專利名稱：對土壤中禾谷多粘菌進(jìn)行檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)作物病害傳播菌的分子診斷技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禾谷多粘菌、PolyWxa ^raffii/ ^)是一種禾本科植物根部專性弱寄生低等原生生物，屬于鞭毛菌亞門多粘菌屬。在世界上的許多國家都有分布。目前的研究表明該菌自身不會(huì)對植物造成明顯的危害，但是卻可以作為至少11種病毒的載體，這些病毒可以引起小麥、大麥、燕麥、水稻等多種作物在內(nèi)的多種病毒病。禾谷多粘菌傳播的病毒常見的有大麥黃花葉病毒(Barley yellow mosaic virus, BYMV，Plumb)、大麥和性花葉病毒(Barley mild mosaic virus，BMMV，)、小麥梭條花葉病毒(Wheat spindle streak mosaic virus,WSSMV)、小麥土傳花葉病毒(Soil-borne wheat mosaic virus, SBWMV )等，這些病毒可造成植株分蘗減少、生長受阻、產(chǎn)量及質(zhì)量下降，給世界糧食生產(chǎn)帶來了極大的危害。如在美國的北部、中部和東北部地區(qū)由WSSMY的侵染可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)對-64%。在加拿大安大略省，WSSMV引起的小麥減產(chǎn)可達(dá)3-59%。在我國由 WYMV —般可造成小麥減產(chǎn)20-30%，重病田減產(chǎn)可達(dá)50-70%，危害巨大。在我國，禾谷多粘菌主要分布在冬麥區(qū)，以長江中下游冬麥區(qū)、黃淮冬麥區(qū)及西南冬麥區(qū)的部分地區(qū)為主。其主要傳播的病害有大麥黃花葉病毒病、小麥黃花葉病毒病及小麥土傳病毒病等。因此研究此類菌在土壤中的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化對于防治各種麥類作物病害具有重要的意義。傳統(tǒng)的病原微生物鑒定都是以染色、培養(yǎng)及生化鑒定等為主，鑒定的周期比較長。 同時(shí)許多病原菌對培養(yǎng)基的營養(yǎng)、抗生素的種類及培養(yǎng)條件等的要求較高，給病原菌的快速、準(zhǔn)確鑒定帶來了很多困難。禾谷多粘菌不能用培養(yǎng)基培養(yǎng)；其厚壁休眠孢子散布于土壤中，存活能夠十多年；在病土中禾谷多粘菌的孢子數(shù)量非常巨大，將病土稀釋15625倍的情況下，仍然能夠有效的侵染小麥；這些都造成禾谷多粘菌的研究非常困難，急需一種簡單快速的檢測技術(shù)。PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、周期短等特點(diǎn)，對不能分離培養(yǎng)的病原菌檢測尤其有優(yōu)勢。目前已成為病原菌快速鑒定的一種主要方法。熒光定量PCR是在PCR定性檢測基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，通過在PCR體系中加入熒光染料或熒光探針，在PCR過程中隨產(chǎn)物的增加熒光信號實(shí)時(shí)積累，通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線可實(shí)現(xiàn)對未知樣本中初始模板量進(jìn)行定量。近年來PCR及熒光定量PCR技術(shù)在其他植物病原菌的鑒定中已經(jīng)較為廣泛的應(yīng)用，而PCR用于禾谷多粘菌的研究還較少。所見的報(bào)道為Ward E等(Ward Ε, Kanyuka K, Motteram J, Kornyukhin D, Adams M J. The use of conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host plant resistance, inoculum levels and intraspecific variation. New Phytologist, 2005, 165(3): 875-885)設(shè)計(jì)合成了一對特異性引物用于禾谷多粘菌的檢測及定量，其設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增片段大小為430bp，而熒光定量是利用一條探針，其檢測禾谷多粘菌的方法相對于利用熒光染料的檢測方法而言需要合成特異性探針、價(jià)格昂貴，且PCR片段相對偏長，不適合大量樣品的熒光定量檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)上述研究領(lǐng)域的不足，提供禾谷多粘菌的PCR方法檢測方法及快速熒光定量方法。該方法通過設(shè)計(jì)一對針對禾谷多粘菌的特異性引物，對待測樣本進(jìn)行檢測及初始模板定量。檢測的特異性好、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種對土壤中禾谷多粘菌進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，在NCBI中篩選出多個(gè)禾谷多粘菌核糖體rDNA序列，在它們相對于其他菌的rDNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，通過上游引物SEQ ID No. 1和下游引物SEQ ID No. 2對土壤樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由擴(kuò)增產(chǎn)物判斷土壤中禾谷多粘菌的存在狀況。本發(fā)明的一種PCR 反應(yīng)體系為10 X PCR Buffer 2.5 μ , dNTP 2 mM 2.5 μ , 上游引物 10 MM 1.0 μ ，下游引物 10 μΜ 1.0 μ , DNA 1.0 μL, aq DNA polymerase 5 υ/μι 0. 2 μ , ddH20 16. 8 μ ，終體積為 25μ ；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5 min ； 94°C 變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸30 s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸8 min。在這種PCR反應(yīng)體系中，所述的由擴(kuò)增產(chǎn)物判斷土壤中禾谷多粘菌的存在狀況是指對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠進(jìn)行EB染色，在紫外燈下觀察，是否存在大小為300bp的DNA條帶，由此判斷土壤中是否含有禾谷多粘菌。對大小為300bp的DNA條帶的特異性片段進(jìn)行凝膠回收后，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，其測序結(jié)果與禾谷多粘菌序列AJ841287的同源性為100%，其測序結(jié)果與禾谷多粘菌序列 AJ841287的同源性為100%。本發(fā)明的另一種PCR反應(yīng)體系為2XMaster Mix 10 μ ，上游引物10 μΜ 0.5 PL，下游引物 10 μΜ 0.5 μ , DNA 1.0 μ ，ddH20 8 μ ，終體積為 20μ ;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5 min，94°C變性10 s，55°C退火10 s，72°C延伸20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在這種PCR反應(yīng)體系中，所述的由擴(kuò)增產(chǎn)物判斷土壤中禾谷多粘菌的存在狀況是指由熒光定量PCR儀根據(jù)熒光信號的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線直接測出土壤中禾谷多粘菌實(shí)際含量。所述的熒光定量PCR儀可以采用Mratagene公司或ABI公司或Eppendorf公司或BioRad公司或Corbett公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明利用一對合成的特異性引物對土壤樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過擴(kuò)增產(chǎn)物對土壤樣本中的禾谷多粘菌進(jìn)行檢測及定量，避免了傳統(tǒng)研究中檢測禾谷多粘菌的過程繁瑣、復(fù)雜，且不易計(jì)數(shù)的缺點(diǎn)。其檢測方法方便、快速、特異性好、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)，并且可以同時(shí)進(jìn)行多樣本的檢測。對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中相關(guān)麥類病害的診斷具有一定的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為特異性引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2擴(kuò)增土壤DNA的結(jié)果。其中，M泳道，DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1泳道，麥田土壤DNA ；2泳道，非麥田土壤DNA ；3泳道，陰性對照。圖2為引物的特異性擴(kuò)增檢測結(jié)果。其中，M泳道，DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1泳道，陰性對照；2泳道，質(zhì)粒；3泳道，禾谷鐮刀菌；4泳道，雪腐鐮刀菌；5泳道，尖孢鐮刀菌6泳道，禾谷絲核菌；7泳道，立枯絲核菌；8 泳道，麥田土壤DNA。圖3為熒光定量PCR的擴(kuò)增動(dòng)態(tài)曲線圖。圖4為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖5為熒光定量PCR的熔解曲線圖。圖6為小麥主要生育期內(nèi)小麥根際土壤中禾谷多粘菌的擴(kuò)增情況。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。實(shí)施例1
特異性引物的設(shè)計(jì)、合成
在NCBI中篩選出多個(gè)禾谷多粘菌核糖體DNA (rDNA)序列，通過序列分析，在其相對于其他菌的rDNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 正向引物SEQ ID No. 1 5- CTGCGGAAGGATCATTAGCGTTG -3 反向引物SEQ ID No. 2 5- CCGATACTCAGAGAGGCATGCT -3 引物委托上海生工生物工程公司合成。實(shí)施例2
建立禾谷多粘菌擴(kuò)增的PCR體系與條件特異性引物對由實(shí)施例1提供
采用 UltraClean soil DNA Isolation Kit (Mo Bio，USA)提取麥田小麥根際土及非麥田土總DNA，每份土樣為0. 5g鮮重，提取的總DNA溶于50 μ ddH20中。PCR反應(yīng)體系為10 X PCR Buffer 2.5 μ , dNTP 2 mM 2. 5 μ ，正向引物 10 μΜ) 1.0 μ ，反向引物 10 μΜ I. O μι, DNA 1.0 μι, Taq DNA polymerase 5 U/μ 0.2 PL，ddH20 16.8 μ ，終體積為25μ 。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5 min ； 94°C變性30 s，55°C退火 30 s，72°C延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸8 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析， 電壓110V，30分鐘后在紫外燈光下進(jìn)行產(chǎn)物觀察，結(jié)果(圖1)顯示，可以擴(kuò)增出單一條帶， 片段的大小在300bp左右。將特異性片段進(jìn)行凝膠回收后，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，將獲得的陽性克隆交由上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果為SEQ ID No. 3
CTGCGGAAGG ATCATTAGCG TTGAATTGGT CTTGGTGCCA TGCGAAMAC ATGTGGATTG 60 TGGGCTATGT GACCCCTCTG TGGGGGGTAT TTTGTCGCGA ACTCGGGAGA ATTGGCTAAT
120
GGAATCATAA AGATAAACAA AATACAACTC TTAGCAATAG ATATCTTGGT TCCCGCAACG180
ATGAAGAACG CAGCGAAATG CGATACGTAA TGCGAATTGC AGAATTCAGT GAATCATCGA
240
ATCTTTGAAC GCAAGTTGCG CTTTCGAGAG CCCTCGGAAG CATGCCTCTC TGAGTATCGG
300
該序列與 Ward E 等(Ward Ε, Kanyuka K, Motteram J, Kornyukhin D, Adams M J. The use of conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host plant resistance, inoculum levels and intraspecific variation. New Phytologist, 2005, 165(3) : 875-885)獲得的禾谷多粘菌序列 (AJ841287)的同源性為100%。說明獲得的序列正確。實(shí)施例3 引物的特異性檢測
選擇5種土壤中常見的病原真菌禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、雪腐鐮刀菌(Fusarium fliKa/e)、尖抱 廉刀菌 ifusariumaxysporum)、無谷電極鬼{Rhizoctonia cerealis)及立枯絲核菌(J^izoctonia soIani)進(jìn)行引物的驗(yàn)證，提取這幾種菌純培養(yǎng)物的總DNA為模板，以構(gòu)建的質(zhì)粒DNA[由實(shí)施例2獲得的大小在300bp左右特異性片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后連接PMD-19T載體(TaKaRa，大連)，克隆轉(zhuǎn)化后獲得]及小麥根際土壤 DNA為陽性對照，參照實(shí)施例2條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，只有在質(zhì)粒及土壤中DNA有擴(kuò)增產(chǎn)物，幾種菌都沒有相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果說明引物的特異性很好，可以用于禾谷多粘菌的特異性分析。實(shí)施例4
熒光定量PCR體系的建立及檢測限分析特異性引物對由實(shí)施例1提供
(1)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒DNA的制作過程利用Ultra Clean soil DNA Isolation Kit試劑盒(Mo Bio，美國)對小麥根際土壤進(jìn)行DNA提取，利用上述特異性引物及PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，獲得300bp的產(chǎn)物，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后連接PMD-19T載體 (TaKaRa，大連)，克隆篩選后進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果(SEQ ID No. 3)顯示與GenBank中多個(gè)禾谷多粘菌的序列100%同源，說明所獲得序列正確，陽性質(zhì)?？捎糜谫|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制作。(2)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制作與擴(kuò)增條件選取序列正確的陽性克隆提取質(zhì)粒，按下述公式計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)
質(zhì)?？截悢?shù)(copy/μ ) =質(zhì)粒濃度(g/μ ) X6. 023X 1023 (copyM)/MW (g/mol)(其中MW=(克隆載體長度+目的片段長度)(bp) X324X2g/ (mol bp)。取構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行IO7-IO1c0PyAa系列梯度稀釋，以稀釋好的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR分析，同時(shí)設(shè)置陰性對照。20 μ 反應(yīng)體系2XMaster Mix 10 μ , ddH20 8 μ ，正向引物 10 Mmol/L 0.5 μ ，反向引物 10 Mmol/L 0.5 μ , DNA 1.0 μ 。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5 min，94°C變性10 s，55°C退火10 s，72°C延伸20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在Rotor Gene 6000儀器(Corbett，Australia)上進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線及熔解曲線由儀器自動(dòng)生成。結(jié)果顯示擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(圖3)呈S型曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示(圖4)，質(zhì)粒拷貝數(shù)在IO7-IO1c0PyAi范圍內(nèi)，Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，直線回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0. 99597，引物的擴(kuò)增效率為0. 96。從熔解曲線(圖5)可以看出擴(kuò)增產(chǎn)物單一， Tm值非常均一，引物的特異性好。結(jié)果顯示熒光定量PCR的檢測限為IO1c0PyAa模板(圖 3)。實(shí)施例5
冬小麥主要生育期根際土壤中禾谷多粘菌生長動(dòng)態(tài)分析采用實(shí)施例4的熒光定量PCR體系
熒光定量PCR儀采用Corbett公司(Australia)生產(chǎn)的Rotor Gene 6000熒光定量PCR 進(jìn)行。分別于冬小麥生長的返青期、孕穗期、揚(yáng)花期、灌漿期及成熟期在相同地點(diǎn)采集小麥根際土壤，提取DNA，利用實(shí)施例1提供的特異引物對采用實(shí)施例4的擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增， 結(jié)果記錄在圖6中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算即可獲得土壤樣本中初始禾谷多粘菌的含菌量。結(jié)果顯示在小麥生長的主要生育期內(nèi)，土壤中的禾谷多粘菌數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢， 在小麥揚(yáng)花期土壤中禾谷多粘菌的數(shù)量最多。
權(quán)利要求
1.一種對土壤中禾谷多粘菌進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，在NCBI中篩選出多個(gè)禾谷多粘菌核糖體rDNA序列，在它們相對于其他菌的rDNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，通過上游引物SEQ ID No. 1和下游引物SEQ ID No. 2對土壤樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由擴(kuò)增產(chǎn)物判斷土壤中禾谷多粘菌的存在狀況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對土壤中禾谷多粘菌進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為10 X PCR Buffer 2.5 μ , dNTP 2 mM 2.5 μ ，上游引物 10 μΜ 1.0 μ ，下游引物 10 μΜ 1.0 μ , DNA 1.0 μ , Taq DNA polymerase 5 U/μ 0.2 μ , ddH20 16. 8 PL，終體積為25μ ；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5 min ； 94°C變性30 s，55°C退火30 s， 72°C延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸8 min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的對土壤中禾谷多粘菌進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，所述的由擴(kuò)增產(chǎn)物判斷土壤中禾谷多粘菌的存在狀況是指對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠進(jìn)行EB染色，在紫外燈下觀察，是否存在大小為300bp的 DNA條帶，由此判斷土壤中是否含有禾谷多粘菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的對土壤中禾谷多粘菌進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，對大小為300bp的DNA條帶的特異性片段進(jìn)行凝膠回收后，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，其測序結(jié)果與禾谷多粘菌序列AJ841287的同源性為100%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對土壤中禾谷多粘菌進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，所述PCR 反應(yīng)體系為2XMaster Mix 10 μ ，上游引物10 MM 0.5 μ ，下游引物10 μΜ 0.5 μ , DNA 1.0 μ , ddH20 8 μ ，終體積為20μ ;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5 min ;94°C變性 10 s，55°C退火10 s，72°C延伸20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的對土壤中禾谷多粘菌進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，所述的由擴(kuò)增產(chǎn)物判斷土壤中禾谷多粘菌的存在狀況是指由熒光定量PCR儀根據(jù)熒光信號的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線直接測出土壤中禾谷多粘菌實(shí)際含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的對土壤中禾谷多粘菌進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，所述的熒光定量PCR儀為Stratagene公司或ABI公司或Eppendorf公司或BioRad公司或Corbett 公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對土壤中禾谷多粘菌進(jìn)行檢測的方法，其特征在于，在NCBI中篩選出多個(gè)禾谷多粘菌核糖體rDNA序列，在它們相對于其他菌的rDNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性引物SEQIDNo.1和SEQIDNo.2，通過上游引物SEQIDNo.1和下游引物SEQIDNo.2對土壤樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由擴(kuò)增產(chǎn)物判斷土壤中禾谷多粘菌的存在狀況。
文檔編號C12Q1/04GK102424835SQ201110353970
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者史建榮, 吳季榮, 徐劍宏, 林凡云, 祭芳 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院