專利名稱：利用深黃被孢霉固態(tài)發(fā)酵玉米淀粉和麩皮生產(chǎn)飼用油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用深黃被孢霉固態(tài)發(fā)酵玉米淀粉和麩皮生產(chǎn)飼用油脂的方法， 屬于畜禽飼料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在畜禽全價配合飼料中，能量飼料可占到60% 85%，油脂是補充飼料能量的有效方法。油脂的來源主要有動物油脂，植物油脂和微生物油脂。近年來，為配制高能量全價飼料和提高配合飼料的適口性，往往在配制飼料時添加適量的動植物油脂。然而，將動植物油脂添加于配合飼料中，不僅提高了飼料成本，且加劇了動植物油脂的短缺。微生物油脂是經(jīng)產(chǎn)油微生物利用環(huán)境中碳水化合物獲得，由于微生物培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，物質(zhì)能量轉(zhuǎn)換效率高，同時，大量未被利用的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物可作為理想碳源，用于發(fā)酵生產(chǎn)油脂。因此，微生物油脂有潛力成為相對成本較低的油脂添加于配合飼料中以調(diào)節(jié)能蛋比平衡，對節(jié)約飼料成本，緩解能量飼料短缺和人畜爭糧狀況具有及其重要的作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，微生物油脂的脂肪酸組成及物理化學性質(zhì)都同植物油脂相類似，即大部分是偶數(shù)碳鏈脂肪酸，但是其消化率較植物油脂低一些。早在一戰(zhàn)時期，德國科學家對微生物產(chǎn)油脂進行了研究，試圖利用油脂酵母和單細胞藻類來生產(chǎn)油脂，以解決糧食不足問題。之后，美國也開始著手微生物油脂的研究，但均未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。直到二戰(zhàn)前夕，德國科學家篩選到了適合于深層培養(yǎng)的菌種，才開始在德國工業(yè)化生產(chǎn)食用油。20世紀40年代，相繼發(fā)現(xiàn)一系列高產(chǎn)油微生物(油脂積累量超過細胞總量20%的微生物)， 如斯達氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、曲霉屬 (Aspergillus)、毛霉屬(Mucor)等。70年代，Wayman曾報道一株節(jié)桿菌AK19，產(chǎn)油脂達 85%，但所含不飽和脂肪酸(PUFAs)含量太低；Cosel in所選育的假絲酵母TM300及韓國的紅酵母NRRLY-1091產(chǎn)油脂皆在40%，并含有6%左右的PUFAs。進入80年代，Brown用里斯木霉生產(chǎn)油脂可達16%，并含有較高的亞油酸成分；Manresa用銅綠色假單孢菌生產(chǎn)油脂達38%，所含亞油酸達50% ;1986年，日本、英國又首先推出含Y -亞麻酸(GLA)微生物油脂的保健食品、功能性飲料和高級化妝品等。20世紀90年代以來，特種油脂的發(fā)展愈來愈受到重視，相繼從絲狀真菌、微藻、細菌和酵母中，篩選到能生產(chǎn)許多特種油脂的菌種， 并對多種脫飽和酶進行研究，構(gòu)建基因工程菌。被孢霉為一種低等真菌，高產(chǎn)油被孢霉利用碳水化合物進行發(fā)酵合成的油脂含量可達到40 50%，尤其富含GLA、ARA和EPA這三種 PUFAs0目前，在利用高產(chǎn)油微生物生產(chǎn)單細胞油脂時，所采用的發(fā)酵方式以深層液態(tài)發(fā)酵為主，少數(shù)采用半固態(tài)發(fā)酵。而深層液態(tài)發(fā)酵雖然能蓄積更多的油脂，但是生產(chǎn)成本較高， 半固態(tài)發(fā)酵雖能降低生產(chǎn)成本，但是菌絲體生長及油脂的產(chǎn)率不及深層液態(tài)發(fā)酵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種利用深黃被孢霉固態(tài)發(fā)酵玉米淀粉和麩皮生產(chǎn)飼用油脂的方法。利用深黃被孢霉固態(tài)發(fā)酵玉米淀粉和麩皮生產(chǎn)飼用油脂的方法，將玉米淀粉和麩皮按照1 3的重量比混合后作為發(fā)酵底物，裝料量60g/250mL，含水量60%，按30%接種發(fā)酵2d的種子液，調(diào)節(jié)初始pH為6. 0，采用雙溫度培養(yǎng)發(fā)酵7d ；所述雙溫度培養(yǎng)發(fā)酵即前2d培養(yǎng)溫度為^°C，后5d培養(yǎng)溫度為^TC ；所述深黃被孢霉種子液培養(yǎng)方法為 種子培養(yǎng)基葡萄糖10g，磷酸二氫鉀0. lg，硫酸鎂0. 03g，酵母膏0. 2g，硫酸銨0. 2g，蒸餾水lOOmL，pH6，112°C滅菌20min ；用滅菌的接種環(huán)勾取2環(huán)斜面孢子于種子液體培養(yǎng)基中， 28 0C、180r/min 搖床培養(yǎng) 48h。本發(fā)明先通過篩選深黃被孢霉(Mortierella isabellina As 3. 3410，一種產(chǎn)油菌株)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)液的適宜C源、N源的含量，發(fā)酵時間等，再對發(fā)酵底物組成及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，使油脂產(chǎn)量高達10. 18g/100g，其中Y-亞油酸(GLA)和DHA分別占總的粗脂肪含量的4. 03%和1. 7%0總能由發(fā)酵前的3779. 77Kcal/Kg提高到了 4885. 39Kcal/ Kg，成本比深層液態(tài)發(fā)酵大大降低。本發(fā)明利用深黃被孢霉研究以農(nóng)作物副產(chǎn)物(玉米淀粉和麥麩)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)微生物飼用油脂，提高了油脂的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1①碳源的篩選采用單因素試驗設(shè)計篩選C源分別以葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖和葡萄糖+木糖 (1 1)替代原發(fā)酵培養(yǎng)基中的C源(葡萄糖)，其余培養(yǎng)基組分不變，28°C、180r/min搖床培養(yǎng)7d，過濾，65°C烘干，測定最終生物量。以不同的六碳糖和五碳糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的唯一碳源進行發(fā)酵，以生物量作為判定最適C源指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，六碳糖較之五碳糖更有利于菌絲體的生長，差異達到極顯著水平(P <0.01)。其中六碳糖中葡萄糖為最適C源，發(fā)酵 7d后生物量達到4. 20g/L，其次為果糖和麥芽糖。②氮源的篩選采用單因素試驗設(shè)計篩選N源分別以酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、磷酸二氫銨和硝酸銨替代原發(fā)酵培養(yǎng)基中的N源，其余培養(yǎng)基組分不變，280C、180r/min搖床培養(yǎng)7d,過濾， 65°C烘干，測定最終生物量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有機碳源中的酵母膏和無機氮源中的磷酸二氫銨利于菌絲體的生長，其中前者又優(yōu)于后者，差異達到極顯著(P <0.01)。以酵母膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基的單一 N源，經(jīng)過7d的發(fā)酵，生物量達到4. 35g/L。③固態(tài)發(fā)酵動態(tài)以玉米淀粉和麩皮的混合物(1 1，重量比，下同)作為發(fā)酵底物，裝料量 20g/250mL，含水量40 %，按20 %接種發(fā)酵2d的種子液，調(diào)節(jié)初始pH為6. 0，采用雙溫度培養(yǎng)發(fā)酵7d(即前2d培養(yǎng)溫度為^°C，后5d培養(yǎng)溫度為^TC )，分別于發(fā)酵第5d、7d、 9d取樣。將所取樣品在65°C下烘干，過40目篩，測定其粗脂肪，總能及可溶性糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，還原糖濃度隨發(fā)酵時間的延長先上升，到達峰值后再下降。經(jīng)過發(fā)酵總能顯著提高， 發(fā)酵 5d、7d、9d 的總能分別為 4056. 50cal/g、4092. 71cal/g、4073. 12cal/g，較發(fā)酵前分別提高了 7. 32%,8.和7. 76%。經(jīng)過發(fā)酵，油脂含量與發(fā)酵前相比有了極顯著的提高(P < 0. 01)。發(fā)酵第5d、7d的油脂含量差異不顯著(P > 0. 05)，分別為4. 57g/100g和 5. 35g/100g。與發(fā)酵第9d的油脂產(chǎn)量相比差異極顯著(P <0.01)，經(jīng)過9d的連續(xù)發(fā)酵，油脂含量可達7. 25g/100g。實施例2深黃被孢霉(Mortierella isabellina As 3.3410)購自中國科學院北京微生物所，種子培養(yǎng)基葡萄糖10g，磷酸二氫鉀0. lg，硫酸鎂0. 03g，酵母膏0. 2g，硫酸銨0. 2g，蒸餾水100mL，pH 6，112°C滅菌20min。用滅菌的接種環(huán)勾取2環(huán)斜面孢子于種子液體培養(yǎng)基中，28°C、180r/min搖床培養(yǎng)48h，待用。采用單因素試驗設(shè)計，分別以玉米淀粉和麩皮(1 1，重量比，下同)，玉米淀粉、復(fù)合蛋白飼料和麩皮(1 1 2)，復(fù)合蛋白飼料和麩皮(1 1)作為發(fā)酵底物，裝料量50g/500mL，含水量50 %，按20 %接種發(fā)酵2d的種子液，調(diào)節(jié)初始pH為6. 0，采用雙溫度培養(yǎng)發(fā)酵7d(即前2d培養(yǎng)溫度為^°C，后5d培養(yǎng)溫度為^TC )，每24h搖動一次三角瓶，連續(xù)發(fā)酵7d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種發(fā)酵底物所獲得的油脂產(chǎn)量分別為15. 士 1.04g/100g， 9. 18士2. 06g/100g和5. 74士0. 80g/100g，差異極顯著(P < 0. 01)。與發(fā)酵前相比，以玉米淀粉和麩皮(1 1)與玉米淀粉、復(fù)合蛋白飼料和麩皮(1 1 幻進行發(fā)酵，極大的提高了油脂產(chǎn)量，油脂產(chǎn)量分別是發(fā)酵前的近7.5倍和3倍，僅以復(fù)合蛋白飼料(CPF)和麩皮的混合物作為發(fā)酵底物，油脂產(chǎn)量提高較少，僅提高了 32.6%。因此，本發(fā)明的發(fā)酵底物選擇玉米淀粉和麩皮。發(fā)酵條件采用正交試驗設(shè)計進行測定，主要考慮最佳底物組成(A)、含水量(B)、 接種量(C)和裝料量⑶四個因素，每個因素取三個水平(見表1)，采用L9 (34)正交表安排試驗，并進行三次完全重復(fù)試驗，結(jié)果以三次試驗結(jié)果的平均值表示。表1發(fā)酵條件正交試驗因素水平
水平因素A玉米淀粉麩皮B含水量(%)C接種量(%)D 裝料量(g/250 mL)11:140102021:350204031:5603060 結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表幻，對產(chǎn)油脂量影響顯著性因素依次是含水量>裝料量>玉米淀粉麩皮>接種量。最佳工藝條件為A2B3C3D3，即發(fā)酵底物中玉米淀粉與麩皮比值1 3，含水量60 %，接種量30 %，裝料量60g/250mL。發(fā)酵條件三次重復(fù)試驗的方差分析結(jié)果見表3。從表3可以發(fā)現(xiàn)，含水量和裝料量對油脂產(chǎn)量有極顯著的影響(P <0.01)，而其余兩個因素(底物中玉米淀粉與麩皮的比例和深黃被孢霉接種量)對油脂產(chǎn)量影響不顯著，與表2綜合評分結(jié)果一致。通過計算，可估計在最適條件下深黃被孢霉固態(tài)發(fā)酵玉米淀粉和麩皮的混合物，油脂產(chǎn)量將在7. 71 10. ^g/100g之間，此時的置信度為99%。從表3中可看出在處理3 (A1B3C3D3)的條件下，油脂產(chǎn)量最高，達到9. 20g/100g，此值亦在最適發(fā)酵條件的估計置信區(qū)間內(nèi)，從考慮生產(chǎn)成本出發(fā)，將以玉米淀粉和麩皮1 3的比例，含水量60%，接種量30%，裝料量60g/250mL的條件(AJ3C3D3)進行驗證試驗。表2不同的發(fā)酵條件對深黃被孢霉產(chǎn)油脂量的影響
權(quán)利要求
1.利用深黃被孢霉固態(tài)發(fā)酵玉米淀粉和麩皮生產(chǎn)飼用油脂的方法，其特征在于，將玉米淀粉和麩皮按照1 3的重量比混合后作為發(fā)酵底物，裝料量60g/250mL，含水量60%， 按30%接種發(fā)酵2d的種子液，調(diào)節(jié)初始pH為6. 0，采用雙溫度培養(yǎng)發(fā)酵7d ；所述雙溫度培養(yǎng)發(fā)酵即前2d培養(yǎng)溫度為^°C，后5d培養(yǎng)溫度為^TC;所述深黃被孢霉種子液培養(yǎng)方法為種子培養(yǎng)基葡萄糖10g，磷酸二氫鉀0. lg，硫酸鎂0. 03g，酵母膏0. 2g，硫酸銨0. 2g，蒸餾水lOOmL，pH 6，112°C滅菌20min ；用滅菌的接種環(huán)勾取2環(huán)斜面孢子于種子液體培養(yǎng)基中，28°C、180r/min 搖床培養(yǎng) 48h。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用深黃被孢霉固態(tài)發(fā)酵玉米淀粉和麩皮生產(chǎn)飼用油脂的方法，將玉米淀粉和麩皮按照1∶3的重量比混合后作為發(fā)酵底物，裝料量60g/250mL，含水量60％，按30％接種發(fā)酵2d的種子液，調(diào)節(jié)初始pH為6.0，采用雙溫度培養(yǎng)發(fā)酵7d；所述雙溫度培養(yǎng)發(fā)酵即前2d培養(yǎng)溫度為28℃，后5d培養(yǎng)溫度為26℃。使油脂產(chǎn)量高達10.18g/100g，其中γ-亞油酸(GLA)和DHA分別占總的粗脂肪含量的4.03％和1.7％?？偰苡砂l(fā)酵前的3779.77kcal/kg提高到了4885.39kcal/kg，成本比深層液態(tài)發(fā)酵大大降低。
文檔編號C12R1/645GK102399832SQ20111034890
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者丁雪梅, 何軍, 余冰, 吳德, 張克英, 方正峰, 曾秋鳳, 毛倩, 毛湘冰, 田剛, 鄭萍, 陳代文, 黃志清 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學