專利名稱：兩片段連接法進(jìn)行hbv全基因組克隆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用兩片段連接法進(jìn)行乙型肝炎病毒全基因組克隆的方法。
背景技術(shù)：
從患者血清中擴(kuò)增并克隆HBV全基因組序列，將有助于體外實(shí)驗(yàn)評價(jià)抗病毒藥物或免疫壓力下低病毒含量的HBV復(fù)制力、基因突變特征和頻率及體外感染力，對于監(jiān)控抗病毒療效及深入闡明HBV生物學(xué)活性具有重要意義。以往對于患者血清中低病毒含量HBV全基因組研究大多限于某一基因片段的研究，通過PCR擴(kuò)增個(gè)體內(nèi)HBV基因群中的某些亞基因片段，然后直接測序，可在模板量較低的條件下得到亞基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物，但由于HBV基因內(nèi)部有調(diào)控基因，基因片段間又相互重疊，很可能形成HBV不同基因群片段構(gòu)成一個(gè)可供分析的HBV基因片段，使出現(xiàn)在單個(gè)基因分子上的突變復(fù)雜性及致病和傳播的關(guān)系無法精確和全面分析。有研究發(fā)現(xiàn)，由于病毒體內(nèi)存在不同變異株，這種直接測部分序列的方法不能準(zhǔn)確地提示完整病毒基因結(jié)構(gòu)與病因及傳播的關(guān)系。采取普通的PCR方法擴(kuò)增兩個(gè)片段，對于低病毒含量HBV DNA的擴(kuò)增效果并不理想，特異性不強(qiáng)，且其采用兩次克隆步驟，增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜程度和成本預(yù)算。因此，建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡單方便的低病毒含量HBV全基因組克隆的方法，很有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可對低病毒含量血清樣本中的HBV進(jìn)行全基因組克隆的有效方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種采用兩片段連接法進(jìn)行HBV全基因組克隆的方法，先將HBV DNA進(jìn)行巢式PCR 反應(yīng)，然后分別對擴(kuò)增出的HBV核心區(qū)至S區(qū)(即CS區(qū))和前S區(qū)至X區(qū)(即pSX區(qū))兩個(gè)片段進(jìn)行酶切，并將兩個(gè)酶切片段連接，以此連接產(chǎn)物為模板用PCR方法擴(kuò)增該全基因組后進(jìn)行克??；其特征為所述CS區(qū)為HBV基因組的nt 1821 nt 272，pSX區(qū)為nt 3194 nt 1825 ；且進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)時(shí)所用特異性引物的序列如下SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3是CS區(qū)的外引物序列；SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 4 是 pSX 區(qū)的外引物序列；SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :7是CS區(qū)的內(nèi)引物序列；SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :8 是 pSX 的內(nèi)引物序列。調(diào)整巢式PCR時(shí)的內(nèi)外引物的濃度，可提高反應(yīng)的靈敏度，使其能夠進(jìn)行一管式巢式PCR擴(kuò)增。最佳的引物濃度為外引物終濃度為lOnmol/L ；內(nèi)引物終濃度為200nmol/ L0所述酶切，是擴(kuò)增兩個(gè)片段后，將產(chǎn)物純化后分別使用內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；內(nèi)切酶優(yōu)選使用)(bal。所述連接，是使用連接酶進(jìn)行，優(yōu)選使用T4DNA連接酶。本方法還可采用以下一種或幾種手段進(jìn)行優(yōu)化，可使發(fā)明效果更好或達(dá)到最佳在引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :8序列中加入BspQ I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增全長以后便于從載體上獲得完全不含外源序列的HBV全長基因組。若在PCR反應(yīng)體系中以1 10混合加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶， 既能提高擴(kuò)增的特異性，又可顯著降低成本。便于在實(shí)驗(yàn)室開展。所述用PCR方法擴(kuò)增出兩個(gè)片段時(shí)，采用一管式巢式PCR技術(shù)，可減少污染，提高產(chǎn)量；且只需經(jīng)過一次克隆，簡化了操作步驟。本發(fā)明的有益效果是1、可對血清樣本中低含量的HBV進(jìn)行全基因組克隆，擴(kuò)增的HBV基因組具有生物學(xué)活性；2、不僅可獲得全長HBV DNA，在體外還檢測到較強(qiáng)的病毒復(fù)制力(見實(shí)施例2)；3、操作方法簡便可行。


圖1是HBV DNA CS區(qū)的擴(kuò)增結(jié)果1666bp ；圖2是HBV DNA pSX區(qū)的擴(kuò)增結(jié)果1846bp ；圖3是兩片段連接后HBV全基因組擴(kuò)增結(jié)果3215bp ；
具體實(shí)施例方式以下所用的主要實(shí)驗(yàn)材料來源如下Pfu和Taq DNA聚合酶及病毒DNA提取試劑盒為北京天恩澤基因科技有限公司產(chǎn)品。內(nèi)切酶)(ba I，T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品。實(shí)施例1 HBV全基因組克隆擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)從GenBank中選取7 條HBV全長基因組序列，其中中國人特有的 B和C基因型序列209條，用NTI軟件進(jìn)行比對分析HBV CS區(qū)和pSX區(qū)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，全長引物參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，并加入酶切位點(diǎn)，有助于下一步的復(fù)制力的分析。表1 PCR反應(yīng)使用的引物序列
權(quán)利要求
1.一種采用兩片段連接法進(jìn)行HBV全基因組克隆的方法，先將HBV的DNA進(jìn)行巢式PCR 反應(yīng)，然后分別對擴(kuò)增出的HBV CS區(qū)和pSX區(qū)兩個(gè)片段進(jìn)行酶切，并將兩個(gè)酶切片段連接， 以此連接產(chǎn)物為模板用PCR方法擴(kuò)增該全基因組后進(jìn)行克??；其特征為所述CS區(qū)為HBV基因組的nt 1821 nt 272，pSX區(qū)為nt 3194 nt 1825 ；且進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)時(shí)所用特異性引物的序列如下SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :3是CS區(qū)的外引物序列；SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :4是pSX區(qū)的外引物序列；SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 7是CS區(qū)的內(nèi)引物序列；SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 8是pSX的內(nèi)引物序列。
2.權(quán)利要求1所述的方法，在引物SEQID NO 5和SEQ ID NO 8序列中加入BspQ I 酶切位點(diǎn)。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，所述連接，是使用T4DNA連接酶進(jìn)行。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)時(shí)，調(diào)整內(nèi)外引物的濃度至外引物終濃度為lOnmol/L，內(nèi)引物終濃度為200nmol/L。
5.權(quán)利要求1或2所述的方法，用PCR方法擴(kuò)增出兩個(gè)片段時(shí)，采用一管式巢式PCR方
全文摘要
采用兩片段連接法進(jìn)行HBV全基因組克隆的方法，先將HBV DNA進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，然后分別對擴(kuò)增出的HBV CS區(qū)和pSX區(qū)兩個(gè)片段進(jìn)行酶切，并將兩個(gè)酶切片段連接，以此連接產(chǎn)物為模板用PCR方法擴(kuò)增該全基因組后進(jìn)行克隆。所述CS區(qū)為HBV基因組的nt 1821～nt 272，pSX區(qū)為nt 3194～nt 1825。
文檔編號C12N15/10GK102559657SQ20111035338
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者劉研, 徐東平, 戴久增, 李曉東, 王琳, 王耀, 許智慧, 鐘彥偉 申請人:中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院