專利名稱：殺滅ndm-1肺炎克雷白氏菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及消毒滅菌領(lǐng)域，特別是涉及殺滅NDM-1肺炎克雷白氏菌(NDM-l-positive Klebsiella pneumoniae)的方法。
背景技術(shù)：
快速于世界各地散播的NDM-1 (New Delhi Metallo-β-lactamase)陽性病原菌已對公共衛(wèi)生與臨床治療造成極大困擾與威脅，如何有效避免此類病原菌的散播并將其殺死成為首要議題。日前，于臺灣大學(xué)所發(fā)展出來的病毒崩(VirusBom)可以快速且有效地殺死不同的病原菌，包含病毒與細(xì)菌，在公共衛(wèi)生防治上有其應(yīng)用的潛能。因此，我們想進(jìn)一步探討是否病毒崩可以有效殺死與避免NDM-1陽性病原菌的散播。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供了殺滅NDM-1肺炎克雷白氏菌的方法，其中使用病毒崩。病毒崩的濃度在300ppm至IOOOppm之間。更進(jìn)一步的，病毒崩的濃度是300ppm。本發(fā)明的另一個目的在于提供了病毒崩在殺滅NDM-1肺炎克雷白氏菌中的應(yīng)用。病毒崩的濃度在300ppm至IOOOppm之間。更進(jìn)一步的，病毒崩的濃度是300ppm。根據(jù)本發(fā)明，病毒崩可以直接殺死從臺灣所分離出來的NDM-1陽性的肺炎克雷白氏菌。當(dāng)300ppm的病毒崩在室溫下與此細(xì)菌直接反應(yīng)，可以在短短一分鐘內(nèi)快速殺死它。電子顯微鏡與熒光染色分析顯示病毒`崩的毒殺機制是經(jīng)由改變NDM-1肺炎克雷白氏菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致其死亡。實驗表明，當(dāng)此細(xì)菌處在含有不同濃度病毒崩的培養(yǎng)液環(huán)境下培養(yǎng)，就算高達(dá)300ppm的病毒崩并不會明顯改變其生長，但卻可以有效地抑制其生物膜(Biofilm)的形成，甚至已經(jīng)形成的生物膜在300ppm的病毒崩直接處理之后，生物膜可以有效地被瓦解。因此，從目前的結(jié)果顯示，病毒崩可以快速殺死帶有NDM-1的肺炎克雷白氏菌，并通過抑制生物膜的形成來避免此類細(xì)菌的散播與附著，因此未來有極大的潛能應(yīng)用于醫(yī)院與公共場所的衛(wèi)生防護(hù)。


圖1是表明病毒崩對NDM-1的肺炎克雷白氏菌具有毒殺作用的不意圖。圖1A表示NDM-1的肺炎克雷白氏菌在所標(biāo)示濃度的病毒崩和I %乙醇中(控制組)培養(yǎng)標(biāo)定時間所長出的菌落；圖1B表示NDM-1的肺炎克雷白氏菌在所標(biāo)示濃度的病毒崩和I %乙醇中(控制組)培養(yǎng)標(biāo)定時間后存活的細(xì)菌數(shù)(CFU/ml)，ND表示未偵測到菌落數(shù)；圖1C顯示通過掃描式電子顯微鏡觀察NDM-1的肺炎克雷白氏菌在LB，控制組或300ppm病毒崩中生長狀況；
圖1D顯示經(jīng)LIVE/DEAD BacLight Kits (Invitrogen)染色后,利用正立突光顯微鏡(Leica, Germany)觀察NDM-1的肺炎克雷白氏菌在LB,控制組或300ppm病毒崩中死活比例；圖2是表明病毒崩抑制具有NDM-1的肺炎克雷白氏菌的生物膜的形成的示意圖；圖2A表不利用分光光度計測定630nm的吸光值(OD63tl)用于定量分析生物膜；圖2B表示利用分光光度計測定測定0D_的吸光值用于表示細(xì)菌生長密度；圖2C表示利用分光光度計測定測定630nm的吸光值(OD63tl)用于定量分析NDM-1的肺炎克雷白氏菌在未處理組，控制組和病毒崩組中的生物膜。
具體實施例方式1.方法與材料細(xì)菌菌株與培養(yǎng)條件帶有NDM-1的肺炎克雷白氏菌是從第一個在臺灣疾病管制局(Taiwan CDC)所報導(dǎo)案例的38歲臺灣男子所分離出來的(Wu et al.)。一般肺炎克雷白氏菌的培養(yǎng)是接種單一菌落在Luria Broth (LB，Difco，LB培養(yǎng)基)培養(yǎng)液中，然后在37°C隔夜振蕩培養(yǎng)。為了獲取快速生長期階段的細(xì)菌，將隔夜培養(yǎng)菌液1: 100稀釋于新的LB培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)至細(xì)菌密度在600nm吸光值(0D600)約在0.3至0.5左右,通過離心方式(8000rpm、IOmin)收集此階段的細(xì)菌。經(jīng)過無菌的phosphate buffer saline (磷酸鹽緩沖液，PBS, ρΗ7.4)洗滌I次后，回溶在所指定的溶液中進(jìn)行下階段的實驗?；瘜W(xué)藥品病毒崩(VirusBom)由臺灣蔓妮藝能有限公司(MoneyMarketing Corporation,Taiwan)所提供。病毒崩的高濃度原始溶液為lOOOppm，后續(xù)在不同溶液中所配制的不同濃度病毒崩都由此原始溶液序列稀釋得來。病毒崩的原始溶劑以I %乙醇溶液為基礎(chǔ)。D-glucose從美國Sigma公司所購買。Luria Broth從美國Difco公司購買。實施例11.病毒崩的毒殺作用將帶有NDM-1的肺炎克雷白氏菌在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至快速生長期階段。IX IO8菌落數(shù)(colony-forming unit, CFU)的NDM-1的肺炎克雷白氏菌經(jīng)由離心(離心速度8000rpm、IOmin)并去掉上清液之后，回溶在100 μ I所標(biāo)示濃度(ppm)的病毒崩溶液或1%乙醇溶液(控制組)中，混合均勻后，立即或在室溫培養(yǎng)所標(biāo)示的時間長度。利用無菌的PBS (pH7.4)序列稀釋之后，取出稀釋液均勻涂抹于LB固態(tài)培養(yǎng)基上，在37°C隔夜培養(yǎng)，觀察所長出的菌落(如圖1A所示)。并計數(shù)所形成的菌落數(shù)，圖1B表示各組存活的細(xì)菌數(shù)，各組所存活的菌落數(shù)以CFU/ml表示，重復(fù)兩次獨立實驗，計算其平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，相對于控制組的數(shù)據(jù)，利用Student’ s t-test(T檢驗)計算統(tǒng)計差異?！?，P < 0.0001;ND(non-detected)表示未偵測到菌落數(shù)。實驗結(jié)果顯示300ppm的病毒崩在室溫下與此細(xì)菌直接反應(yīng)，可以在短短一分鐘內(nèi)直接快速殺死從臺灣所分離出來的NDM-1陽性的肺炎克雷白氏菌。因此病毒崩對NDM-1的肺炎克雷白氏菌具有毒殺作用。2.掃描式電子顯微鏡影像分析
如同病毒崩毒殺作用的方法描述，經(jīng)過LB(未處理)，1%乙醇溶液(控制組)，或300ppm病毒崩(VB)處理的細(xì)菌，經(jīng)離心收集之后，進(jìn)行掃描式電子顯微鏡分析，其中樣品處理是參照先前報導(dǎo)的操作步驟(Lembke et al.，2006)。圖像觀察與擷取是利用長庚大學(xué)顯微鏡中心所提供的掃描式電子顯微鏡(Hitachi S-3000N, JAPAN)來處理。所呈現(xiàn)的圖片為10000倍放大倍數(shù)，Scale bar，5 μ m。結(jié)果顯示在圖1C中。細(xì)菌存活分析利用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits (Invitrogen)來分析經(jīng)由病毒崩處理后之細(xì)菌是否 因為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變而呈現(xiàn)死亡。參照所提供的方法，離心收集下來的細(xì)菌經(jīng)由SYTO 9和propidium iodide (PI) (I: I混合)染色后，移至1-1.5%agarose(瓊脂糖)平面上，利用正立熒光顯微鏡(Leica DM2500)分析，圖像呈現(xiàn)明視野(differential interference contrast, DIC),與突光視野(13 or TX)的圖像，影像掘取與后制經(jīng)由 Spot RT 3 Slider charge-coupled device (CCD) camera (DiagnosticInstruments Inc.)與 Spot (Diagnostic Instruments Inc.)。Scale bar,5iim0 結(jié)果顯示在圖1D中。實施例2生物膜貼附實驗生物膜貼附實驗是根據(jù)先前Lin et al.(Lin et al.)的步驟，經(jīng)過簡單修飾之后來進(jìn)行。取LB隔夜培養(yǎng)的菌液(4X IO6)，經(jīng)由離心并去掉上清液之后，以1: 100稀釋于含有0.2% glucose (葡萄糖)及不同濃度(ppm)的病毒崩或I %乙醇(控制組)的LB培養(yǎng)液(IOOul)中進(jìn)行回溶。混合之后，分裝至polyvinylchloride (PVC)材質(zhì)的96孔盤之中，在37°C及50rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24小時。上清液移至新的透明的96孔盤(NUNC，平底)，利用分光光度計計數(shù)在600nm的吸光值(0D_),以表不在含有不同濃度病毒崩之培養(yǎng)液之下，細(xì)菌的生長密度(如圖2B所示)。取出上清液后的各孔，經(jīng)由PBS(pH7.4)洗過三次，室溫烘干10分鐘,最后加入150μ I的1%結(jié)晶紫(crystal violet, Sigma)溶液至各孔中，室溫靜置20分鐘進(jìn)行染色，去掉結(jié)晶紫上清液并以二次水洗滌三次后，室溫烘干10分鐘，之后以照相機擷取影像以顯現(xiàn)生物膜形成的外觀(下半部分)。之后加入200 μ 195%乙醇至各槽中，反應(yīng)10分鐘以溶解出所染上的結(jié)晶紫，以二次水校正至I毫升之后，利用分光光度計測定630nm的吸光值(OD63tl)對生物膜(上半部分)進(jìn)行定量分析以表示生物膜貼附程度，如圖2A所述。經(jīng)過三次獨立實驗之后,計算出平均值與標(biāo)準(zhǔn)差,利用Student’s t_test計算各實驗組相對于控制組之統(tǒng)計差異P值。*，P < 0.05廣，P < 0.01。為了了解是否病毒崩具有崩解已形成之生物膜的能力，NDM-1陽性的肺炎克雷白氏菌進(jìn)行如同圖2A所描述的生物膜貼附實驗步驟。參考圖C所示，帶有NDM-1的肺炎克雷白氏菌在含有0.2%葡萄糖LB培養(yǎng)液中形成生物膜之后，完全未作任何處理的控制組(UT)保持在原先培養(yǎng)液之中；實驗組則是在去掉上清液之后，加入200μ I的300ppm病毒崩溶液(VB)或1%乙醇溶液(mock，控制組)，靜置培養(yǎng)所標(biāo)示的時間之后，去除各組的上清液，利用如同圖2B的相同的洗滌與染色步驟，進(jìn)行拍照與定量。生物膜形成的外觀如圖所示(下半部分)。生物膜的定量以O(shè)D63tl來表示，進(jìn)行三次獨立試驗。從三次獨立實驗中得到平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，相對于未處理之控制組(UT),利用Student’s t_test計算各實驗組相對于控制組之統(tǒng)計差異P值。*，P<0.05;*，P<0.01。圖2的結(jié)果顯示病毒崩抑制NDM-1的肺炎克雷白氏菌的生物膜形成。因此本發(fā)明證實病毒崩(VirusBom)具有直接毒殺帶由NDM-1的肺炎克雷白氏菌的功能。重要的是，該細(xì)菌的生物膜形成能力可有效的被病毒崩所抑制。因此，本發(fā)明人相信病毒崩所擁有的生物膜抑制和毒殺作用在未來會具有極大的應(yīng)用價值。參考文獻(xiàn)Lembke , C.，A.Podbielski，C.Hi dal go-Gras s，L.Jonas, Ε.Hanski &B.Kreikemeyer, (2006) Characterization of biofilm formation by clinicallyrelevant serotypes of group A streptococci (通過A組鏈球菌的臨床相關(guān)血清型鑒定生物膜的想成).Appl Environ Microbiol 72:2864-2875.
Lin, C.S.，J.T.Horng，C.H.Yang，Y.H.Tsai, L.H.Su，C.F.Wei, C.C.Chen,S.C.Hsieh, C.C.Lu & H.C.Lai, Rs s AB-FI hDC-Sh I BA as a major pathogenesis pathwayin Serratia marcescens (在粘質(zhì)沙雷菌中RssAB-FlhDC-ShlBA作為主要的致病途徑).1nfect Immun 78:4870-4881.
Wu, H.S.，T.L.Chen, 1.C.Chen, M.S.Huang, F.D.Wang, C.P.Fung & S.D.Lee,First identification of a patient colonized with Klebsiella pneumoniae carryingblaNDM-1 in Taiwan (臺灣攜帶blaNDM_l的肺炎克雷白氏菌的病人的首次鑒定).J ChinMed Assoc 73:596_598.`
權(quán)利要求
1.一種殺滅 NDM-1 肺炎克雷白氏菌(NDM-l-positive Klebsiella pneumoniae 或NDM-1-Producing Klebsiella pneumoniae)的方法，其中使用病毒崩。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用病毒崩的濃度在300ppm至IOOOppm之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用病毒崩的濃度是300ppm。
4.一種病毒崩在制備殺滅NDM-1肺炎克雷白氏菌的試劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中病毒崩的濃度在300ppm至IOOOppm之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用`，其中病毒崩的濃度是300ppm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殺滅NDM-1肺炎克雷白氏菌的方法，其中使用病毒崩。另外本發(fā)明還涉及病毒崩在制備殺滅NDM-1肺炎克雷白氏菌的試劑中的應(yīng)用。
文檔編號C12N1/20GK103103144SQ20111035426
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者王興嫻 申請人:蔓妮藝能有限公司