專利名稱：一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽及分離純化方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物活性肽的制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽及分離純化方法及用途。
背景技術(shù)：
鷹嘴豆肽是由鷹嘴豆蛋白水解得到的產(chǎn)物，其氨基酸組成與鷹嘴豆蛋白相同，必需氨基酸配比合理、易被人體吸收利用，同時(shí)具有比其蛋白更優(yōu)越的加工特制和功能特性。 鷹嘴豆肽分子量小，易于消化吸收，無蛋白變性、無腥味、易溶于水、在酸性條件下不聚沉、 粘度小、受熱不凝固等加工特性，而且還具有降低血清膽固醇含量、促進(jìn)脂肪代謝、降血壓、 抗還原性、迅速緩解疲勞等功能特性。目前已經(jīng)從鷹嘴豆中分離出了抗菌肽、低致敏性蛋白酶解物、血管緊縮素抑制肽等等?？寡趸臑樯锘钚噪牡囊环N，Yoshinori Mine等人認(rèn)為肽的抗氧化性至少能部分影響其他的生物活性，大量研究已表明肽的抗氧化性與免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降膽固醇、類阿片拮抗活性、抗腫瘤等都有一定的聯(lián)系，可能是其它生理功能的基礎(chǔ)。它通過減少氧自由基、羥自由基，從而達(dá)到抗衰老的功能。具有生物功能的多肽都是有序結(jié)構(gòu)，都有一定的氨基酸百分比組成、排列順序及特殊的高級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，從鷹嘴豆中分離出具有抗氧化性的多肽，并從結(jié)構(gòu)上對(duì)其活性進(jìn)行解析，既對(duì)天然抗氧化肽的應(yīng)用拓寬道路，也為人工合成抗氧化肽奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，顯示出其在醫(yī)藥、食品、飼料等領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。凝膠過濾色譜是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物的分子大小來進(jìn)行分離。分離條件溫和、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性高、設(shè)備簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。質(zhì)譜法目前被認(rèn)為是測(cè)定小分子分子量最精確最靈敏的方法。近年來，隨著各項(xiàng)技術(shù)發(fā)展，質(zhì)譜所能測(cè)定的分子量范圍大大提高?；|(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜成為測(cè)定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級(jí)結(jié)構(gòu)的有效工具。物質(zhì)的紅外光譜具有高度的特征性， 譜圖中的吸收峰與分子中各基團(tuán)的振動(dòng)形式相對(duì)應(yīng)，可用于研究分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵，鑒別多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，是近年發(fā)展起來的一種新型分析測(cè)試技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的分離純化方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的用途。一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽，用CPe-III表示，所述CPe-III的分子量為 115OTa，氨基酸組成為 Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro，二級(jí)結(jié)構(gòu)以 α -螺旋占 66%。一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的分離純化方法，包括如下步驟(1)將脫脂后的鷹嘴豆粉與水按質(zhì)量比為1 8-15的比例混合，用NaOH水溶液調(diào) pH = 8. 3，攪拌提取 0. 5-1. 5h，3500r/min-5000r/min 離心 15min_25min，沉淀再按固液質(zhì)量比為1 3-7的比例提取2-3次，合并上清液，以HCl水溶液調(diào)pH= 5.0沉淀蛋白，分離出上清液，將上清液再次用HCl水溶液調(diào)pH = 3. 7進(jìn)行二次沉淀蛋白，棄上清，合并兩次沉淀，用去離子水洗滌沉淀2-3次，以NaOH水溶液調(diào)pH = 7. 0，攪拌使沉淀復(fù)溶，冷凍干燥即為鷹嘴豆清蛋白；(2)將所述鷹嘴豆清蛋白溶解于蒸餾水中制成質(zhì)量濃度為3-5%的鷹嘴豆清蛋白水溶液；按堿性蛋白酶Alcalase (丹麥NOVO公司)與鷹嘴豆清蛋白的比例為0. 3-0. 4AU/ g，將Alcalase酶放入所述鷹嘴豆清蛋白水溶液中，在pH = 8. 0，反應(yīng)溫度45-55°C的條件下，水解50-70min ；按Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶(丹麥NOVO公司)與鷹嘴豆清蛋白的比例為50LAPU/g，再加入Flavourzyme酶，pH = 7. 0，反應(yīng)溫度50°C的條件下，水解90_120min ； 將酶解液加熱至沸騰，滅酶lOmin，冷卻后離心取上清液冷凍干燥即得鷹嘴豆肽粉末；(3)將處理好的葡聚糖凝膠kphdex G-25，裝柱1. 6X50cm，用記錄儀記錄流出液吸光度情況，待蒸餾水洗脫至基線平穩(wěn)，取鷹嘴豆肽粉末溶解于蒸餾水中后加入到所述葡聚糖凝膠kphdex G-25柱中，以蒸餾水洗脫，流速為0. 61^/1^11，在^Onm處檢測(cè)洗脫液吸光度，分時(shí)段共出現(xiàn)3個(gè)洗脫峰，收集第三個(gè)洗脫峰液體，冷凍干燥后即得到具有抗氧化作用的用CPe- III表示的鷹嘴豆肽。上述的鷹嘴豆肽在制備抗氧化保健品的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用kphdex G-25可以將粗品鷹嘴豆肽中不同分子量的肽段分離開，獲得具有抗氧化效果的CPe-III，分離條件溫和、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性高、設(shè)備簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。利用LC/MS，可以對(duì)CPe-III進(jìn)一步分離純化，并獲得相對(duì)分子質(zhì)量和氨基酸組成等信息。最后通過紅外光譜對(duì)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證，并得出二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。可以從結(jié)構(gòu)水平對(duì)CPe- III的抗氧化機(jī)制進(jìn)行解析，對(duì)天然抗氧化肽的應(yīng)用開辟道路，也為人工合成抗氧化肽奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。從鷹嘴豆肽中分離純化抗氧化肽并測(cè)定其結(jié)構(gòu)的方法。該方法過程簡(jiǎn)單，能耗低， 且產(chǎn)品具有抗氧化的作用，并對(duì)抗氧化肽的人工合成提供依據(jù)。


圖1為鷹嘴豆肽層析圖譜。圖2為CPe-III液相圖譜。圖3為CPe- III—級(jí)質(zhì)譜圖譜。圖4為CPe- III二級(jí)質(zhì)譜圖譜。圖5為CPe- III的紅外光譜圖。圖6為鷹嘴豆肽各組分還原能力的測(cè)定。圖7為鷹嘴豆肽各組分清除DPPH自由基的能力。圖8為鷹嘴豆肽各組分清除· OH自由基的能力。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，并不能對(duì)本發(fā)明作任何限制。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1—種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的分離純化方法，包括下述步驟(1)將脫脂后的鷹嘴豆粉與水按質(zhì)量比為1 10的比例混合，用NaOH水溶液調(diào) PH = 8. 3，攪拌提取lh，4000r/min離心20min，沉淀再按固液質(zhì)量比為1 5的比例提取2 次，合并上清液，以HCl水溶液調(diào)pH = 5. 0沉淀蛋白，分離出上清液，將上清液再次用HCl水溶液調(diào)pH = 3. 7進(jìn)行二次沉淀蛋白，棄上清液，合并兩次沉淀，用去離子水洗滌沉淀3次， 以NaOH水溶液調(diào)pH = 7. 0，攪拌使沉淀復(fù)溶，冷凍干燥Mh即為鷹嘴豆清蛋白；(2)將所述鷹嘴豆清蛋白溶解于蒸餾水中制成質(zhì)量濃度為4. 87%的鷹嘴豆清蛋白水溶液；按Alcalase酶與鷹嘴豆清蛋白的比例為0. 38AU/g JfAlcalase酶放入所述鷹嘴豆清蛋白水溶液中，在pH = 8. 0，反應(yīng)溫度50°C的條件下，水解70min ；按Flavourzyme酶與鷹嘴豆清蛋白的比例為50LAPU/g，再加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反應(yīng)溫度50°C， 的條件下，水解IOOmin ；將酶解液加熱至沸騰，滅酶lOmin，冷卻后離心取上清液冷凍干燥即得鷹嘴豆肽粉末；(3)將處理好的葡聚糖凝膠kphdex G-25，裝柱1. 6X50cm，用記錄儀記錄流出液吸光度情況，待蒸餾水洗脫至基線平穩(wěn)，取鷹嘴豆肽粉末溶解于蒸餾水中后加入到所述葡聚糖凝膠kphdex G-25柱中，以蒸餾水洗脫，流速為0. 61^/1^11，在^Onm處檢測(cè)洗脫液吸光度，分時(shí)段共出現(xiàn)3個(gè)洗脫峰，分別用CPe- I，CPe- II和CPe-III表示，收集第三個(gè)洗脫峰液體，冷凍干燥后即得到具有抗氧化作用的用CPe-III表示的鷹嘴豆肽，見圖1層析圖譜。液質(zhì)聯(lián)用(HLPC-MS)確定CPe- III的一級(jí)結(jié)構(gòu)色譜條件進(jìn)樣量:5 μ L ；流動(dòng)相=A液水(0. 1 % TFA) ；B液乙腈(0. 1 % TFA)； 柱溫室溫；流速:0. 7mL/min。質(zhì)譜條件采用電噴霧電離(ESI)，噴霧電壓4. 5kv,霧化氣( )流量35個(gè)任意值單位，輔助氣(N2)流量5個(gè)任意值單位，毛細(xì)管溫度300°C ；全掃描范圍150m/z-2000m/z ； 進(jìn)行正離子檢測(cè)模式；進(jìn)行在線MS/MS，強(qiáng)度閥值105，離子寬度2，碰撞歸一化能量30 %。應(yīng)用BioWorks3. 3軟件分析碎片信息，從而獲得CPe- III的一級(jí)結(jié)構(gòu)信息，分子量1155Da，氨基酸組成Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro。見圖 2 (保留時(shí)間為 3. 55 處所對(duì)應(yīng)的峰為CPe-III的主要成分)。見圖3 (—級(jí)質(zhì)譜獲得CPe-III的相對(duì)分子質(zhì)量為1155Da)。 見圖 4 ( 二級(jí)質(zhì)譜確定 CPe-III的氨基酸組成=Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pr ο)紅外光譜對(duì)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，并推測(cè)抗氧化性CPe- III的二級(jí)結(jié)構(gòu)CPe- III與KBr混合壓片，采用全反射光譜測(cè)定法(ATR)，歐洲采樣器采樣32次。在 4000^-400^1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。見圖5。(圖5_1和圖5_2對(duì)酰胺I區(qū)譜帶進(jìn)行譜傅里葉自去卷曲和求二階導(dǎo)數(shù)，使用波譜分析軟件OMNIC對(duì)CPe- III原始譜帶進(jìn)行高斯/洛倫茲擬合，計(jì)算峰面積，得知CPe- III二級(jí)結(jié)構(gòu)以α -螺旋為主，占66%。鷹嘴豆肽各組分還原能力的測(cè)定還原能力測(cè)定方法取ImL—定濃度的鷹嘴豆肽溶液，加入2. 5mL 0. 2mol/L pH6. 6的PBS緩沖溶液和2. 5mL 1 %的鐵氰化鉀溶液，充分混勻，在50°C水浴中反應(yīng)20min 后，迅速冷卻，再加入2. 5mL 10%的三氯乙酸，于3000r/min離心lOmin。去沉淀，取上清液 2mL,依次加入2mL蒸餾水和0. 4mL 0.1% FeCl3,充分混合，靜置IOmin后，在700nm波長(zhǎng)處比色。從圖6中可以看出，CPe-III的還原能力明顯高于組分CPe- I和II，在0. 1 25mg/ mL的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增大，還原能力顯著增高。鷹嘴豆肽各組分清除DPPH自由基的能力清除DPPH自由基的測(cè)定方法取ImL不同濃度的CPe溶液與ImL 0. Immol/LDPPH 標(biāo)準(zhǔn)液混合并劇烈震蕩，在室溫下避光反應(yīng)一段時(shí)間(約20min)，然后與517nm處測(cè)吸光值 Ai0樣品空白組以等體積無水乙醇代替DPPH標(biāo)準(zhǔn)液，在然后與517nm處測(cè)吸光值，記為Aj, 對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，在然后與517nm處測(cè)吸光值，記為k0。清除率按照下式計(jì)算清除率(％) = [I-(Ai-Aj)A0] X 100%其中Hki分別代表對(duì)照組，樣品組及樣品空白組的吸光度如圖7可見，鷹嘴豆肽各集份對(duì)DPPH自由基均有顯著的清除作用。在濃度0. 2 5mg/mL的范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，清除DPPH自由基的能力也有所增加。相同濃度下，鷹嘴豆肽各集份的清除DPPH自由基的能力如下CPe- III> CPe- II > CPe- I。CPe- III在 0. 1 lmg/mL的范圍內(nèi)，隨濃度增大，清除速率顯著增加，表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，在 1 5mg/mL的濃度范圍內(nèi)，清除速率趨于平緩。鷹嘴豆肽各組分清除· OH自由基的能力對(duì)·0Η清除能力的測(cè)定方法在干燥的試管中依次加入0. 4mL 50mmol/L磷酸鹽緩沖液(PH = 7. 5),0. ImL 一定濃度的鷹嘴豆肽溶液(空白管以等體積的蒸餾水代替鷹嘴豆肽溶液)，0· ImL 1. 04mmol/L 的 EDTA溶液，0. ImL IOmmol/L H2O2,0. ImL 2mmol/L VC, 0. ImL 60mmol/L脫氧核糖(DR)(對(duì)照組不加DR，補(bǔ)充蒸餾水)，0. Iml lmmol/L FeCl3,各管最終體積1. 0ml，置于37°C的恒溫水浴中保溫Ih后取出，迅速加入ImL 25% (v/v)HCI終止反應(yīng)， 再加入lmLl%硫代巴比妥酸，沸水浴反應(yīng)15min，取出后立即冷卻，于波長(zhǎng)532nm處測(cè)定吸光值，按下式計(jì)算清除率· OH 清除率(% ) = {[A0- (A1-A2) ] /A0} X 100其中k0、、、k2分別代表對(duì)照組、樣品組及樣品空白組的吸光度從圖8可見，鷹嘴豆肽各集份對(duì)·0Η自由基均有顯著的清除作用，并表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，在0. 1 20mg/mL的濃度范圍內(nèi)，CPe- III的清除能力均高于組分CPe- I和 II。實(shí)施例2一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的分離純化方法，包括下述步驟(1)將脫脂后的鷹嘴豆粉與水按質(zhì)量比為1 8的比例混合，用NaOH水溶液調(diào)pH =8. 3，攪拌提取1. 5h,5000r/min離心15min，沉淀再按固液質(zhì)量比為1 3的比例提取3 次，合并上清液，以HCl水溶液調(diào)pH = 5. 0沉淀蛋白，分離出上清液，將上清液再次用HCl水溶液調(diào)pH = 3. 7進(jìn)行二次沉淀蛋白，棄上清液，合并兩次沉淀，用去離子水洗滌沉淀2次， 以NaOH水溶液調(diào)pH = 7. 0，攪拌使沉淀復(fù)溶，冷凍干燥24h即為鷹嘴豆清蛋白；(2)將所述鷹嘴豆清蛋白溶解于蒸餾水中制成質(zhì)量濃度為3%的鷹嘴豆清蛋白水溶液；按Alcalase酶與鷹嘴豆清蛋白的比例為0. 4AU/gdfAlcalase酶放入所述鷹嘴豆清蛋白水溶液中，在pH = 8. 0，反應(yīng)溫度45 °C的條件下，水解60min ；按Flavourzyme酶與鷹嘴
6豆清蛋白的比例為50LAPU/g，加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反應(yīng)溫度50°C，的條件下， 水解IOOmin ；將酶解液加熱至沸騰，滅酶lOmin，冷卻后離心取上清液冷凍干燥即得鷹嘴豆肽粉末。(3)同實(shí)施例1。實(shí)施例3一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的分離純化方法，包括下述步驟(1)將脫脂后的鷹嘴豆粉與水按質(zhì)量比為1 15的比例混合，用NaOH水溶液調(diào) PH = 8. 3，攪拌提取0. 5h,3500r/min離心25min，沉淀再按固液質(zhì)量比為1 7的比例提取2次，合并上清液，以HCl水溶液調(diào)pH = 5. 0沉淀蛋白，分離出上清液，將上清液再次用 HCl水溶液調(diào)pH = 3. 7進(jìn)行二次沉淀蛋白，棄上清液，合并兩次沉淀，用去離子水洗滌沉淀 3次，以NaOH水溶液調(diào)pH = 7. 0，攪拌使沉淀復(fù)溶，冷凍干燥24h即為鷹嘴豆清蛋白；(2)將所述鷹嘴豆清蛋白溶解于蒸餾水中制成質(zhì)量濃度為5%的鷹嘴豆清蛋白水溶液；按Alcalase酶與鷹嘴豆清蛋白的比例為0. 3AU/gdfAlcalase酶放入所述鷹嘴豆清蛋白水溶液中，在pH = 8.0,反應(yīng)溫度55°C的條件下，水解50min ；按Flavourzyme酶與鷹嘴豆清蛋白的比例為50LAPU/g，加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反應(yīng)溫度50°C，的條件下，水解90min ；將酶解液加熱至沸騰，滅酶lOmin，冷卻后離心取上清液冷凍干燥即得鷹嘴豆肽粉末。(3)同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽，用CPe-III表示，其特征是所述CPe-III的分子量為 115OTa，氨基酸組成為 Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro，二級(jí)結(jié)構(gòu)以 α -螺旋占 66%。
2.權(quán)利要求1的一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的分離純化方法，其特征是包括如下步驟(1)將脫脂后的鷹嘴豆粉與水按質(zhì)量比為1 8-15的比例混合，用NaOH水溶液調(diào)ρΗ =8. 3，攪拌提取0. 5-1. 5h，3500r/min-5000r/min離心15min_25min，沉淀再按固液質(zhì)量比為1 3-7的比例提取2-3次，合并上清液，以HCl水溶液調(diào)pH = 5.0沉淀蛋白，分離出上清液，將上清液再次用HCl水溶液調(diào)pH = 3. 7進(jìn)行二次沉淀蛋白，棄上清，合并兩次沉淀， 用去離子水洗滌沉淀2-3次，以NaOH水溶液調(diào)ρΗ = 7. 0，攪拌使沉淀復(fù)溶，冷凍干燥即為鷹嘴豆清蛋白；(2)將所述鷹嘴豆清蛋白溶解于蒸餾水中制成質(zhì)量濃度為3-5%的鷹嘴豆清蛋白水溶液；按堿性蛋白酶Alcalase與鷹嘴豆清蛋白的比例為0. 3-0. 4AU/g，將Alcalase酶放入所述鷹嘴豆清蛋白水溶液中，在PH = 8. 0，反應(yīng)溫度45-55°C的條件下，水解50-70min ；按 Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶與鷹嘴豆清蛋白的比例為50LAPU/g，再加入Flavourzyme酶，pH = 7. 0，反應(yīng)溫度50°C的條件下，水解90-120min ；將酶解液加熱至沸騰，滅酶lOmin，冷卻后離心取上清液冷凍干燥即得鷹嘴豆肽粉末；(3)將處理好的葡聚糖凝膠kphdexG-25，裝柱1.6X 50cm，用記錄儀記錄流出液吸光度情況，待蒸餾水洗脫至基線平穩(wěn)，取鷹嘴豆肽粉末溶解于蒸餾水中后加入到所述葡聚糖凝膠kphdex G-25柱中，以蒸餾水洗脫，流速為0. 6mL/min,在280nm處檢測(cè)洗脫液吸光度， 分時(shí)段共出現(xiàn)3個(gè)洗脫峰，收集第三個(gè)洗脫峰液體，冷凍干燥后即得到具有抗氧化作用的用CPe- III表示的鷹嘴豆肽。
3.權(quán)利要求1所述的鷹嘴豆肽在制備抗氧化保健品的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽及分離純化方法及用途，鷹嘴豆肽用CPe-Ⅲ表示，分子量為1155Da，氨基酸組成為Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋占66％。本發(fā)明的方法分離條件溫和、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性高、設(shè)備簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。本發(fā)明的方法過程簡(jiǎn)單，能耗低，且產(chǎn)品具有抗氧化的作用，并對(duì)抗氧化肽的人工合成提供依據(jù)。
文檔編號(hào)A23L1/305GK102391361SQ20111035239
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者寇曉虹, 彭呂楊, 王 華, 胡冬梅, 薛照輝, 高捷 申請(qǐng)人:天津大學(xué)