專利名稱：人pten基因的啟動子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及人PTEN基因的啟動子的克隆及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deletedon chromosome ten，PTEN)是于1997年發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)PTEN不僅與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，與其他呼吸系統(tǒng)疾病，如支氣管哮喘等也有著一定的關(guān)系?，F(xiàn)有技術(shù)公開了 PTEN的基因序列，其位于染色體10q23. 31，全長2001Λ，其成熟蛋白是由403位氨基酸構(gòu)成的一條多肽鏈，相對分子質(zhì)量為56KD ；通過對氨基酸開放讀碼框 (openreading frame,0RF)的序列分析，提示它含有一個酪氨酸磷酸酶域，以及一個與雞張力蛋白和牛輔助蛋白同源的大區(qū)域；它還包括一個C2域，該域在PTEN與膜的結(jié)合中發(fā)揮作用，也在調(diào)控細(xì)胞遷移中發(fā)揮一定的作用；在PTEN的結(jié)構(gòu)中，還存在一個有三個氨基酸序列的C端，可結(jié)合I^d-95/Dlg/Z0-l(PDZ)域(由90個氨基酸殘基組成的重復(fù)序列，因最早發(fā)現(xiàn)于I^d-95、Dlg和Z0-1而命名，又稱為GLGF重復(fù)子)，并與恢復(fù)PTEN的膜結(jié)合有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)PTEN參與了小鼠哮喘的發(fā)病機(jī)制。在卵蛋白(OVA)誘發(fā)的哮喘小鼠模型中，PTEN蛋白表達(dá)和活性均降低，在給予PII抑制劑(渥曼青霉素)或PTEN腺病毒cDNA 后，可明顯減少嗜紅細(xì)胞水平和氣道炎癥，即上調(diào)PTEN表達(dá)能治療哮喘。在過敏原誘發(fā)的哮喘小鼠模型給予PPAR- γ促效劑或PPAR- γ腺病毒后，PTEN表達(dá)上調(diào)。通過測量Akt磷酸化水平的減少發(fā)現(xiàn)該上調(diào)與PUK活性降低有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)表明PPAR-γ在哮喘發(fā)病學(xué)中， 通過調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)而起到保護(hù)作用。上述研究結(jié)果表明PTEN參與了人類哮喘的發(fā)病機(jī)制。哮喘是世界公認(rèn)的醫(yī)學(xué)難題，被世界衛(wèi)生組織列為疾病中四大頑癥之一。與哮喘相關(guān)的癥狀有咳嗽、喘息、呼吸困難、胸悶、咳痰等。典型的表現(xiàn)是發(fā)作性伴有哮鳴音的呼氣性呼吸困難。嚴(yán)重者可被迫采取坐位或呈端坐呼吸，干咳或咯大量白色泡沫痰，甚至出現(xiàn)紫紺等。哮喘癥狀可在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)作，經(jīng)數(shù)小時(shí)至數(shù)天，用支氣管擴(kuò)張藥或自行緩解。早期或輕癥的患者多數(shù)以發(fā)作性咳嗽和胸悶為主要表現(xiàn)。盡管哮喘的治療在多方面取得了進(jìn)步，但沒有根本性的突破，尤其遺憾的是中藥治療哮喘離被國際認(rèn)可的距離很遠(yuǎn)，個案成功缺少普遍意義，急需尋找新的突破點(diǎn)。盡管有哮喘動物模型，但耗費(fèi)高、耗時(shí)長，且有種屬差異，而目前尚無好的體外研究模型，限制了藥物的高通量篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于PTEN(第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因)的治療哮喘藥物的模型或者方法。本發(fā)明提供了一種PTEN啟動子轉(zhuǎn)錄活性片段，該轉(zhuǎn)錄活性片段包括PTEN啟動子的-778至-1390區(qū)域，或者-1339至-2141區(qū)域。例如，該轉(zhuǎn)錄活性片段包括PTEN啟動子的-778至-2141區(qū)域。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)錄活性片段是PTEN啟動子的-778 至-1390區(qū)域；在另一個實(shí)施例中，是PTEN啟動子的-1339至-2141區(qū)域。所述的PTEN全稱是第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因 (phosphatase andtensin homo log deleted on chromosome ten),其詳細(xì)介紹可以參見 genbank數(shù)據(jù)庫NM 000314. 4、NP 000305. 3和Hs. 500466。PTEN啟動子介紹也可以參見 genbank數(shù)據(jù)庫上述鏈接。所述的轉(zhuǎn)錄活性片段，可以按照PTEN啟動子的-778至-1390區(qū)域、或者-1339 至-2141區(qū)域的序列，人工合成。本發(fā)明還提供了一種含有上述PTEN啟動子轉(zhuǎn)錄活性片段的熒光報(bào)告載體。所述的轉(zhuǎn)錄活性片段，可以先設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增獲得所述的轉(zhuǎn)錄活性片段；然后將該轉(zhuǎn)錄活性片段連接到熒光報(bào)告載體。其制備方法詳細(xì)包括以下步驟1)克隆了 PTEN的啟動子區(qū)域參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選取PTEN啟動子可能的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增。本發(fā)明選取PTEN啟動子的-778至-2141區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增(以ATG為+1)，擴(kuò)增的PTEN啟動子片段連到T載體上，送測序。將測序結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫上的PTEN理論序列比較，結(jié)果顯示成功克隆了 PTEN的啟動子區(qū)域。2)構(gòu)建了 3個含不同長度PTEN啟動子區(qū)域的熒光報(bào)告載體參考相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)PTEN啟動子的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)位點(diǎn)，將克隆的PTEN啟動子再細(xì)分為兩段1)-778至-1390區(qū)域；2)-1339至-2141區(qū)域。最終共構(gòu)建了 3段PTEN啟動子區(qū)域，分別為:1)-778至-1390區(qū)域；2)-1339至-2141區(qū)域；3)-778至-2141區(qū)域。分別將這三個片段連接到熒光報(bào)告載體pGL-3-basic上，將連接好的載體送測序，測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了 3個含不同長度PTEN啟動子區(qū)域的熒光報(bào)告載體。然后，通過對熒光報(bào)告基因表達(dá)的分析確定了 PTEN的啟動子的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域?qū)?gòu)建的含3個不同長度PTEN啟動子的熒光報(bào)告載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞(以PRL-CMV作為校正)，轉(zhuǎn)染后分析firefly熒光素酶和renilla熒光素酶的活性，以firefly/renilla的比值作為啟動子轉(zhuǎn)錄強(qiáng)弱的依據(jù)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示-778至-1390區(qū)域和-778至-2141區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性較高，而-1339至-2141區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性很低。通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)基本確定了 PTEN的啟動子的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域?yàn)?778至-1390區(qū)域。最后，可以利用Trichostatin A(TSA)進(jìn)行檢測將構(gòu)建的含PTEN-778至-2141 區(qū)域的熒光報(bào)告載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞(以PRL-CMV作為校正)，轉(zhuǎn)染Mhr后，給予 Trichostatin A(TSA)處理，結(jié)果Trichostatin A(TSA)對這段啟動子區(qū)域有上調(diào)作用。本發(fā)明構(gòu)建的含有PTEN啟動子轉(zhuǎn)錄活性片段的熒光報(bào)告載體，可以用做藥靶，篩選治療哮喘的藥物。 本發(fā)明的PTEN啟動子轉(zhuǎn)錄活性片段及其相應(yīng)的熒光報(bào)告載體還可以用于制備篩選治療哮喘的藥物的試劑盒。 哮喘是世界公認(rèn)的醫(yī)學(xué)難題，但是目前尚無好的體外研究模型，限制了藥物的高通量篩選。PTEN是最佳的哮喘治療靶點(diǎn)之一，利用人PTEN基因啟動子區(qū)構(gòu)建熒光報(bào)告載體建立哮喘研究的體外模型，可用于篩選治療哮喘的藥物。本發(fā)明提供了 PTEN啟動子轉(zhuǎn)錄活性片段，該轉(zhuǎn)錄活性片段包括PTEN啟動子的-778至-1390區(qū)域，或者-1339至-2141區(qū)域。 本發(fā)明利用建立含有PTEN基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性區(qū)的熒光報(bào)告載體，對大量單體進(jìn)行檢測， 能夠篩選出上調(diào)PTEN表達(dá)的單體，進(jìn)而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其治療哮喘的功能，為可能的臨床試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。


圖1是PTEN啟動子PCR電泳結(jié)果圖。圖2是熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖3是TSA上調(diào)PTEN啟動子的轉(zhuǎn)錄活性柱狀圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 人基因組DNA提取用天根生物的基因組抽提試劑盒抽提正常人全血基因組DNA，方法和步驟如下1)取200ul新鮮血液，加200ulGA溶液，徹底裂解細(xì)胞⑵加入20 μ 1蛋白酶K溶液，混勻；3)加200 μ 1緩沖液GB，充分顛倒混勻，56°C放置10分鐘；4)加200 μ 1無水乙醇， 充分顛倒混勻力)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中，12，OOOrpm( 13, 400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；6)向吸附柱 CB3中加入500 μ 1緩沖液⑶(12，000rpm( 13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；7)向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW，12，OOOrpm( 13, 400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；8)向吸附柱CB3 中加入500 μ 1漂洗液PW，12，OOOrpm( 13，400 Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液。9) 將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm( 13，400 Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱 CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200μ 1洗脫緩沖液ΤΒ，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm( 13，400Xg)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。實(shí)施例2 :ΡΤΕΝ啟動子區(qū)域1的克隆及熒光報(bào)告載體的構(gòu)建以抽提的正常人血基因組DNA作為模板，首先使用引物Fl和Rl用于擴(kuò)增PTEN啟動子-778至-2141區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為1. 3kbp左右，此區(qū)域?yàn)镻TEN-pomoter-l (如圖 1所示)，膠回收該片段。將得到的ΡΤΕΝ-pomoter-l片段用限制性內(nèi)切酶Bgl II和Kpn I 酶切，然后回收酶切產(chǎn)物。將pGL-3-basic載體用Bgl II和Kpn I進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。將回收的ΡΤΕΝ-pomoter-l酶切片段和pGL-3-basic載體片段在16°C下進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化后長出的菌落中隨機(jī)挑選了幾個菌落，用Fl和Rl引物做PCR驗(yàn)證。經(jīng)初步驗(yàn)證正確的克隆送去測序，最終將此載體命名為pGL3-PTEN-p0m0ter-l。引物 Fl :5，-GAAAGTACTTGGTATTTCCCACTCC-3，； (SEQ ID NO 1)引物 Rl :5，-GAAGATCTTAGTCCTGTCGGGTTT-3，(SEQ ID NO 2)。實(shí)施例3 :PTEN啟動子區(qū)域2的克隆及熒光報(bào)告載體的構(gòu)建以抽提的正常人血基因組DNA作為模板，引物F2和Rl用于擴(kuò)增PTEN啟動子-778至-1390區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為0. 6kb左右，此區(qū)域?yàn)镻TEN-pomoter-2 (如圖1所示)。 膠回收該片段，將得到的PTEN-pomoter-2片段用限制性內(nèi)切酶Bgl II和Kpn I酶切，然后回收酶切產(chǎn)物。將pGL-3-basic載體用Bgl II和Kpn I進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。將回收的PTEN-pomoter-2酶切片段和pGL-3-basic載體片段在16°C下進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化后長出的菌落中隨機(jī)挑選了幾個菌落，用F2和Rl引物做PCR驗(yàn)證。經(jīng)初步驗(yàn)證正確的克隆送去測序，最終將此載體命名為pGL3-PTEN-pomoter-2。弓I物 F2 :5'-GAAAGTACTTGGTATTTCCCACTCC-3'；引物 Rl 5'-GAAGATCTTAGTCCTGTCGGGTTT-3'。實(shí)施例4 :PTEN啟動子區(qū)域3的克隆及熒光報(bào)告載體的構(gòu)建將pGL3-PTEN-pomoter-l載體用Β ο I和Kpn I進(jìn)行雙酶切，回收酶切小片段 (-1339-2141)。將pGL-3-basic載體用Xho I和Kpn I進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。將回收的pGL3-PTEN-pomoter-l載體酶切小片段和pGL-3-basic載體酶切片段在16°C下進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化后長出的菌落中隨機(jī)挑選了幾個菌落，搖瓶培養(yǎng)后抽質(zhì)粒，用》10 I和Kpn I酶切驗(yàn)證。 經(jīng)初步驗(yàn)證正確的克隆送去測序，最終將此載體命名為pGL3-PTEN-p0m0ter-3。實(shí)施例5 :PTEN啟動子熒光報(bào)告載體的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)錄活性檢測將構(gòu)建的含3個不同長度PTEN啟動子的熒光報(bào)告載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞(以 PRL-SV40作為校正)，轉(zhuǎn)染后分析firefly熒光素酶和reni 1 Ia熒光素酶的活性，以 firefly/renilla的比值作為啟動子轉(zhuǎn)錄強(qiáng)弱的依據(jù)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示(圖2) :-778 至-1390區(qū)域和-778至-2141區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性較高，而-1339至-2141區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性很低。通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)基本確定了 PTEN的啟動子的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域?yàn)?778至-1390區(qū)域。實(shí)施例6 :PTEN啟動子熒光報(bào)告載體的驗(yàn)證選取已報(bào)道的能上調(diào)PTEN轉(zhuǎn)錄活性的化合物"Trichostatin A(TSA)對構(gòu)建的 PTEN啟動子熒光報(bào)告載體進(jìn)行驗(yàn)證。將構(gòu)建的pGL3-PTEN-p0m0ter-l的熒光報(bào)告載體轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞(以PRL-SV40作為校正)，轉(zhuǎn)染后分析firefly熒光素酶和reniIla熒光素酶的活性，以firefly/renilla的比值作為啟動子轉(zhuǎn)錄強(qiáng)弱的依據(jù)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示TSA能顯著上調(diào)PTEN啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(圖3)，與相關(guān)報(bào)道一致，證明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的PTEN啟動子報(bào)告基因體系是有效的。
權(quán)利要求
1.PTEN啟動子轉(zhuǎn)錄活性片段，其特征在于，該轉(zhuǎn)錄活性片段包括PTEN啟動子的-778 至-1390區(qū)域，或者-1339至-2141區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄活性片段，其特征在于，該轉(zhuǎn)錄活性片段是PTEN啟動子的-778至-2141區(qū)域。
3.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄活性片段的制備方法，其特征在于，按照PTEN啟動子的-778 至-1390區(qū)域、或者-1339至-2141區(qū)域的序列，人工合成。
4.一種熒光報(bào)告載體，其特征在于，該載體含有權(quán)利要求1所述的PTEN啟動子轉(zhuǎn)錄活性片段。
5.權(quán)利要求4所述的熒光報(bào)告載體的制備方法，其特征在于，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增獲得所述的轉(zhuǎn)錄活性片段；然后將該轉(zhuǎn)錄活性片段連接到熒光報(bào)告載體。
6.權(quán)利要求4所述的熒光報(bào)告載體的應(yīng)用，其特征在于，利用所述的熒光報(bào)告載體篩選治療哮喘的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及人PTEN基因的啟動子的克隆及應(yīng)用。本發(fā)明提供了PTEN啟動子轉(zhuǎn)錄活性片段，該轉(zhuǎn)錄活性片段包括PTEN啟動子的-778至-1390區(qū)域，或者-1339至-2141區(qū)域。本發(fā)明利用建立含有PTEN基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性區(qū)的熒光報(bào)告載體，對大量單體進(jìn)行檢測，能初步篩選出上調(diào)PTEN表達(dá)的單體，進(jìn)而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其治療哮喘的功能，本發(fā)明為臨床試驗(yàn)打下基礎(chǔ)，可用于篩選治療哮喘的藥物。
文檔編號C12Q1/68GK102465127SQ20111035565
公開日2012年5月23日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者倪振華, 王雄彪, 陳清閣 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院