專利名稱：重組痘苗病毒天壇株及使用其檢測痘苗病毒中和抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及痘苗病毒中和抗體檢測。
背景技術(shù)：
痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒屬中最為人們所熟悉的成員，也是目前已知結(jié)構(gòu)上最為復(fù)雜的一種病毒。痘苗病毒天壇株(Vaccinia Tian Tan, VTT)曾作為天花病毒病的疫苗株在我國大量人群中長期使用，具有相對毒力較弱、使用安全和生物學(xué)性狀清楚等特點，是研制基因工程重組痘苗病毒活疫苗及真核表達(dá)載體的理想毒株(McCurdy LH, Rutigliano JA, Johnson TR, Chen M，Graham BS. Modified vaccinia virus Ankara immunization protects against lethal challenge with recombinant vaccinia virus expressing murine interleukin-4. Journal of virology 2004Nov ；78(22) :12471-9 ； Dai K，Liu Y，Liu Μ,Xu J，Huang W,Huang X，et al. Pathogenicity and immunogenicity of recombinant Tiantan Vaccinia Virus with deleted C12L and A53R genes. Vaccine 2008S印 15 ；26 (39) :5062-71 ；以及 Gomella LG，Mastrangelo MJ，McCue PA，Maguire HJ，Mulholland SG，Lattime EC. Phase i study of intravesical vaccinia virus as a vector for gene therapy of bladder cancer. The Journal of urology 20010ct ； 166(4) :1291-5)。20世紀(jì)中葉，世界衛(wèi)生組織(WHO)在全球幵展了滅絕天花的運動。在這場運動中， 世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的痘苗病毒疫苗有4株EM63株，李斯特(Lister)株，NYCBH株和天壇株，其中天壇株在中國人群中大量接種，其在中國天花消滅過程中發(fā)揮了重要作用。雖然自1980年WHO宣布全球消滅天花后，痘苗病毒天壇株疫苗停止接種使用(Miattacharya S.Uncertain advances :a review of the final phases of the smallpox eradication program in India,1960-1980. American journal of public health 2004Nov ；94 (11) 1875-8 ，但我國人群中仍存在針對痘苗病毒的中和抗體。這些中和抗體水平將直接影響各類痘苗病毒載體疫苗的應(yīng)用效果。因此，在目前痘苗病毒被廣泛作為載體研究疫苗的現(xiàn)狀下，確切了解我國各年齡段人群針對天花病毒的免疫狀態(tài)顯得非常重要。因此，迫切需要建立一種高通量、靈敏度高可定量的針對痘苗病毒的中和抗體檢測方法。目前，檢測痘苗病毒中和抗體的方法基本有以下三類1.噬斑抑制法這是一種最為傳統(tǒng)的中和抗體檢測方法，被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”(董小曼，陳秀珍，董翊.天花疫苗天壇株病毒中和試驗方法的建立和驗證.中國醫(yī)藥生物技術(shù)2007;2(6) :464-6)。其理論依據(jù)為，痘苗病毒形成的單個噬斑被認(rèn)為代表一個感染性病毒單位，因此，噬斑數(shù)量的減少直接和中和抗體水平相關(guān)聯(lián)(Katz JB. The effect of the virus-serum incubation period upon vaccinia virus serum neutralization titers. Journal of biological standardization 19870ct ； 15 (4) :389-92)。該方法的主要缺點是檢測周期長天)；檢測通量低；結(jié)果分析主觀性強(qiáng)；需要在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分析，因此樣品量較大。2008年，Maria教授采用96孔板分析中和抗體滴度降低了樣品需求量，但仍需放大12. 5倍后人工判讀數(shù)據(jù)(Borges MB, Kato SE, Damaso CR, Moussatche N, da Silva Freire Μ, Lambert Passos SR, et al. Accuracy and repeatability of a micro plaque reduction neutralization test for vaccinia antibodies. Biologicals 2008Mar ；36 (2) :105-10)。而且，本方法很難標(biāo)準(zhǔn)化，不便于實驗室間的推廣。2. mRNA轉(zhuǎn)錄抑制法為了克服各種痘苗病毒毒株間基因差異和檢測周期較長的問題，2011年，德國Marit Kramshi教授利用實時熒光定量RT-PCR方法，通過檢測痘苗病毒李斯特株mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制水平評價中和抗體滴度。這種方法雖然可以將檢測周期縮短至12小時并有效克服各種毒株之間基因差異的問題(Kramski M,Drozd A,Lichtfuss GF, Dabrowski Pff, Ellerbrok H. Rapid detection of anti-Vaccinia virus neutralizing antibodies. Virology journal ；8 :139)，但最大的缺點是大大增加了檢測的成本并對檢測人員和實驗環(huán)境的要求明顯提高，并且不適合進(jìn)行高通量分析。3.報告基因表達(dá)抑制法2003年，美國國立衛(wèi)生研究院Jody M教授利用包含β -半乳糖苷酶(β-Gal) 基因的重組痘苗病毒W(wǎng)R株建立了一種中和抗體檢測方法，通過半乳糖苷酶催化底物發(fā)光值的下降程度，反映樣品中痘苗病毒中和抗體水平的高低。本方法雖然具有靈敏度高、檢測時間短以及可高通量的優(yōu)點，但是操作步驟繁瑣的缺點非常明顯。半乳糖苷酶催化底物發(fā)光反應(yīng)的線性范圍較窄，因此需要對培養(yǎng)上清進(jìn)行系列稀釋使發(fā)光值處于線性標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)(Manischewitz J, King LR, Bleckwenn ΝΑ, Shiloach J, Taffs R, Merchlinsky Μ,et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of infectious diseases 2003Aug 1 ； 188(3) :440-8)。2004年，德國環(huán)境與健康研究中心的Antonio C教授利用表達(dá)綠色熒光蛋白 (GFP)的重組痘苗病毒安卡拉株(MVA-gfp)，建立了一種快速、靈敏且高通量的中和抗體檢測方法。但是，本方法主要的缺點在于利用流式細(xì)胞儀檢測MVA-gfp細(xì)胞感染抑制
(Cosma A, Buhler S, Nagaraj R, Staib C, Hammarin AL, Wahren B, et al. Neutralization assay using a modified vaccinia virus Ankara vector expressing the green fluorescent protein is a high—throughput method to monitor the humoral immune response against vaccinia virus. Clinical and diagnostic laboratory immunology 2004Mar ； 11 (2) :406_10)。為了適應(yīng)群體痘苗病毒中和抗體滴度普查的要求，仍需要建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測成本低、檢測周期短和/或適合高通量檢測的新型方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種包含螢火蟲熒光素酶(Iuciferase)基因的重組痘苗病毒天壇株。本發(fā)明提供了一種檢測樣品中痘苗病毒中和抗體水平的方法，所述方法包括將本發(fā)明的包含螢火蟲熒光素酶基因的重組痘苗病毒天壇株與待測樣品共同孵
4育；接種痘苗病毒嗜性細(xì)胞；以及進(jìn)行發(fā)光測定。本發(fā)明還提供了將本發(fā)明的重組痘苗病毒天壇株用于體外檢測樣品中痘苗病毒中和抗體水平的用途。本發(fā)明還提供一種痘苗病毒中和抗體檢測試劑盒，其包括本發(fā)明的包含螢火蟲熒光素酶基因的重組痘苗病毒天壇株，任選地還包括指示用所述包含螢火蟲熒光素酶基因的重組痘苗病毒天壇株檢測待測樣品中的痘苗病毒中和抗體的說明書。本發(fā)明的抗體檢測方法是基于編碼熒光素酶的報告基因表達(dá)抑制的特點。本發(fā)明的抗體檢測方法具有如下一種或多種優(yōu)點檢測周期短；靈敏度高；可重復(fù)性高；結(jié)果判讀客觀；高通量；樣品需求量少；檢測成本低；方法可標(biāo)準(zhǔn)化，便于實驗室間推廣。


圖1示出了本發(fā)明的痘苗病毒中和抗體檢測方法的原理示意圖(圖IA至圖1C)。圖2顯示了 pSCluc構(gòu)建質(zhì)粒圖。圖3左圖顯示了 lOpfu/lOOOO細(xì)胞rTV-Fluc病毒感染包括Vero細(xì)胞在內(nèi)的三種不同細(xì)胞后發(fā)光值隨時間的變化，圖3右圖顯示了 lOOOpfu/lOOOO細(xì)胞rTV-Fluc病毒感染包括Vero細(xì)胞在內(nèi)的三種不同細(xì)胞后發(fā)光值隨時間的變化。圖4顯示了在測定發(fā)光值前不沖洗或沖洗Vero細(xì)胞對發(fā)光值的影響。圖5顯示了 Vero細(xì)胞接種量分別為10000細(xì)胞/孔和30000細(xì)胞/孔時的發(fā)光值。圖6顯示了不同的rTV-Fluc病毒感染劑量下的發(fā)光值。圖7顯示了三種rTV-Fluc病毒感染劑量標(biāo)定的陽性對照HCS中和滴度。圖8顯示了用一種本發(fā)明的抗體測定方法和噬斑抑制法對人和鼠血清痘苗病毒天壇株中和抗體滴度檢測的結(jié)果。圖9顯示了本發(fā)明的檢測方法和噬斑抑制法的相關(guān)性分析結(jié)果。圖10顯示了用一種本發(fā)明的方法檢測的小樣本人群不同年齡段的人痘苗病毒天壇株中和抗體水平。圖11顯示了使用rTV-Fluc針對VTT接種的兔(■)和無關(guān)對照兔(□)的血清在不同稀釋度下測得的中和抗體水平，X軸表示血清的系列稀釋度，范圍為從1 30至 1 21870。圖12顯示了使用rTV-Fluc針對rTV_HIVgpl45疫苗接種的小鼠血清(■，▲)和首次接受實驗的小鼠血清(□，Δ)的中和抗體檢測結(jié)果。χ軸表示血清的系列稀釋度，范圍為從1 30至1 21870。圖13顯示了使用rTV-Fluc針對ECT接種的鼠(▲)和無關(guān)對照鼠(Δ )的血清在不同的稀釋度下測得中和抗體水平，χ軸表示血清的系列稀釋度，范圍為從1 30至 1 21870。圖14顯示使用rTV-Fluc針對兩個rMVA-HIVgpe接種的人(■，▲)和兩個首次接受實驗的人(□，Δ)的血清不同的稀釋度下測得的中和抗體水平，χ軸表示血清的系列稀釋度，范圍為從1 30至1 21870。圖15顯示了 T載體連接產(chǎn)物的酶切鑒定圖譜。
具體實施例方式如上所述，本發(fā)明構(gòu)建了一種包含螢火蟲熒光素酶基因的重組痘苗病毒天壇株。 用于構(gòu)建本發(fā)明重組病毒的痘苗病毒天壇株為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如在如金奇等人，痘苗病毒天壇株基因組251Λ核苷酸序列分析及與非疫苗株WR的比較.病毒學(xué)報1988， 4 :288-304中，以及金奇等人，痘苗病毒天壇株全基因組結(jié)構(gòu)特點的分析，中國科學(xué)(C 輯)1997年12月，第27卷第6期562-567中有詳細(xì)描述。用于本發(fā)明的痘苗病毒天壇株以及由其構(gòu)建的本發(fā)明的重組病毒可以是復(fù)制型的，也可以是非復(fù)制型的。在本發(fā)明的實施方案中，所述螢火蟲熒光素酶基因可以是非分泌型也可以是分泌型。優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用非分泌型螢火蟲熒光素酶基因。所述螢火蟲熒光素酶基因為本領(lǐng)域已知。如上所述，本發(fā)明提供了一種通過使用本發(fā)明的包含螢火蟲熒光素酶基因的重組痘苗病毒天壇株，來檢測樣品中的痘苗病毒中和抗體水平的方法。本發(fā)明的方法包括將本發(fā)明的重組病毒與待測樣品共同孵育，接種痘苗病毒嗜性細(xì)胞，以及進(jìn)行發(fā)光測定。根據(jù)本領(lǐng)域已有的知識，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何進(jìn)行針對螢火蟲熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光測定。例如，所述發(fā)光測定步驟通常包括向所述待測樣品中加入一種螢火蟲熒光素酶底物試劑，如熒光素(Iuciferin)。本發(fā)明的方法可用于檢測針對多種痘苗病毒毒株的中和抗體，例如針對痘苗病毒天壇株(VTT)、鼠痘病毒(ECT)或痘苗病毒安卡拉株(MVA)等的中和抗體。本發(fā)明的方法可用于檢測多個物種來源的樣品中的中和抗體水平，例如用于檢測來自小鼠、兔或人的血清樣品中的中和抗體水平。 在本發(fā)明的一個實施方案中，對兔血清檢測針對痘苗病毒天壇株的中和抗體。在本發(fā)明的另一個實施方案中，對鼠血清檢測針對痘苗病毒天壇株的中和抗體。在本發(fā)明的再一個實施方案中，對鼠血清檢測針對鼠痘病毒的中和抗體。在本發(fā)明的又一個實施方案中，對人血清檢測針對痘苗病毒天壇株的中和抗體。在本發(fā)明的另一個實施方案中，對人血清檢測針對痘苗病毒安卡拉株的中和抗體。在本發(fā)明方法的實施方案中，所述樣品可為可能含有痘苗病毒中和抗體的任何樣品。例如，待測樣品可為取自受試者的血液、尿液、唾液等。待測樣品通常為受試者的血清。本發(fā)明的方法中所述的痘苗病毒嗜性細(xì)胞是指能夠被痘苗病毒感染的細(xì)胞。本發(fā)明的重組痘苗病毒具有廣譜細(xì)胞嗜性，因此，多種細(xì)胞——例如，原代雞胚細(xì)胞(CEF)、人胸腺激酶缺陷性細(xì)胞系(143TK)、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞系)等——均可作為痘苗病毒嗜性細(xì)胞用于本發(fā)明方法中。優(yōu)選地，本發(fā)明方法使用Vero細(xì)胞作為痘苗病毒嗜性細(xì)胞。本發(fā)明的方法的實施方案中，所述發(fā)光測定可以包括細(xì)胞裂解步驟或者不包括細(xì)胞裂解步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，當(dāng)本發(fā)明方法的實施方案中使用分泌型螢火蟲熒光素酶基因時，所述發(fā)光測定步驟中不需要進(jìn)行細(xì)胞裂解；當(dāng)本發(fā)明方法的實施方案中使用非分泌型螢火蟲熒光素酶基因時，所述發(fā)光測定步驟還包括將所述痘苗病毒嗜性細(xì)胞裂解。在本發(fā)明的方法中，所述發(fā)光測定優(yōu)選在接種細(xì)胞后20-40小時期間進(jìn)行，更優(yōu)選地，在細(xì)胞接種后20- 小時期間進(jìn)行，再更優(yōu)選地，在細(xì)胞接種后M小時時進(jìn)行。在本發(fā)明的方法中，所述嗜性細(xì)胞的接種量可以是使測定的發(fā)光值結(jié)果的變異系數(shù)盡量小的接種量，例如使得變異系數(shù)小于15 %，優(yōu)選小于10 %，更優(yōu)選小于5 %。由此，所述嗜性細(xì)胞的接種量優(yōu)選為10000-30000細(xì)胞/孔之間，更優(yōu)選地，接種量為30000細(xì)胞/ 孔(以接種孔為96孔板孔計)。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的病毒感染劑量可以是使測定的發(fā)光值結(jié)果的變異系數(shù)盡量小的劑量，例如使得變異系數(shù)小于15 %，優(yōu)選小于10 %，更優(yōu)選小于5 %。由此，在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明病毒的感染劑量為66-1800pfu/30000細(xì)胞， 更優(yōu)選的劑量為100-1000pfu/30000細(xì)胞，再更優(yōu)選的劑量為400pfu/30000細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種痘苗病毒中和抗體檢測試劑盒，其包括本發(fā)明的包含螢火蟲熒光素酶基因的重組痘苗病毒天壇株。本發(fā)明的試劑盒中可進(jìn)一步包含用于螢光素酶發(fā)光反應(yīng)測定的一種或多種其他試劑，優(yōu)選地，所述試劑盒中可進(jìn)一步包含螢火蟲熒光素酶底物試劑，如螢光素。以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明。實施例中使用的化合物或試劑可通過商業(yè)途徑購得，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備得到；所使用的實驗儀器可通過商業(yè)途徑購得。實施例1 包含螢火蟲熒光素酶基因的重組痘苗病毒天壇株的構(gòu)建包含螢火蟲熒光素酶基因痘苗病毒天壇株的構(gòu)建過程如下首先，以PSC59質(zhì)粒為框架構(gòu)建包含螢火蟲熒光素酶基因的重組質(zhì)粒pSCluc ；利用lipofeCt2000脂質(zhì)體技術(shù)轉(zhuǎn)染痘苗病毒天壇株(疫苗株)感染后的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，經(jīng)過X-Gal基因藍(lán)白斑挑選過程獲得重組的復(fù)制型痘苗病毒天壇株rTV-Fluc。1.包含熒光素酶基因的重組痘苗病毒穿梭質(zhì)粒(pSCluc)的構(gòu)建1. 1熒光素酶基因PCR擴(kuò)增用I^rimeSTAR高保真酶(TAKARA，Cat =DROlOA)以包含螢光素酶基因的質(zhì)粒 pLUCF (John Τ. Schiller，美國國家癌癥研究所(National Cancer hstitute)，包含螢光素酶基因的質(zhì)粒也可通過商購如從本元正陽基因技術(shù)有限公司獲得)為模板對Luc基因 (非分泌型螢火蟲熒光素酶基因，GenBank登記號為EU921841)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物L(fēng)VF(MlI酶切位點)GTCGACGCCACCATGGAAGATGCCAAAAAC反向引物L(fēng)VR(SmaI酶切位點)CCCGGGTTACACGGCGATCTTGCCGCCC
權(quán)利要求
1.一種重組痘苗病毒天壇株，其包含螢火蟲熒光素酶基因。
2.權(quán)利要求1的重組痘苗病毒天壇株，其中所述螢火蟲熒光素酶基因是非分泌型螢火蟲熒光素基因。
3.權(quán)利要求1或2的重組痘苗病毒天壇株，其是CCTCCV201135。
4.一種痘苗病毒中和抗體的檢測方法，包括將權(quán)利要求1至3任一項的重組痘苗病毒天壇株與待測樣品共同孵育； 接種痘苗病毒嗜性細(xì)胞；以及進(jìn)行發(fā)光測定。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述待測樣品為可能包含針對痘苗病毒的中和抗體的樣PΡΠ O
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述痘苗病毒為痘苗病毒天壇株、痘苗病毒安卡拉株或鼠痘病毒。
7.權(quán)利要求4至6任一項的方法，其中所述待測樣品來自人、小鼠或兔的血清。
8.權(quán)利要求4至7任一項的方法，其中所述痘苗病毒嗜性細(xì)胞是Vero細(xì)胞。
9.權(quán)利要求4至8任一項的方法，其中在病毒感染痘苗病毒嗜性細(xì)胞后20小時至40 小時進(jìn)行發(fā)光測定。
10.權(quán)利要求4至8任一項的方法，其中在病毒感染痘苗病毒嗜性細(xì)胞細(xì)胞后20小時至M小時進(jìn)行發(fā)光測定。
11.權(quán)利要求4至10任一項的方法，其中病毒感染劑量為使測定的發(fā)光值結(jié)果的變異系數(shù)小于10%的劑量。
12.權(quán)利要求11的方法，其中病毒感染劑量為66-1800pfu/30000細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中病毒感染劑量為400pfu/30000細(xì)胞。
14.權(quán)利要求4至13任一項的方法，其中Vero細(xì)胞接種量為使測定的發(fā)光值結(jié)果的變異系數(shù)小于10%的接種量。
15.權(quán)利要求14的方法，其中Vero細(xì)胞接種量以96孔板板孔計為10000-30000細(xì)胞/孔。
16.權(quán)利要求1至3任一項的重組痘苗病毒天壇株用于體外檢測樣品中痘苗病毒中和抗體的用途。
17.權(quán)利要求16的用途，其中所述痘苗病毒中和抗體為針對痘苗病毒天壇株、痘苗病毒安卡拉株或鼠痘病毒產(chǎn)生的抗體。
18.一種痘苗病毒中和抗體檢測試劑盒，其包括權(quán)利要求1-3任一項的重組痘苗病毒天壇株。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其進(jìn)一步包括螢光素酶發(fā)光反應(yīng)檢測試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含熒光素酶基因的重組痘苗病毒天壇株，還涉及痘苗病毒中和抗體檢測方法以及包含熒光素酶基因的重組痘苗病毒天壇株用于痘苗病毒中和抗體檢測的用途。
文檔編號C12N7/01GK102391996SQ20111034897
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者劉強(qiáng), 王佑春 申請人:中國食品藥品檢定研究院