控制下，構(gòu)建成重組質(zhì)粒 pBBRphzH ；然后將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入促生拈抗菌M18的衍生菌株M18G中，構(gòu)建成基因工程菌株M18G/pBBRphzH。該工程菌株實(shí)現(xiàn)了谷酰胺吩嗪羧酸酰胺轉(zhuǎn)移酶WizH的高效穩(wěn)定表達(dá)。最后將基因工程菌株M18G/pBBRphzH在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，高效穩(wěn)定地生產(chǎn)吩嗪羧酸酰胺。利用本發(fā)明的高產(chǎn)基因工程菌株制備吩嗪-ι-羧酸酰胺，其防治病害的效果不受酸度條件影響，其生產(chǎn)成本能進(jìn)一步降低，無論在酸性或堿性環(huán)境使用，都有效地防治植物病害。圖3為相同濃度的吩嗪-1-羧酸(PCA)和吩嗪-1-羧酸酰胺(PCN)，在不同酸度條件的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，對水稻紋枯病菌的抑菌活性的比較結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)中采用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基成分的重量百分比為，馬鈴薯20 %，葡萄糖2 %，瓊脂粉1.2%，余量為水。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例利用促生拈抗菌M18的衍生菌株M18G攜帶重組質(zhì)粒 pBBRphzH的方法構(gòu)建基因工程菌株M18G/pBBRphzH，在M18G菌株中補(bǔ)充并添加phzH基因的完整編碼區(qū)及其5’端的非編碼區(qū)片段的拷貝數(shù)，將吩嗪-1-羧酸轉(zhuǎn)化為吩嗪-1-羧酸酰胺，以生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例從銅綠假胞菌株P(guān)AOl中擴(kuò)增出PhzH基因的完整編碼區(qū)及其 5’端的非編碼區(qū)片段，并將該片段插入表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS-5中，置于噬菌體啟動子T3pr0m 的控制下，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pBBRphzH ；然后，將該重組質(zhì)粒pBBRphzH導(dǎo)入促生拈抗菌M18 的衍生菌株M18G中，構(gòu)建成基因工程菌株M18G/pBBRphzH，該工程菌株能夠?qū)崿F(xiàn)phzH基因的高效穩(wěn)定表達(dá)。最后，基因工程菌株M18G/pBBRphzH在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，高效穩(wěn)定地生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺，而不是吩嗪-1-羧酸，吩嗪-1-羧酸酰胺的產(chǎn)量達(dá)到每升2500 觀00 毫克的水平。在PH等于或大于7. 0的條件下，吩嗪-1-羧酸酰胺的抗水稻紋枯病的活性， 與吩嗪-1-羧酸相比，提高了 5倍以上。按此抗菌活性推算，單位體積發(fā)酵液中生產(chǎn)的吩嗪-ι-羧酸酰胺的抗菌活性大大超過吩嗪-ι-羧酸的抗菌活性。本發(fā)明構(gòu)建基因工程菌株M18G/pBBRphzH及利用該菌株生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺的具體方案為1、擴(kuò)增phzH基因及其5’端的非編碼區(qū)片段。設(shè)計(jì)一對引物，引物的核苷酸序列如下正向5，-CGCGCTCGAGGTCCGAGGACCCGTGCAGC-3‘(SEQ ID NO 3)反向5，-CGCGAAGCTTTCAGGCGGAGAGCCCGTAC-3‘(SEQ ID NO 4)
序列中下劃線為限制性內(nèi)切酶Bio I.Hind III的酶切位點(diǎn)；然后以銅綠假單胞菌 PAOl基因組DNA為模板，利用DNA聚合酶LA Taq和設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增phzH基因及其5，端的非編碼區(qū)片段，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳檢測，回收長度為2. 5kb的phzH基因及其5’端的非編碼區(qū)片段。2、構(gòu)建重組質(zhì)粒pBBRphzH將回收的基因擴(kuò)增片段phzH及其5’端的非編碼區(qū)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bio I>Hind III酶切，在連接酶的作用下，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS-5中的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，將PhzH基因的完整編碼區(qū)及其5’端的非編碼區(qū)的表達(dá)置于噬菌體啟動子 T3prom控制下，形成重組質(zhì)粒pBBRphzH并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌；在慶大霉素抗性平板上，篩出經(jīng)pBBRphzH轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子；從大腸桿菌中提取構(gòu)建的基因重組質(zhì)粒pBBRphzH。
3、構(gòu)建基因工程菌株M18G/pBBRphzH0制備促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受態(tài)細(xì)胞，并將上述基因重組質(zhì)粒 pBBRphzH轉(zhuǎn)化到M18G的感受態(tài)細(xì)胞中，在觀 37°C條件下，培養(yǎng)1 2天，從中篩選出基因工程菌株M18G/pBBRphzH04、基因工程菌株M18G/pBBRphzH的培養(yǎng)。將基因工程菌株M18G/pBBRphzH接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在沈 30°C下，活化生長20 M小時(shí)，再次在甘油培養(yǎng)基的平板上劃菌塊，26 30°C下活化10 12小時(shí)， 然后將活化的M18G/pBBRphzH菌塊，轉(zhuǎn)接到含有25毫升甘油培養(yǎng)液、體積為250毫升的三角瓶中，在^ 30°C的搖床中振蕩培養(yǎng)9 11小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為160 180轉(zhuǎn)/分；最后轉(zhuǎn)接到含有65毫升的產(chǎn)素培養(yǎng)液、體積為500毫升的三角瓶中，進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間為60 72小時(shí)，得到吩嗪-1-羧酸酰胺的產(chǎn)量為每升2500 觀00毫克。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如分子克隆試驗(yàn)手冊中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配制。以下實(shí)施例不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。實(shí)施例11、擴(kuò)增phzH基因及其5’端的非編碼區(qū)片段設(shè)計(jì)一對引物，用以擴(kuò)增phzH基因及其5’端的非編碼區(qū)片段，引物的核苷酸序列如下正向.5，-CGCGCTCGAGGTCCGAGGACCCGTGCAGC-3，反向5，-CGCGAAGCTTTCAGGCGGAGAGCCCGTAC-3‘序列中帶有下劃線的核苷酸為限制性內(nèi)切酶Bio I.Hind III的酶切位點(diǎn)。該引物委托上海生工生物工程有限公司合成。然后，以銅綠假單胞菌PAOl基因組DNA為模板，利用DNA聚合酶LA Taq和上述設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增PhzH基因的完整編碼區(qū)及其5’端的非編碼區(qū)的片段，產(chǎn)物通過0. 7%瓊脂糖電泳檢測，回收長度約為2. 5kb的phzH基因的完整編碼區(qū)及其5’端的非編碼區(qū)的片段， 基因片段經(jīng)核苷酸測序驗(yàn)證為準(zhǔn)確。其中，所述銅綠假單胞菌PAOl基因組DNA的制備利用 AxyPrep細(xì)菌基因組DNA試劑盒進(jìn)行，基因片段的回收利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行，均由愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司提供，產(chǎn)品目錄號分別為AP-MN-BT-GDNA-4和 AP-GX-50;所述基因擴(kuò)增反應(yīng)的條件以及瓊脂糖電泳，分別按照J(rèn).薩姆布魯克、D. W.拉塞爾編著，2002年科學(xué)出版社出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，第8章第611 618頁和第5章第387 400頁中所述的方法進(jìn)行。其中，所使用的DNA聚合酶LA Taq和基因擴(kuò)增試劑盒，購自TAKARA公司上海代理公司，產(chǎn)品目錄號DRR002AG。瓊脂糖購自GENE TECH 公司上海代理公司?；蚱?PhzH及其5’端的非編碼區(qū))的核苷酸測序驗(yàn)證委托上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，測序結(jié)果證實(shí)基因片段含SEQ ID NO :2，其編碼的蛋白氨基酸序列為 SEQ ID NO :1ο2、構(gòu)建重組質(zhì)粒pBBRphzH將步驟1中回收的基因擴(kuò)增片段(phzH及其5’端的非編碼區(qū))，經(jīng)限制性內(nèi)切酶)(h0 I.Hind III酶切后，在連接酶的作用下，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒 pBBRlMCS-5中相應(yīng)的位點(diǎn)，并將基因phzH及其5’端的非編碼區(qū)片段的表達(dá)置于噬菌體啟動子T3pr0m控制下，形成重組質(zhì)粒pBBRphzH并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌。在慶大霉素抗性平板上，篩出經(jīng)pBBRphzH轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子；最后，從大腸桿菌轉(zhuǎn)化子中提取構(gòu)建的基因重組質(zhì)粒pBBRphzH并驗(yàn)證。構(gòu)建的基因重組質(zhì)粒pBBRphzH如圖2所示，含有phzH基因的完整編碼區(qū)及其 5’端的非編碼區(qū)片段經(jīng)限制性酶Bio I.Hind III酶切后，在連接酶的作用下，插入質(zhì)粒pBBRlMCS-5中的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，置于噬菌體啟動子T3prom的控制下，構(gòu)建成重組質(zhì)粒 pBBRphzH。圖2中4766bp表示質(zhì)粒pBBRlMCS-5的長度，為4766個(gè)堿基對；圖中，phzH代表谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺轉(zhuǎn)移酶編碼基因；//為基因縮短片段的符號；》io I.Hind III 為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；圖中的數(shù)字表示連接到pBBRlMCS-5質(zhì)粒中的phzH基因的編碼序列及其5，非編碼區(qū)的核苷酸序列的長度，分別為1833bp和68;3bp ；Gm為質(zhì)粒pBBRlMCS-5中抗慶大霉素的選擇標(biāo)記基因；T3prom和T7prom為兩個(gè)噬菌體啟動子；mob所標(biāo)記的為質(zhì)粒轉(zhuǎn)移所需要的基因；rep所標(biāo)記的為質(zhì)粒的復(fù)制所需要的序列；IacZ所標(biāo)記的基因編碼大腸桿菌的lacZ’基因所編碼的a_肽鏈。上述基因片段定向插入質(zhì)粒、感受態(tài)大腸桿菌的制備、轉(zhuǎn)化以及重組質(zhì)粒的提取和驗(yàn)證分別按照J(rèn).薩姆布魯克、D. W.拉塞爾編著，2002年科學(xué)出版社出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，第1章第68 71頁和第96 99頁及第8章第663 666頁中所述的方法進(jìn)行。其中質(zhì)粒PBBR1MCS-5質(zhì)粒由上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。限制性內(nèi)切酶和連接酶，均購自深圳中晶生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌中重組質(zhì)粒的提取，采用 B型少量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?，由北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司提供，產(chǎn)品目錄號MK014-2。重組質(zhì)粒的驗(yàn)證所使用的限制性酶、DNA聚合酶LA Taq和基因擴(kuò)增試劑盒， 均購自TAKARA公司上海代理公司，產(chǎn)品目錄號DRR002AG。瓊脂糖購自GENE TECH公司上海代理公司。3、構(gòu)建基因工程菌株M18G/pBBRphzH制備促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受態(tài)細(xì)胞，并將上述重組質(zhì)粒pBBRphzH 轉(zhuǎn)化到M18G的感受態(tài)細(xì)胞中，在條件下，培養(yǎng)2天，從中篩選出基因工程菌株M18G/ pBBRphzH。促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受態(tài)細(xì)胞的制備方法、重組質(zhì)粒pBBRphzH轉(zhuǎn)化到M18G的感受態(tài)細(xì)胞以及高效生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株M18G/pBBRphzH 的篩選方法，均按照J(rèn).薩姆布魯克、D. W.拉塞爾編著，2002年科學(xué)出版社出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，第1章第96 99頁中所述的方法進(jìn)行。4、基因工程菌株M18G/pBBRphzH的培養(yǎng)將基因工程菌株M18G/pBBRphzH接種在甘油培養(yǎng)基平板上，在下活化生長M 小時(shí)，然后再次在甘油培養(yǎng)基的平板上劃菌塊，26°C下活化10小時(shí)，然后，將活化的M18G/ pBBRphzH菌塊轉(zhuǎn)接到含有25毫升甘油培養(yǎng)液、體積為250毫升的三角瓶中，在的搖床中振蕩培養(yǎng)9小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分；最后轉(zhuǎn)接到含有65毫升的產(chǎn)素培養(yǎng)液、體積為 500毫升的特殊三角瓶中，進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間為60小時(shí)，在發(fā)酵液中，獲得的吩嗪-1-羧酸酰胺含量為每升2500毫克，檢測不出吩嗪-1-羧酸的含量，表明全部吩嗪-ι-羧酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化為吩嗪-ι-羧酸酰胺，檢測結(jié)果表明吩嗪-ι-羧酸轉(zhuǎn)化為吩嗪-1-羧酸酰胺的轉(zhuǎn)化率為100%。其中，所述甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨1.8%、甘油1.3%、硫酸鎂0.07%、磷酸二氫鉀0.03%、余量為水，pH7.0。所述甘油培養(yǎng)基(固體)中還含有瓊脂1. 5%。所述的產(chǎn)素培養(yǎng)液的組分重量百分比為蛋白胨2. 2%、葡萄糖2. 0%、硝酸鉀 0. 5%、余量為水，ρΗ6· 8。在此配方下，65毫升的M18G/pBBRphzH發(fā)酵液中獲得吩嗪羧酸酰胺產(chǎn)量為 162. 5毫克，吩嗪-1-羧酸的含量為零，按一定比例稀釋，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸酰胺的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PH7. 0)，同時(shí)按一定比例稀釋M18G/pME6032Phz發(fā)酵液 (ZL200910198664. 2記載)，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PH7.0)，以不加發(fā)酵液的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(pH7.0)為對照，分別測定水稻紋枯病菌在各種馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PH7.0)中的生長速率，并按照實(shí)施例6的計(jì)算方法，計(jì)算吩嗪-1-羧酸酰胺和吩嗪-1-羧酸的抑菌活性，按照在相同PH7. 0條件下的生物活性計(jì)算，每升M18G/pBBRphzH發(fā)酵液獲得吩嗪羧酸酰胺產(chǎn)量相當(dāng)于吩嗪羧酸12500毫克的抑菌效果，抑菌活性提高了約1.9倍。實(shí)施例21、采用與實(shí)施例1相同的方法擴(kuò)增PhzH基因的完整編碼區(qū)及其5’端的非編碼區(qū)，產(chǎn)物通過1. 0%瓊脂糖電泳檢測，回收獲得長度約為2. 5kb的PhzH基因及其5’端的非編碼區(qū)片段。2、將回收的phzH基因及其5’端的非編碼區(qū)片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bio I>Hind III酶切，連接酶連接，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒PBBR1MCS-5，并將phzH 基因及其5’端的非編碼區(qū)片段的表達(dá)置于噬菌體啟動子T3pr0m控制下，形成重組質(zhì)粒 pBBRphzH并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌。在慶大霉素抗性平板上，篩出經(jīng)pBBRphzH轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子；最后，從大腸桿菌轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒并驗(yàn)證。3、制備促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受態(tài)細(xì)胞，并將上述重組質(zhì)粒pBBRphzH 轉(zhuǎn)化到M18G的感受態(tài)細(xì)胞中，在30°C條件下，培養(yǎng)1天。促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受態(tài)細(xì)胞的制備方法、重組質(zhì)粒pBBRphzH轉(zhuǎn)化到M18G的感受態(tài)細(xì)胞以及高效生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株M18G/pBBRphzH 的篩選方法，均同實(shí)施例1。
1
4、將基因工程菌株M18G/pBBRphzH接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在下活化生長22小時(shí)，然后再次在甘油培養(yǎng)基的平板上劃菌塊二8°C下活化11小時(shí)，然后將活化的 M18G/pBBRphzH菌塊轉(zhuǎn)接到含有25毫升甘油培養(yǎng)液、體積為250毫升的三角瓶中，在的搖床中振蕩培養(yǎng)10小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為170轉(zhuǎn)/分；最后轉(zhuǎn)接到含有65毫升的產(chǎn)素培養(yǎng)液、體積為500毫升的三角瓶中，進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間為66小時(shí)， 在發(fā)酵液中，得到吩嗪-1-羧酸酰胺含量為每升2700毫克，檢測不出吩嗪-1-羧酸的含量， 表明全部吩嗪-ι-羧酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化為吩嗪-ι-羧酸酰胺，檢測結(jié)果表明吩嗪-ι-羧酸轉(zhuǎn)化為吩嗪-1-羧酸酰胺的轉(zhuǎn)化率為100%。其中，所述甘油培養(yǎng)基中含有的組分重量百分比為蛋白胨2.2%、甘油1.7%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.01%、余量為水，pH 7.2。所述甘油培養(yǎng)基(固體)中還含有瓊脂1. 5%。所述產(chǎn)素培養(yǎng)液的組分重量百分比為蛋白胨2. 2%、葡萄糖2. 5%、硝酸鉀 0. 5%、余量為水，ρΗ7· 2。在此配方下，65毫升的M18G/pBBRphzH發(fā)酵液中獲得吩嗪羧酸酰胺產(chǎn)量為 175. 5毫克，吩嗪-1-羧酸的含量為零，按一定比例稀釋，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸酰胺的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PH7. 0)，同時(shí)按一定比例稀釋M18G/pME6032Phz發(fā)酵液 (ZL200910198664. 2記載)，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PH7.0)，以不加發(fā)酵液的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(pH7.0)為對照，分別測定水稻紋枯病菌的在各種馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PH7.0)中的生長速率，并按照實(shí)施例6的計(jì)算方法，計(jì)算吩嗪-1-羧酸酰胺和吩嗪-1-羧酸的抑菌活性，按照在相同PH7. 0條件下的抑菌活性計(jì)算，每升M18G/pBBRphzH發(fā)酵液獲得吩嗪羧酸酰胺的產(chǎn)量相當(dāng)于吩嗪羧酸13500毫克的抑菌效果，抑菌活性提高了約2. 1倍。實(shí)施例31、采用與實(shí)施例1相同的方法擴(kuò)增phzH基因的完整編碼區(qū)及其5’端的非編碼區(qū)，產(chǎn)物通過1. 0%瓊脂糖電泳檢測，回收獲得長度約為2. 5kb的基因PhzH及其5’端的非編碼區(qū)片段。2、將回收的phzH基因及其5，端的非編碼區(qū)片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bio I>Hind III酶切，在連接酶的作用下，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS-5中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，置于噬菌體啟動子T3pr0m控制下，形成重組質(zhì)粒pBBRphzH并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌。在慶大霉素抗性平板上，篩出經(jīng)PBBRphzH轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子；最后，從大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒并驗(yàn)證。3、制備促生拈抗菌M18的衍生菌株M18G的感受態(tài)細(xì)胞，并將上述重組質(zhì)粒 PBBRphzH轉(zhuǎn)化到M18G的感受態(tài)細(xì)胞中，在32°C條件下，培養(yǎng)2天，從中篩選出高效生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株M18G/pBBRphzH。促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受態(tài)細(xì)胞的制備方法、重組質(zhì)粒pBBRphzH轉(zhuǎn)化到M18G的感受態(tài)細(xì)胞以及高效生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株M18G/pBBRphzH 的篩選方法，均同實(shí)施例1。4、將利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的工程菌株M18G/pBBRphzH，接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在30°C下活化生長20小時(shí)，然后再次在甘油培養(yǎng)基的平板上劃菌塊，30°C下活化12 小時(shí)，然后將活化的M18G/pBBRphzH菌株轉(zhuǎn)接到含有25毫升甘油培養(yǎng)液、體積為250毫升的三角瓶中放大，在30°C的搖床中振蕩培養(yǎng)11小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分；最后轉(zhuǎn)接到含有65毫升的產(chǎn)素培養(yǎng)液、體積為500毫升的三角瓶中，進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間為72小時(shí)，在發(fā)酵液中，得到吩嗪-1-羧酸酰胺產(chǎn)量為每升觀00毫克，檢測不出吩嗪-ι-羧酸的含量，表明全部吩嗪-ι-羧酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化為吩嗪-ι-羧酸酰胺，檢測結(jié)果表明吩嗪-ι-羧酸轉(zhuǎn)化為吩嗪-ι-羧酸酰胺的轉(zhuǎn)化率為100%。其中，所述甘油培養(yǎng)基中含有的組分重量百分比為蛋白胨2.0%、甘油1.5%、硫酸鎂0. 1%、磷酸二氫鉀0.05%、余量為水，PH6.8;所述甘油培養(yǎng)基(固體)中還含有瓊脂1. 5%。所述的產(chǎn)素培養(yǎng)液的組分重量百分比為蛋白胨3. 0%、葡萄糖2. 5%、硝酸鉀 0. 8%、余量為水，pH7. 0。在此配方下，65毫升的M18G/pBBRphzH發(fā)酵液中獲得吩嗪羧酸酰胺產(chǎn)量為 182毫克，吩嗪-1-羧酸的含量為零，按一定比例稀釋，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸酰胺的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PH7. 0)，同時(shí)按一定比例稀釋M18G/pME6032Phz發(fā)酵液 (ZL200910198664. 2記載)，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PH7.0)，以不加發(fā)酵液的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(pH7.0)為對照，分別測定水稻紋枯病菌的生長速率，并按照實(shí)施例6的計(jì)算方法，計(jì)算吩嗪-1-羧酸酰胺和吩嗪-1-羧酸的抑菌活性，按照在相同PH7. 0條件下的抑菌活性計(jì)算，每升M18G/pBBRphzH發(fā)酵液獲得吩嗪羧酸酰胺產(chǎn)量相當(dāng)于吩嗪-1-羧酸14000毫克的抑菌效果，抑菌活性提高了約2. 2倍。實(shí)施例41、采用與實(shí)施例1相同的方法擴(kuò)增phzH基因的完整編碼區(qū)及其5’端的非編碼區(qū)，產(chǎn)物通過1. 0%瓊脂糖電泳檢測，回收獲得長度約為2. 5kb的基因PhzH及其5’端的非編碼區(qū)片段。2、將回收的phzH基因及其5’端的非編碼區(qū)片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bio I>Hind III酶切，在連接酶的作用下，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS-5中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，置于噬菌體啟動子T3pr0m控制下，形成重組質(zhì)粒pBBRphzH并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌。在慶大霉素抗性平板上，篩出經(jīng)PBBRphzH轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子；最后，從大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒并驗(yàn)證。3、制備促生拈抗菌M18株的感受態(tài)細(xì)胞，并將上述重組質(zhì)粒pBBRphzH轉(zhuǎn)化到M18 的感受態(tài)細(xì)胞中，在32°C條件下，培養(yǎng)2天，從中篩選出生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株 M18/pBBRphzHo促生拈抗菌M18株的感受態(tài)細(xì)胞的制備方法、重組質(zhì)粒pBBRphzH轉(zhuǎn)化到M18的感受態(tài)細(xì)胞以及生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株M18/pBBRphzH的篩選方法，均按照J(rèn).薩姆布魯克、D. W.拉塞爾編著，2002年科學(xué)出版社出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，第1章第96 99頁中所述的方法進(jìn)行。4、將利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的工程菌株M18/pBBRphzH，接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在30°C下活化生長20小時(shí)，然后再次在甘油培養(yǎng)基的平板上劃菌塊，30°C下活化12小時(shí)，然后將活化的M18/pBBRphzH菌株轉(zhuǎn)接到含有25毫升甘油培養(yǎng)液、體積為250毫升的三角瓶中放大，在30°C的搖床中振蕩培養(yǎng)11小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分；最后轉(zhuǎn)接到含有 65毫升的產(chǎn)素培養(yǎng)液、體積為500毫升的三角瓶中，進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變， 發(fā)酵時(shí)間為72小時(shí)，在發(fā)酵液中，得到吩嗪-1-羧酸酰胺產(chǎn)量為每升300毫克，檢測不出吩15嗪-ι-羧酸的含量。其中，所述甘油培養(yǎng)基及產(chǎn)素培養(yǎng)液的組分同實(shí)施例1。在此配方下的吩嗪-1-羧酸酰胺產(chǎn)量為每升產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺300毫克，吩嗪-1-羧酸的含量為零，全部吩嗪-1-羧酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化為吩嗪-1-羧酸酰胺。檢測結(jié)果表明在M18/pBBRphzH工程菌株中，吩嗪羧酸轉(zhuǎn)化為吩嗪羧酸酰胺的轉(zhuǎn)化率為100%。實(shí)施例51、采用與實(shí)施例1相同的方法擴(kuò)增phzH基因的完整編碼區(qū)及其5’端的非編碼區(qū)，產(chǎn)物通過1. 0%瓊脂糖電泳檢測，回收獲得長度約為2. 5kb的基因PhzH及其5’端的非編碼區(qū)片段。2、將回收的phzH基因及其5’端的非編碼區(qū)片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bio I>Hind III酶切，在連接酶的作用下，插入大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒PBBR1MCS-5中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，將PhzH基因的表達(dá)置于噬菌體啟動子T3prom控制下，形成重組質(zhì)粒pBBRphzH 并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌。在慶大霉素抗性平板上，篩出經(jīng)PBBRphzH轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子； 最后，從大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒并驗(yàn)證。3、制備銅綠假單胞菌PAOl株的感受態(tài)細(xì)胞，并將上述重組質(zhì)粒pBBRphzH轉(zhuǎn)化到 PAOl的感受態(tài)細(xì)胞中，在32°C條件下，培養(yǎng)2天，從中篩選出生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株 PAOl/pBBRphzHο銅綠假單胞菌PAOl株的感受態(tài)細(xì)胞的制備方法、重組質(zhì)粒pBBRphzH轉(zhuǎn)化到PAOl 的感受態(tài)細(xì)胞以及生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株P(guān)AOl/pBBRphzH的篩選方法，均按照J(rèn).薩姆布魯克、D. W.拉塞爾編著，2002年科學(xué)出版社出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，第1章第96 99頁中所述的方法進(jìn)行。4、將利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的工程菌株P(guān)AOl/pBBRphzH，接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在30°C下活化生長20小時(shí)，然后再次在甘油培養(yǎng)基的平板上劃菌塊，30°C下活化12 小時(shí)，然后將活化的PAOl/pBBRphzH菌株轉(zhuǎn)接到含有25毫升甘油培養(yǎng)液、體積為250毫升的三角瓶中放大，在30°C的搖床中振蕩培養(yǎng)11小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分；最后轉(zhuǎn)接到含有65毫升的產(chǎn)素培養(yǎng)液、體積為500毫升的三角瓶中，進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間為72小時(shí)，在發(fā)酵液中，得到吩嗪-1-羧酸酰胺產(chǎn)量為每升50毫克，檢測不出吩嗪-1-羧酸的含量。其中，所述甘油培養(yǎng)基及產(chǎn)素培養(yǎng)液的組分同實(shí)施例1。在此配方下，得到吩嗪-1-羧酸酰胺產(chǎn)量為每升50毫克，檢測不出吩嗪-1-羧酸的含量，全部吩嗪-1-羧酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化為吩嗪-1-羧酸酰胺，檢測結(jié)果表明在工程菌株P(guān)AOl/ pBBRphzH中，吩嗪-1-羧酸轉(zhuǎn)化為吩嗪-1-羧酸酰胺的轉(zhuǎn)化率為100%。實(shí)施例6 吩嗪-1-羧酸酰胺發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性穩(wěn)定性檢測用磷酸鹽-檸檬酸緩沖液將馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的酸度值分別調(diào)節(jié)為4. 0、 5. 0,6. 0,7. 0,8. 0。在不同酸度值的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，分別加入一定量的M18G/ pME6032Phz發(fā)酵液和M18G/pBBRphzH發(fā)酵液，獲得最終含有濃度分別稀釋為16毫克/升的吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-羧酸酰胺的不同酸度值的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，倒入直徑為9cm 的培養(yǎng)皿中成平板，以不加發(fā)酵液的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板為空白對照，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)；在平板中央接入直徑為8mm的水稻紋枯病的病原菌菌絲塊，置于恒溫培養(yǎng)
1箱中培養(yǎng)；待空白對照中的病原菌絲長滿整個(gè)平皿時(shí)，采用十字交叉法分別測定接種在各種馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中的菌塊的直徑。抑菌率即對真菌生長的抑制效率的計(jì)算方法為 抑菌率=(1_ (D2-Din2)/(D。k2_Din2))xl00%。式中D表示處理組的菌絲塊平均直徑；Din表示菌絲塊的初始直徑；D。k表示對照的菌絲塊的平均直徑。分析結(jié)果如圖3所示，其中PCA表示吩嗪-1-羧酸，PCN表示吩嗪-1-羧酸酰胺。結(jié)果表明在酸度值為4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0 的條件下吩嗪-1-羧酸(PCA)對水稻紋枯病菌的抑菌活性分別為95. 5%,82. 9%,67. 5%, 15.9%,0 ；吩嗪-1-羧酸酰胺(PCN)的抑菌活性分別為65%、69%、73.6%、80. 1%,90%ο 即在PH值在4到8的條件下吩嗪-1-羧酸酰胺對水稻紋枯病菌的抑菌活性與吩嗪-1-羧酸相比，具有穩(wěn)定性；同時(shí)，酸度值為7. 0的條件下吩嗪-1-羧酸酰胺對水稻紋枯病菌的抑菌活性是吩嗪-1-羧酸抑菌活性的5倍。 其中，所述馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中含有的組分重量百分比為馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂1.5%、余量為水。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)微生物源殺菌劑的生物工程菌株，為將PhzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株后獲得，所述生物工程菌株產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺
2.如權(quán)利要求1所述的生物工程菌株，其特征在于，所述PhzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒能在產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株中表達(dá)PhzH基因，編碼產(chǎn)生PhzH(谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺轉(zhuǎn)移酶)。
3.如權(quán)利要求2所述的生物工程菌株，其特征在于，所述WizH的氨基酸序列為SEQID NO :1。
4.如權(quán)利要求2所述的生物工程菌株，其特征在于，所述phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒為克隆有phzH基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒。
5.如權(quán)利要求4所述的生物工程菌株，其特征在于，所述的phzH基因片段包含phzH基因的完整編碼區(qū)及其5’端的非編碼區(qū)。
6.如權(quán)利要求5所述的生物工程菌株，其特征在于，所述WizH為假單胞菌的PhzH，且所述phzH基因片段為假單胞菌的phzH基因片段。
7.如權(quán)利要求6所述的生物工程菌株，其特征在于，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌或綠針假單胞菌。
8.如權(quán)利要求7所述的生物工程菌株，其特征在于，所述假單胞菌選自銅綠假單胞菌株 PA01、LESB58、PA14、PUPa3 或綠針假單胞菌株 PCL1391。
9.如權(quán)利要求4所述的生物工程菌株，其特征在于，所述phzH基因片段的堿基序列為 SEQID NO :2。
10.如權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求所述的生物工程菌株，其特征在于，用于構(gòu)建所述 PhzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)載體為大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒。
11.如權(quán)利要求10所述的生物工程菌株，其特征在于，所述大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒含有強(qiáng)啟動子，且所述PhzH基因片段克隆于所述強(qiáng)啟動子之后，由該強(qiáng)啟動子控制其表達(dá)。
12.如權(quán)利要求11所述的生物工程菌株，其特征在于，所述大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒為pBBRlMCS系列質(zhì)粒及其衍生的表達(dá)質(zhì)粒。
13.如權(quán)利要求12所述的生物工程菌株，其特征在于，所述大腸桿菌/假單胞菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒為PBBR1MCS-5，所述phzH基因在保證讀碼框正確的前提下，置于pBBRlMCS-5的噬菌體啟動子T3prom控制下。
14.如權(quán)利要求1-13任一權(quán)利要求所述的生物工程菌株，其特征在于，所述產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株為促生拈抗菌M18或其衍生的工程菌株M18G。
15.如權(quán)利要求1-14任一權(quán)利要求所述的生物工程菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)微生物源殺菌劑的用途。
16.一種微生物源殺菌劑，為權(quán)利要求1-14任一權(quán)利要求所述生物工程菌株的發(fā)酵液。
17.如權(quán)利要求16所述微生物源殺菌劑，其特征在于，所述發(fā)酵液的主要?dú)⒕钚猿煞趾脏?1-羧酸酰胺。
18.如權(quán)利要求17所述微生物源殺菌劑，其特征在于，所述發(fā)酵液中，吩嗪-1-羧酸酰胺的含量為每升2500 觀00毫克。
19.如權(quán)利要求16所述微生物源殺菌劑，其特征在于，所述微生物源殺菌劑為在合適表達(dá)吩嗪-1-羧酸及WizH的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1-13任一權(quán)利要求所述的生物工程菌株后獲得。
20.如權(quán)利要求19所述微生物源殺菌劑，其特征在于，所述微生物源殺菌劑采用包括下列步驟的方法獲得1)生物工程菌株的活化；2)種子擴(kuò)大培養(yǎng)先在甘油培養(yǎng)液中搖瓶培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接入產(chǎn)素培養(yǎng)液中放大發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液。
21.如權(quán)利要求20所述微生物源殺菌劑，其特征在于，所述工程菌株活化采用固體甘油培養(yǎng)基活化培養(yǎng)。
22.如權(quán)利要求21所述微生物源殺菌劑，其特征在于，所述的甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨1.8 2.2%、甘油1. 3 1.7%、硫酸鎂0. 05 0. 1%、磷酸二氫鉀0. 01 0. 05%、余量為水，pH 6. 8 7. 2 ；所述的固體甘油培養(yǎng)基中含有的組分重量百分比為蛋白胨1.8 2.2%、甘油1. 3 1. 7%、硫酸鎂0. 05 0. 1 %、磷酸二氫鉀0. 01 0. 05%、瓊脂1. 2-1. 5%、余量為水，pH 6. 8 7. 2 ；所述的產(chǎn)素培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨2. 2 3. 0%、葡萄糖2. 0 2. 5%、硝酸鉀0. 5 0. 7%、余量為水，pH6. 5 7. 0。
23.如權(quán)利要求22所述微生物源殺菌劑，其特征在于，所述工程菌株的活化條件為在將工程菌接入甘油培養(yǎng)基平板，在沈 30°C下，活化生長20 M小時(shí)；而后再次在甘油培養(yǎng)基的平板上劃菌塊，26 30°C下活化10 12小時(shí)；所述種子擴(kuò)大培養(yǎng)中，在甘油培養(yǎng)液中搖瓶培養(yǎng)條件為將活化后的菌株接入甘油培養(yǎng)液、26 30°C振蕩培養(yǎng)9 11小時(shí)； 所述種子擴(kuò)大培養(yǎng)中，接入產(chǎn)素培養(yǎng)液中放大發(fā)酵培養(yǎng)的條件為將甘油培養(yǎng)液中搖瓶培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接入產(chǎn)素培養(yǎng)液、26 30°C發(fā)酵培養(yǎng)60 72小時(shí)。
24.如權(quán)利要求16-23任一權(quán)利要求所述微生物源殺菌劑用于防治植物病害或用于制備防治植物病害的藥劑的用途。
25.一種防治植物病害的藥劑，含有殺菌有效量的權(quán)利要求16-23任一權(quán)利要求所述微生物源殺菌劑或來源于所述微生物源殺菌劑的殺菌活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)新型微生物源殺菌劑的生物工程菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明的用于生產(chǎn)微生物源殺菌劑的生物工程菌株，為將phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株后獲得，所述生物工程菌株產(chǎn)吩嗪-1-羧酸酰胺。本發(fā)明利用現(xiàn)有的生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的菌株攜帶phzH基因重組表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)phzH基因的高效表達(dá),并將吩嗪-1-羧酸轉(zhuǎn)化為吩嗪-1-羧酸酰胺。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了所述生物工程菌株的用途，包括由所述生物工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)的微生物源殺菌劑及該微生物源殺菌劑的制備與應(yīng)用。吩嗪-1-羧酸酰胺的抗菌活性不受其使用條件的酸度值影響，從而穩(wěn)定其抗菌活性，能更加有效地防治作物病害。
文檔編號C12N15/54GK102399737SQ201110347790
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者何亞文, 周萬平, 申慧峰, 許煜泉 申請人:上海交通大學(xué)