專利名稱：一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖魚用滅活疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗，同時(shí)還涉及一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，還涉及一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗的用途。
背景技術(shù)：
斑點(diǎn)叉尾鮰(Channel catfish)于1984年從美國(guó)引進(jìn)至我國(guó)養(yǎng)殖以來，由于其營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美，深受國(guó)內(nèi)消費(fèi)者的歡迎，逐漸成為我國(guó)水產(chǎn)品出口的主要品種之一，目前已在全國(guó)20多個(gè)省市養(yǎng)殖。隨著我國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，集約化養(yǎng)殖程度的提高，疾病的危害也越來越大，特別是近年來不少地區(qū)魚種養(yǎng)殖場(chǎng)都發(fā)生了爆發(fā)性的出血病， 死亡率高達(dá)90%以上，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。通過病原學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，此病是由呼腸孤病毒引起。對(duì)于其防治措施，目前尚無有效藥物，疫苗免疫被公認(rèn)為是最有效的預(yù)防措施。滅活疫苗由于其安全性好，目前已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。然而傳統(tǒng)的滅活疫苗主要是采用福爾馬林滅活，由于福爾馬林對(duì)抗原成分有一定破壞作用，因而用其制備的滅活免疫效果較差且不穩(wěn)定。此外，其滅活時(shí)間長(zhǎng)，福爾馬林使用量大，殘留毒性不易去除等缺點(diǎn)，限制了其大規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用。β丙內(nèi)酯是一種雜環(huán)類化合物(C3H4O2),對(duì)病毒具有很強(qiáng)的滅活作用，其滅活機(jī)理為改變病毒基因組RNA的結(jié)構(gòu)達(dá)到滅活目的。大劑量β丙內(nèi)酯雖是一種致癌物，但極易水解，水解后形成人體脂肪代謝產(chǎn)物β-羥基丙酸，對(duì)魚體、人體無害。由于 β丙內(nèi)酯只作用于病毒RNA，對(duì)病毒蛋白無破壞作用，保持了抗原蛋白的完整性，所以β丙內(nèi)酯滅活疫苗的免疫效果好。
目前尚未見到斑點(diǎn)叉尾鮰出血病疫苗的相關(guān)報(bào)道，本發(fā)明首次提供一種高效、安全、可規(guī)模生產(chǎn)的斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗及其制備方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗，該疫苗含有完整的病毒抗原蛋白，不含滅活劑，效價(jià)為105TCID5(1/ml，免疫效果好。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗的制備方法，該方法僅使用0.025% (V/V)的滅活劑β丙內(nèi)酯于4°C滅活M小時(shí)即可達(dá)到完全滅活的目的。該方法簡(jiǎn)單快捷，滅活徹底，并且不破壞抗原蛋白的完整性。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是在于提供了一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗在制備治療或預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰出血病藥物中的應(yīng)用。應(yīng)用該疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚種進(jìn)行注射免疫時(shí)，其保護(hù)率達(dá)89 %，浸泡免疫的保護(hù)率達(dá)72.6%。
為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，其步驟是
A、CCK細(xì)胞培養(yǎng)取液氮中保存的CCK細(xì)胞，37°C溫育2 3分鐘融化，加入含10% (V/V)小牛血清的MEM培養(yǎng)液(5ml/T25培養(yǎng)瓶，pH7 7. 5)，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中25 30°C培養(yǎng)。靜置6 8小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)液。在細(xì)胞培養(yǎng)2 3天，鋪滿培養(yǎng)瓶底后， 采用0. 0.5% (W/V)的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。所述的MEM培養(yǎng)液為 Sigma-aldrich或Gibco或其它公司生產(chǎn)的Eagle，s MEM細(xì)胞培養(yǎng)液。
B、CCRV-730病毒培養(yǎng)與收獲待CCK傳代細(xì)胞在瓶底鋪滿時(shí)，去掉培養(yǎng)液，然后按 1/5的培養(yǎng)基體積加入感染的病毒懸液，病毒的感染復(fù)數(shù)MOI (Multiplicity of infection) 為1 5PFU/cell，在病毒吸附細(xì)胞40 60分鐘后，補(bǔ)加含2% (V/V)小牛血清的 MEM(pH7 7. 5)維持液進(jìn)行病毒增殖。在病毒感染48 72小時(shí)，細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)80% 時(shí)，收獲病毒，_80°C至室溫Q0-25°C，以下相同)凍融3次，3000rpm，4°C，離心10分鐘，取上清再5000rpm，4°C，離心30分鐘以去除游離的細(xì)胞碎片，上清即為純化的CCRV-730病毒液。CCRV-730病毒液置于-80°C保存?zhèn)溆?。所述的MEM培養(yǎng)液同步驟A—樣。
C、病毒滴度測(cè)定將待測(cè)病毒液進(jìn)行一系列10倍稀釋(ΙΟ—1 10_1(1)，按上述病毒增殖方法在96孔板上感染CCK細(xì)胞。在病毒感染48 72小時(shí)，觀察細(xì)胞病變情況。按 Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度TCID5(1。此病毒滴度即為滅活疫苗的效價(jià)。
D、CCRV-730病毒的滅活取保存于_80°C的CCRV-730純化病毒液于4°C融化， 按0.025% (V/V)的濃度加入保存于-20°C的滅活劑β丙內(nèi)酯(又稱3-羥基丙內(nèi)酯， β -Propiolactone, BPL)，迅速混勻后放置于4°C對(duì)病毒進(jìn)行滅活。滅活24h后，將滅活的病毒液置于37°C水浴鍋中孵育2小時(shí)以水解β丙內(nèi)酯。
Ε、將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水(0. 65% )稀釋至效價(jià)為105TCID5(1/ml，得到可直接使用的斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗。
本發(fā)明所用的病毒株為斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒CCRV-730株，已由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期是2011年10月21日，保藏編號(hào)是CCTCC NO :V201133。所述的滅活疫苗含有斑點(diǎn)叉尾鮰腎臟細(xì)胞系(channel catfish kidney，CCK)，CCTCC NO :C201198。
F、滅活疫苗的安全性檢驗(yàn)
滅活效果取上述制備好的疫苗，按上述病毒增殖的方法接種CCK細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，觀察5 6天，若出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，則表明病毒滅活不完全；若未見細(xì)胞病變效應(yīng)，再盲傳2次，若盲傳出現(xiàn)細(xì)胞病變，則表明病毒滅活仍不完全，若盲傳2次均未出現(xiàn)細(xì)胞病變，則表明病毒滅活完全，疫苗安全。
無菌檢驗(yàn)取上述制備好的疫苗，接種肉湯蛋白胨細(xì)菌培養(yǎng)瓊脂平板，涂平板后于 37°C培養(yǎng)15天，若有菌落生長(zhǎng)，則表明疫苗有細(xì)菌污染，需用0. 22 μ m濾膜過濾除菌后使用；若無菌落生長(zhǎng)，則表明疫苗是無菌的。
魚體實(shí)驗(yàn)取上述制備好的疫苗，注射健康斑點(diǎn)叉尾鮰30尾，注射劑量為0. 2ml/ 尾，同時(shí)注射魚用生理鹽水作為陰性對(duì)照。飼養(yǎng)15天，若疫苗組出現(xiàn)死亡，而陰性對(duì)照組未出現(xiàn)死亡，表明疫苗不安全；若疫苗組和陰性對(duì)照組均未見死亡，則表明疫苗安全。
G、滅活疫苗的最佳免疫劑量健康的斑點(diǎn)叉尾鮰魚種(體長(zhǎng)8 10cm)于室內(nèi)飼養(yǎng)10天后，分組每尾注射0. 2ml不同稀釋度的滅活疫苗，同時(shí)用MEM細(xì)胞培養(yǎng)液注射另一批魚做陰性對(duì)照飼養(yǎng)10 12天后，隨意從每組中取出一部分魚采血做血清中和試驗(yàn)，測(cè)定免疫魚與對(duì)照魚的血清中和抗體水平；將每組中的另一部分魚以強(qiáng)毒攻擊，測(cè)定其免疫保護(hù)率。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，每尾注射0. 2ml效價(jià)為105TCID5(l/ml的β丙內(nèi)酯滅活疫苗，其免疫效果最好，其中和抗體效價(jià)為1 1024;保護(hù)率高達(dá)89%。在較大規(guī)模的免疫保護(hù)效果測(cè)定試驗(yàn)中，用斑點(diǎn)叉尾鮰出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗(效價(jià)為105TCID5Q/ml)按每尾0. 05ml 的劑量浸泡免疫5萬尾斑點(diǎn)叉尾鮰魚種(規(guī)格4 6cm，另設(shè)對(duì)照組1萬尾，池塘水浸泡)， 正常飼養(yǎng)6個(gè)月后，免疫組成活率達(dá)到83 %，對(duì)照組成活率為38 %，相對(duì)免疫保護(hù)力達(dá)到 72.6%。表明用β丙內(nèi)酯滅活的細(xì)胞疫苗注射和浸泡途徑對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行免疫，均有很強(qiáng)的保護(hù)保護(hù)力，可以有效預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰出血病。
所述的一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗有如下特性
1.本疫苗對(duì)細(xì)胞、魚體不具感染力。
2.本疫苗含有CCRV-730病毒的全部蛋白。
3.本疫苗效價(jià)為105TCID5Q/ml。
4.本疫苗無菌、無滅活劑殘留。
5.本疫苗為紅色澄清液體，pH7 7. 5。
6.本疫苗只對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰出血病有效。
—-種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗在制備治療或預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰出血病藥物中的應(yīng)用，其步驟是
Α.浸泡免疫當(dāng)年斑點(diǎn)叉尾鮰魚種養(yǎng)至4 6cm時(shí)，可進(jìn)行浸泡免疫。將免疫魚置于2 3%的鹽水中高滲脫水2 3分鐘后，然后浸浴在含量104TCID5(l/ml的斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗液中10分鐘，或用尼龍袋充氧浸泡1 2小時(shí)。然后將魚種撈出放池塘飼養(yǎng)。
B.注射免疫當(dāng)年斑點(diǎn)叉尾鮰魚種養(yǎng)至8 IOcm時(shí)，可進(jìn)行注射免疫。采用腹腔或者背鰭基部注射的方法給予。每尾注射0. 2ml效價(jià)為105TCID5(l/ml的斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗后，放池塘飼養(yǎng)。條件允許的情況下，可在首次免疫后間隔一個(gè)月進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，免疫劑量不變，可獲得更高的保護(hù)率。
本發(fā)明與傳統(tǒng)滅活疫苗相比，具有以下主要優(yōu)點(diǎn)
1.制備方法簡(jiǎn)單快捷、操作方便，適于規(guī)?；可a(chǎn)和應(yīng)用。
2.疫苗抗原蛋白完整，免疫原性好，免疫保護(hù)力高。
3.疫苗滅活徹底，且滅活劑分解完全，不含有毒有害成分，安全性高。
4.可進(jìn)行浸泡和注射免疫。浸泡免疫的保護(hù)率達(dá)72.6%，注射免疫保護(hù)率達(dá) 89%。
5.具有商品化推廣價(jià)值，與免疫佐劑同時(shí)使用，可進(jìn)一步提供魚體免疫保護(hù)率。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒CCRV-730的制備方法，其步驟是
A. CCK細(xì)胞培養(yǎng)取液氮中保存的CCK細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室建立，CCTCC C201198)，37°C 溫育2 3分鐘融化，加入含10% (V/V)小牛血清的MEM培養(yǎng)液(5ml/%5培養(yǎng)瓶，pH7或 7. 2或7. 4或7.幻，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。靜置6或7或8小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)液。在細(xì)胞培養(yǎng)2或3天，鋪滿培養(yǎng)瓶底后，采用0.1% 0.5% (W/V)的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。所述的MEM培養(yǎng)液為Sigma-aldrich或Gibco或其它公司生產(chǎn)的fegle’ s MEM細(xì)胞培養(yǎng)液。
B. CCRV-730病毒培養(yǎng)與收獲待CCK傳代細(xì)胞在瓶底鋪滿時(shí)，去掉培養(yǎng)液，然后按 1/5的培養(yǎng)基體積加入感染的CCRV-730病毒懸液(本實(shí)驗(yàn)室分離，CCTCCV201133)，病毒的感染復(fù)數(shù) MOI (Multiplicity of infection)為 1 5PFU/cell，在病毒吸附細(xì)胞 40 或 45 或50或55或60分鐘后，補(bǔ)加含2% (V/V)小牛血清的MEM(pH7或7. 2或7. 4或7. 5)維持液進(jìn)行病毒增殖。所述的培養(yǎng)基同上。
C. CCRV-730病毒的收獲與純化在病毒感染48或56或64或72小時(shí)，細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)80%時(shí)，收獲病毒，-80°C至室溫凍融3次，3000rpm，4°C，離心10分鐘，取上清再 5000rpm，4°C，離心30分鐘以去除游離的細(xì)胞碎片。上清即為純化的CCRV-730病毒液。 CCRV-730病毒液置于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> D.病毒滴度測(cè)定將待測(cè)病毒懸液進(jìn)行一系列10倍稀釋(ΙΟ—1 10_1(1)，按上述病毒增殖方法在96孔板上感染CCK細(xì)胞。在病毒感染48或56或64或72小時(shí)，觀察細(xì)胞病變情況。按Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度TCID5Q。此病毒滴度即為滅活疫苗的效價(jià)。本發(fā)明所用的病毒株為斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒CCRV-730株，已由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期是2011年10月21日，保藏編號(hào)是CCTCC NO :V201133。本發(fā)明所用的斑點(diǎn)叉尾鮰腎臟細(xì)胞系(channel catfish kidney，CCK)為本實(shí)驗(yàn)室建立，已由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期是2011年10月21日，保藏編號(hào)是CCTCC NO :C201198。
實(shí)施例2
斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，其步驟是
A. CCRV-730病毒的滅活取保存于_80°C的CCRV-730純化病毒液于4°C融化，按 0. 025% (V/V)的濃度加入保存于-20°C的滅活劑β丙內(nèi)酯，迅速混勻后放置于4°C對(duì)病毒進(jìn)行滅活。滅活24h后，將滅活的病毒液置于37°C水浴鍋中孵育2小時(shí)以水解β丙內(nèi)酯。
B.將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水(0. 65% )稀釋至效價(jià)為105TCID5(1/ml，得到可供直接使用的斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)胞培養(yǎng)β丙內(nèi)酯滅活疫苗。
C.滅活疫苗的安全性檢驗(yàn)
1)滅活效果取上述制備好的疫苗，按上述病毒增殖的方法接種CCK細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，觀察5 6天，若出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，則表明病毒滅活不完全；若未見細(xì)胞病變效應(yīng)，再盲傳2次，若盲傳出現(xiàn)細(xì)胞病變，則表明病毒滅活仍不完全，若盲傳2次均未出現(xiàn)細(xì)胞病變，則表明病毒滅活完全，疫苗安全。
2)無菌檢驗(yàn)取上述制備好的疫苗，接種肉湯蛋白胨細(xì)菌培養(yǎng)瓊脂平板，涂平板后于37°C培養(yǎng)15天，若有菌落生長(zhǎng)，則表明疫苗有細(xì)菌污染，需用0. 22 μ m濾膜過濾除菌后使用；若無菌落生長(zhǎng)，則表明疫苗是無菌的。
3)魚體實(shí)驗(yàn)取上述制備好的疫苗，注射健康斑點(diǎn)叉尾鮰30尾，注射劑量為 0. aiil/尾，同時(shí)注射魚用生理鹽水作為陰性對(duì)照。飼養(yǎng)15天，若疫苗組出現(xiàn)死亡，而陰性對(duì)照組未出現(xiàn)死亡，表明疫苗不安全；若疫苗組和陰性對(duì)照組均未見死亡，則表明疫苗安全。
實(shí)施例3
斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗的保護(hù)效果評(píng)估，其具體步驟是
A.實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模實(shí)驗(yàn)健康的斑點(diǎn)叉尾鮰魚種(體長(zhǎng)8 IOcm)于室內(nèi)飼養(yǎng)10天后，分組每尾注射0. 2ml不同稀釋度的滅活疫苗，同時(shí)用MEM細(xì)胞培養(yǎng)液注射另一批魚做陰性對(duì)照飼養(yǎng)10 12天后，隨意從每組中取出一部分魚采血做血清中和試驗(yàn)，測(cè)定免6疫魚與對(duì)照魚的血清中和抗體水平；將每組中的另一部分魚以強(qiáng)毒攻擊，測(cè)定其免疫保護(hù)率。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，每尾注射0.2ml效價(jià)為105TCID5(1/ml的β丙內(nèi)酯滅活疫苗，其免疫效果最好，其中和抗體效價(jià)為1 1024;保護(hù)率高達(dá)89%。
B.大塘較大規(guī)模實(shí)驗(yàn)用斑點(diǎn)叉尾鮰出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗(效價(jià)為 105TCID5(1/ml)按每尾0. 05ml的劑量浸泡免疫5萬尾斑點(diǎn)叉尾鮰魚種(規(guī)格4 6cm，另設(shè)對(duì)照組1萬尾，池塘水浸泡)，正常飼養(yǎng)6個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)魚的成活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫組成活率達(dá)到83%，對(duì)照組成活率為38%，相對(duì)免疫保護(hù)力達(dá)到72. 6%。
以上兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用β丙內(nèi)酯滅活的斑點(diǎn)叉尾鮰出血病細(xì)胞疫苗以注射和浸泡途徑對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行免疫，均有很強(qiáng)的保護(hù)保護(hù)力，可以有效預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰出血病。
實(shí)施例4
一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗在制備治療或預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰出血病藥物中的應(yīng)用，其步驟是
Α.浸泡免疫當(dāng)年斑點(diǎn)叉尾鮰魚種養(yǎng)至4 6cm時(shí)，可進(jìn)行浸泡免疫。將免疫魚置于2 3%的鹽水中高滲脫水2 3分鐘后，然后浸浴在含量104TCID5(l/ml的斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗液中10分鐘，或用尼龍袋充氧浸泡1 2小時(shí)。然后將魚種撈出放池塘飼養(yǎng)。
B.注射免疫當(dāng)年斑點(diǎn)叉尾鮰魚種養(yǎng)至8 IOcm時(shí)，可進(jìn)行注射免疫。采用腹腔或者背鰭基部注射的方法給予。每尾注射0. 2ml效價(jià)為105TCID5(l/ml的斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗后，放池塘飼養(yǎng)。條件允許的情況下，可在首次免疫后間隔一個(gè)月進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，免疫劑量不變，可獲得更高的保護(hù)率。
權(quán)利要求
1.一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗，其特征在于斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒CCRV-730 株，CCTCC NO :V201133。
2.權(quán)利要求1所述的一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗，其特征在于所述的滅活疫苗含有斑點(diǎn)叉尾鮰腎臟細(xì)胞系(channel catfish kidney，CCK)，CCTCCNO :C201198。
3.權(quán)利要求1所述的一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，其步驟是A.CCK細(xì)胞培養(yǎng)取液氮中保存的CCK細(xì)胞，37°C溫育2 3分鐘融化，加入含10% V/ V小牛血清的MEM培養(yǎng)液5ml/%5培養(yǎng)瓶，pH7 7. 5，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中25 30°C培養(yǎng)，靜置6 8小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)2 3天，鋪滿培養(yǎng)瓶底后，采用 0. 0. 5% W/V的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；B.CCRV-730病毒培養(yǎng)與收獲待CCK傳代細(xì)胞在瓶底鋪滿時(shí)，去掉培養(yǎng)液，然后按1/5 的培養(yǎng)基體積加入感染的病毒懸液，病毒的感染復(fù)數(shù)MOI為1 5PFU/cell，在病毒吸附細(xì)胞40 60分鐘后，補(bǔ)加含2% V/V小牛血清的MEM :pH7 7. 5維持液進(jìn)行病毒增殖，在病毒感染48 72小時(shí)，收獲病毒，-80°C至室溫凍融3次，3000rpm，4°C，離心10分鐘，取上清再5000rpm，4°C，離心30分鐘以去除游離的細(xì)胞碎片，上清為純化的CCRV-730病毒液， CCRV-730病毒液置于-80°C保存?zhèn)溆?；C.病毒滴度測(cè)定將待測(cè)病毒液進(jìn)行10倍稀釋KT1 10Λ在96孔板上感染CCK細(xì)胞，在病毒感染48 72小時(shí)，按Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度TCID5tl，病毒滴度即為滅活疫苗的效價(jià)；D.CCRV-730病毒的滅活取保存于_80°C的CCRV-730純化病毒液于4°C融化，按 0.025% V/V的濃度加入保存于-20°C的滅活劑β丙內(nèi)酯，混勻后放置于4°C對(duì)病毒進(jìn)行滅活，滅活24h后，將滅活的病毒液置于37°C水浴鍋中孵育2小時(shí)以水解β丙內(nèi)酯；Ε、將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水稀釋至效價(jià)為105TCID5(l/ml，得到直接使用的斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗。
4.權(quán)利要求1所述的一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗在治療或預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰出血病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的滅活疫苗及制備方法和應(yīng)用，其步驟A、CCK細(xì)胞培養(yǎng)；B、CCRV-730病毒培養(yǎng)與收獲保存；C、病毒液滴度TCID50測(cè)定，此病毒滴度即為滅活疫苗的效價(jià)。D、CCRV-730病毒用β丙內(nèi)酯滅活，然后37℃孵育水解β丙內(nèi)酯；E、將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水稀釋至一定效價(jià)，得到可直接使用的斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗。本滅活疫苗是在預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰出血病中進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明不僅滅活效果好，而且最大限度地避免了滅活劑對(duì)抗原蛋白的破壞，具有較好的免疫效果。此外，消除了滅活劑自身的毒性，提高了疫苗的安全性。本疫苗具有免疫效果好、使用安全、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102526721SQ201110355780
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者周勇, 徐進(jìn), 曾令兵, 肖藝, 范玉頂 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所