專利名稱：一種微生物混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種利用自養(yǎng)產(chǎn)油微藻來獲取高細胞收獲量，同時提高微藻細胞的油脂含量。
背景技術(shù)：
隨著石油資源的日益緊缺、石油價格的不斷上漲、油品供需矛盾的日漸凸顯及環(huán)境污染問題的更加突出，多渠道開發(fā)可再生資源成為必然。來自微生物油脂的柴油具有能量密度高、含硫量低、燃燒充分、潤滑性好等性能，還具有可再生、易生物降解、儲運安全、抗爆性能好等特點，可作為石化能源的替代品。微藻是含油微生物之一，微藻富含蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分(如螺旋藻等)，可用于食品、醫(yī)藥和能源方面；可以大量積累脂肪酸，有些微藻如小球藻，其體內(nèi)脂肪酸含量可占干重的30% 60%。利用培養(yǎng)微藻來積累油脂資源，已經(jīng)成為目前利用太陽能開發(fā)可再生資源最熱門的研究領(lǐng)域。不僅具有巨大的市場潛力，而且具有突出的社會價值。微藻細胞生長方式分一般為光自養(yǎng)和異養(yǎng)碳源兩種，光自養(yǎng)過程要消耗CO2, CO2的有效利用吸收，是實現(xiàn)理想培養(yǎng)效果的關(guān)鍵，同時存在補充CO2與光合作用產(chǎn)生O2的解吸、排出的問題。劉建國等“微藻規(guī)模培養(yǎng)的管道光生物反應器”(CN200410020978.0)及繆堅人等“一種微藻工業(yè)生產(chǎn)用光合生物反應器系統(tǒng)”(CN03128138.9)均采用在光生物反應器系統(tǒng)中加入一種裝置方法，來實現(xiàn)CO2的補給，同時也能實現(xiàn)一定的氧解析效果。異養(yǎng)生長過程是利用有機碳源為底物替代自養(yǎng)過程中的CO2來進行微藻生物質(zhì)的積累，細胞生長速度較快，但細胞內(nèi)油脂積累水平較低。

利用其它非藻類微生物與微藻進行混合培養(yǎng)的研究也比較多，比如CN200910038908.0公開了一種芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，該方法在混合培養(yǎng)體系中使用芽孢桿菌對各微藻進行混合培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，各微藻生長均衡，穩(wěn)定性好，可避免混合培養(yǎng)體系中藻相的生物多樣性單一，避免某種微藻的數(shù)量出現(xiàn)極端優(yōu)勢或劣勢，因此該方法主要用于控制某種微藻在水體中的泛濫。CN200910038910.8公開了一種乳酸桿菌調(diào)控微藻混合培養(yǎng)及協(xié)同凈化養(yǎng)殖排放水的方法，該方法通過乳酸桿菌的直接或間接作用，調(diào)控各種微藻的數(shù)量比例，使各種藻生長均衡，穩(wěn)定性好，通過菌、藻間的協(xié)同作用達到對養(yǎng)殖排放廢水的去氮除磷的目的。上述現(xiàn)有技術(shù)是通過菌體來控制水體中藻的生長均衡，并沒有促進藻的生長和藻細胞中的油脂積累的效果。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種利用兼性厭氧細菌與自養(yǎng)微藻進行異步種子制備，進而實現(xiàn)混合培養(yǎng)的方法，本發(fā)明方法具有提高自養(yǎng)微藻收獲量，提高無機碳源(CO2)的利用率，提高微生物油脂含量，簡化培養(yǎng)裝置等優(yōu)點，同時對兼性厭氧細菌的發(fā)酵過程影響較小，實現(xiàn)兩者同步進行。
本發(fā)明微生物異步混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的方法，包括如下內(nèi)容:
(O培養(yǎng)兼性厭氧細菌種子液，并擴大培養(yǎng)至生物量OD值為5.0 15.0 ；
(2)培養(yǎng)自養(yǎng)微藻種子液，并擴大培養(yǎng)至生物量OD值為2.0 10.0 ；
(3)將擴大培養(yǎng)的兼性厭氧細菌和擴大培養(yǎng)的自養(yǎng)微藻混合，在光照式生物反應器內(nèi)進行混合培養(yǎng)。本發(fā)明方法中，擴大培養(yǎng)的兼性厭氧細菌培養(yǎng)液和擴大培養(yǎng)的自養(yǎng)微藻培養(yǎng)液，在進行混合培養(yǎng)時的混合體積比為2:1 1:2，混合培養(yǎng)在光照式生物反應器內(nèi)進行，混合培養(yǎng)過程中，流加補充兼性厭氧細菌生長代謝所需的有機碳源。本發(fā)明方法中，兼性厭氧細菌包括芽孢桿菌、梭形桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌或克雷伯氏菌等，有機碳源為葡萄糖、甘油、果糖、淀粉、纖維素水解液等，兼性厭氧細菌的代謝產(chǎn)物，即兼性厭氧細菌發(fā)酵產(chǎn)物一般為1，3-丙二醇和/或有機酸等，不同的兼性厭氧細菌得到的發(fā)酵產(chǎn)物有所不同，根據(jù)兼性厭氧細菌的種類不同而有所不同。兼性厭氧細菌種子液培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，如采用攪拌式生物反應器，加入培養(yǎng)基和兼性厭氧細菌，在適宜的條件下進行培養(yǎng)。本發(fā)明方法中，自養(yǎng)微藻包括小球藻、葡萄藻、小環(huán)藻、硅藻等，自養(yǎng)微藻種子液培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，如采用常規(guī)的氣升式光照生物反應器進行培養(yǎng)。本發(fā)明方法中，種子液培養(yǎng)基分別為兼性厭氧細菌培養(yǎng)基和微藻SE培養(yǎng)基。兩種微生物分別進行擴大培養(yǎng)時和擴大培養(yǎng)后的混合培養(yǎng)所用培養(yǎng)基均為混合培養(yǎng)基。混合培養(yǎng)基以兼性厭氧細菌所需基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，同時添加微藻細胞生長所需的無機鹽和微量元素(可以按SE培養(yǎng)基的組成添加相關(guān)`物質(zhì))等?；旌吓囵B(yǎng)過程分批次或連續(xù)補充兼性厭氧細菌發(fā)酵過程所需的有機碳源。本發(fā)明方法中，混合培養(yǎng)一般米用光照生物反應器,混合培養(yǎng)的條件一般米用與兼性厭氧細菌發(fā)酵過程的條件相似的條件，如溫度一般為20°C 37°C，pH值一般為6 9，優(yōu)選為6.5 7.5等。同步混合培養(yǎng)過程中，可以通入氮氣或含二氧化碳的氣體?；旌吓囵B(yǎng)時間一般為I 5天?；旌吓囵B(yǎng)體系中溶解氧量(DO) —般低于lmg/L。本發(fā)明方法利用經(jīng)過擴大培養(yǎng)后的兼性厭氧細菌細胞和微藻細胞進行混合培養(yǎng)，兼性厭氧細菌細胞與微藻細胞生長條件和所需碳源的不同，互相補充和促進。同時由于混合培養(yǎng)前，兩種微生物經(jīng)過擴大培養(yǎng)，各自均處于生長最佳期，混合后培養(yǎng)體系除微生物細胞外，其他組成沒有變化，對兩種微生物的生長影響較小。微藻細胞利用兼性厭氧細菌細胞發(fā)酵后排放的廢棄碳源(CO2)為自身生長碳源，同時維持系統(tǒng)較平穩(wěn)的滲透壓條件(pH值)，通過補充有機碳源保證兼性厭氧細菌細胞不斷生長，通過光條件使微藻細胞不斷生長，從而實現(xiàn)兼性厭氧細菌細胞與微藻細胞的混合培養(yǎng)過程。選擇適宜種類兼性厭氧細菌細胞和適宜種類微藻細胞，通過控制異步擴大培養(yǎng)兼性厭氧細菌細胞和微藻細胞的不同生長時期等條件，使兩者形成相互競爭性穩(wěn)定的共同培養(yǎng)體系，并建立起不同細胞間共生的依存關(guān)系，實現(xiàn)了含油微藻的高效生長過程，并提高了油脂的累積效果，提高了單一含油微藻培養(yǎng)過程中單位發(fā)酵體系內(nèi)的油脂收獲量，從而為微生物油脂的制備奠定了基礎(chǔ)。同時混合培養(yǎng)不會對兼性厭氧細菌細胞的發(fā)酵過程造成影響，可以同時獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)物。微藻對發(fā)酵過程使用的碳源和發(fā)酵產(chǎn)物均具有耐受性，不影響微藻的生長和油脂的積累。


圖1是本發(fā)明一種具體工藝流程示意圖。其中:1-自養(yǎng)微藻種子,2-兼性厭氧細菌種子,3-自養(yǎng)微藻種子液培養(yǎng)反應器，4-兼性厭氧細菌種子液培養(yǎng)反應器,5-自養(yǎng)微藻擴大培養(yǎng)反應器,6-兼性厭氧細菌擴大培養(yǎng)反應器(也即混合培養(yǎng)反應器)，7-酸堿中和劑，8-氣升氣進氣口，9-異步混合培養(yǎng)尾氣出口。
具體實施例方式本發(fā)明微生物混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的方法，具體包括如下內(nèi)容:采用攪拌式生物反應器進行兼性厭氧細菌種子液培養(yǎng)，采用光照式生物反應器進行自養(yǎng)微藻種子液培養(yǎng)，攪拌式生物反應器內(nèi)包括兼性厭氧細菌、細菌發(fā)酵培養(yǎng)基，光照式生物反應器內(nèi)包括微藻藻種和自養(yǎng)培養(yǎng)基?；旌吓囵B(yǎng)之前，兩種微生物分別單獨進行細胞的擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)液培養(yǎng)合格后，將不同培養(yǎng)時期的兩種微生物進行混合，繼續(xù)進行混合培養(yǎng)。其中混合培養(yǎng)基中的有機碳源用于兼性厭氧細菌生長，而兼性厭氧細菌生長所產(chǎn)生的CO2用于微藻生長?；旌吓囵B(yǎng)過程通過正常PH控制、溫度控制和通氣量等控制培養(yǎng)過程。其中混合培養(yǎng)時有機碳源最優(yōu)選采用流加方 式補充，有機碳源被兼性厭氧細菌利用生長，兼性厭氧細菌發(fā)酵后產(chǎn)生較多的二氧化碳，排出細菌體外進入培養(yǎng)系統(tǒng)中，兼性厭氧細菌細胞排出的CO2處于溶解狀態(tài)，可以立即被系統(tǒng)中的微藻細胞利用，作為微藻細胞生長的碳源供應。本發(fā)明方法中，光生物反應器可以是板式、管式、氣升攪拌式等封閉反應器?？梢酝ㄈ氲獨饣蚝趸細怏w為返混動力。生物反應器的其它操作條件按常規(guī)的細菌和微藻培養(yǎng)條件控制。培養(yǎng)體系可以設(shè)置二氧化碳和溶解氧量的測定裝置，根據(jù)需要調(diào)整通氣量，以獲得良好的效果。本發(fā)明方法中，兼性厭氧細菌細胞在有機碳源條件下實現(xiàn)快速生長，兼性厭氧細菌細胞消耗有機碳源，生成細菌生物質(zhì)和各種代謝產(chǎn)物，同時發(fā)酵產(chǎn)生的CO2氣體排出體夕卜，使培養(yǎng)體系內(nèi)無機碳源含量增加，微藻細胞利用這些無機碳源進行光合作用，獲得微藻細胞自身的生長。同時兼性厭氧細菌細胞發(fā)酵使系統(tǒng)的PH值下降，而隨著微藻細胞的生長，利用溶解的CO2，使系統(tǒng)的pH值上升，兩者互為作用，調(diào)節(jié)系統(tǒng)的pH處于適應范圍。同時光生物反應器提供PH電極檢測，以便通過外源加入酸、堿來實現(xiàn)系統(tǒng)pH的控制。本方法中pH控制酸中和劑為HCl、H2SO4、HNO3等常用的無機酸，堿中和劑為NaOH、NaHC03、KOH、Ca (OH) 2、氨水等常用的無機堿。本發(fā)明方法中，混合培養(yǎng)過程溫度控制為內(nèi)部盤管加熱方式。本發(fā)明方法中，混合培養(yǎng)過程通入氣體為氮氣，通入氣體量隨培養(yǎng)液體積變化而變化，通入氣體體積速率與培養(yǎng)系統(tǒng)裝液體積比例為0.1 vvm 1.0 vvm (單位液體體積每分鐘通入的單位氣體量)。本發(fā)明方法中，兼性厭氧細菌細胞所需的有機碳源可以是甘油、葡萄糖、果糖、淀粉、纖維素水解液等，該有機碳源的加入采用流加補充方式進行，根據(jù)培養(yǎng)液成樣品成份分析，隨時檢測系統(tǒng)的有機碳源濃度水平，將配置好的有機碳源母液按消耗速度進行流加。如圖1所示，微藻細胞經(jīng)自養(yǎng)微藻種子液培養(yǎng)反應器3培養(yǎng)至生長達生物量OD =2.0 10.0，兼性厭氧細菌經(jīng)兼性厭氧細菌種子液培養(yǎng)反應器4培養(yǎng)至生物量OD = 5.0
15.0,然后將微藻細胞種子液和兼性厭氧細菌種子液分別轉(zhuǎn)入氣升攪拌式光生物反應器(自養(yǎng)微藻擴大培養(yǎng)反應器5和兼性厭氧細菌擴大培養(yǎng)反應器6)中進行擴大培養(yǎng)，當兼性厭氧細菌擴大培養(yǎng)反應器6中兼性厭氧細菌生長進入指數(shù)生長期(0D = 5.0 15.0)以后，將已經(jīng)進入指數(shù)生長期(0D = 2.0 10.0)的自養(yǎng)微藻擴大培養(yǎng)反應器5中的微藻細胞等體積加入到兼性厭氧細菌擴大培養(yǎng)反應器6中，將兩種處于指數(shù)生長期的微生物混合在一起，進行混合培養(yǎng)。在該混合培養(yǎng)過程中兩種微生物指數(shù)生長期細胞的混合優(yōu)選按等體積進行混合，使兩種微生物細胞處于相同的體系內(nèi)繼續(xù)進行生長，同時經(jīng)過檢測分析混合后培養(yǎng)系統(tǒng)中PH值來調(diào)節(jié)混合液pH至6.5^7.5，進行混合發(fā)酵過程控制。本發(fā)明方法中，混合培養(yǎng)過程有機碳源經(jīng)過補加泵進行不斷補加，維持有機碳源濃度在1.09Γ2.0%范圍內(nèi)?；旌吓囵B(yǎng)條件一般為:溫度為25°C 35°C ;通氣量為0.1 vvm 1.0 vvm,攬拌轉(zhuǎn)速為100 rpm 400rpm,混合培養(yǎng)時間為24h 120h。本發(fā)明方法中，擴大培養(yǎng)過程中，種子液接種量為擴大培養(yǎng)反應器體積的5°/Γ20%。方案I (比較例)
將克雷伯氏菌(中國微生物菌種保藏中心CGMCC0798)在300mL搖瓶中進行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為兼性厭氧細菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)20h后得到所需種子液。將培養(yǎng)的兼性厭氧細菌種子液接入IOL生物反應器中進行擴大培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為混合培養(yǎng)基，反應器為氣升攪拌式，可以實現(xiàn)培養(yǎng)液的返混，反應器為玻璃體，反應器內(nèi)有溫度控制盤管，以及ρΗ、02和CO2傳感器。兼性厭氧細菌為克雷伯氏肺炎桿菌，其培養(yǎng)基為甘油培養(yǎng)基。甘油培養(yǎng)基配方(以每升計):``NH4Cl 5.35 g, KCl 0.75 g, NaH2PO4 1.38 g, Na2SO4 0.28 g, MgCl2.6H20 0.26 g,CaCl2.H2O 0.02 g，酵母提取物 1.0 g，甘油 40 g。
權(quán)利要求
1.一種微生物混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的方法，其特征在于包括如下內(nèi)容: (O培養(yǎng)兼性厭氧細菌種子液，并擴大培養(yǎng)至生物量OD值為5.0 15.0 ； (2)培養(yǎng)自養(yǎng)微藻種子液，并擴大培養(yǎng)至生物量OD值為2.0 10.0 ； (3)將擴大培養(yǎng)的兼性厭氧細菌和擴大培養(yǎng)的自養(yǎng)微藻混合，在光照式生物反應器內(nèi)進行混合培養(yǎng)。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:擴大培養(yǎng)的兼性厭氧細菌培養(yǎng)液和擴大培養(yǎng)的自養(yǎng)微藻培養(yǎng)液，在進行混合培養(yǎng)時的混合體積比為2:1 1:2。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(3)的混合培養(yǎng)過程中，流加補充兼性厭氧細菌生長代謝所需的有機碳源。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:兼性厭氧細菌包括芽孢桿菌、梭形桿菌、雙歧桿囷、乳桿囷或克雷伯氏囷。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:有機碳源為葡萄糖、甘油、果糖、淀粉或纖維素水解液。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:自養(yǎng)微藻包括小球藻、葡萄藻、小環(huán)藻或娃藻。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:兼性厭氧細菌種子液培養(yǎng)基為兼性厭氧細菌培養(yǎng)基，自養(yǎng)微藻種子液培養(yǎng)基為微藻SE培養(yǎng)基。
8.按照權(quán)利要求1所 述的方法，其特征在于:兼性厭氧細菌擴大培養(yǎng)使用混合培養(yǎng)基，自養(yǎng)微藻擴大培養(yǎng)使用混合培養(yǎng)基，混合培養(yǎng)使用混合培養(yǎng)基，混合培養(yǎng)基以兼性厭氧細菌所需基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，同時添加微藻細胞生長所需的無機鹽和微量元素，微藻細胞生長所需的無機鹽和微量元素按SE培養(yǎng)基的組成添加相關(guān)物質(zhì)。
9.按照權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于:混合培養(yǎng)過程分批次或連續(xù)補充兼性厭氧細菌發(fā)酵過程所需的有機碳源。
10.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:混合培養(yǎng)采用光照生物反應器，混合培養(yǎng)的溫度為20°c 37°C，pH值為6 9。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物混合培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的方法，包括如下內(nèi)容(1)培養(yǎng)兼性厭氧細菌種子液，并擴大培養(yǎng)至生物量OD值為5.0～15.0；(2)培養(yǎng)自養(yǎng)微藻種子液，并擴大培養(yǎng)至生物量OD值為2.0～10.0；(3)將擴大培養(yǎng)的兼性厭氧細菌和擴大培養(yǎng)的自養(yǎng)微藻混合，在光照式生物反應器內(nèi)進行混合培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有提高自養(yǎng)微藻收獲量，提高無機碳源(CO2)的利用率，提高微生物油脂含量，簡化培養(yǎng)裝置等優(yōu)點，同時對兼性厭氧細菌的發(fā)酵過程影響較小，實現(xiàn)兩者同步進行。
文檔編號C12R1/22GK103103130SQ20111035245
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者王領(lǐng)民, 金平, 李曉姝, 師文靜, 張霖, 王崇輝, 高大成, 喬凱, 黎元生 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院