專利名稱：用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基及其應(yīng)用；具體涉及一種利用化學(xué)合成培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)丁二酸且確定培養(yǎng)基中生物素的最小用量并用5-ALA取代生物素制備丁二酸。
背景技術(shù)：
微生物發(fā)酵所的合成培養(yǎng)基是通過順序加入準(zhǔn)確稱量的高純度化學(xué)試劑與蒸餾水配制而成的，其所含的成分(包括微量元素在內(nèi))以及它們的量都是確切可知的。合成培養(yǎng)基一般用于實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的營養(yǎng)、代謝、遺傳、鑒定和生物測定等定量要求較高的研究。產(chǎn)丁二酸微生物在利用合成培養(yǎng)基進(jìn)行丁二酸發(fā)酵生產(chǎn)的過程中，生物素作為有機(jī)氮源的主要成分對產(chǎn)丁二酸微生物的生長代謝起到了至關(guān)重要的作用?；瘜W(xué)合成培養(yǎng)基因其成分確定，培養(yǎng)基中無酵母粉、蛋白胨等復(fù)雜且昂貴的營養(yǎng)成分，因此有利于考察代謝途徑尚不明確的野生型產(chǎn)丁二酸菌株；此外，因化學(xué)合成培養(yǎng)基有部分無機(jī)鹽離子及幾種氨基酸和維生素組成，其培養(yǎng)基成本也比普通復(fù)合培養(yǎng)基成本低廉。利用化學(xué)合成培養(yǎng)基發(fā)酵制備的丁二酸，也為后期的分離節(jié)省了大部分成本。但至今為止還尚未對降低化學(xué)合成培養(yǎng)基成本生產(chǎn)丁二酸方面的研究報(bào)道，用于發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基的成本依舊昂貴。現(xiàn)有技術(shù)中，對產(chǎn)丁二酸菌株succinogenes UQl^WMannheimia succiniciproducens MBEL55E均已經(jīng)篩選出了化學(xué)合成培養(yǎng)基，但現(xiàn)有技術(shù)中的這幾款化學(xué)合成培養(yǎng)基因其成分復(fù)雜，還含有多種氨基酸、維生素及金屬鹽混合液，因此，現(xiàn)有技術(shù)未對用化學(xué)合成培養(yǎng)基工業(yè)化發(fā)酵制備丁二酸提供技術(shù)教導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的之一是確定并提供一種用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基的配方，該培養(yǎng)基配方可以優(yōu)化其中最昂貴的維生素——生物素用量，使其達(dá)到維持丁二酸正常發(fā)酵的最小值，減少不必要的浪費(fèi)；根據(jù)產(chǎn)丁二酸菌株的生長特性及代謝路徑特征， 最終找到替代生物素的物質(zhì)——5-ALA進(jìn)行發(fā)酵，擺脫在合成培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)丁二酸對昂貴維生素的依賴，可極大地降低丁二酸的生產(chǎn)成本，簡化后期分離工藝，為用化學(xué)合成培養(yǎng)基工業(yè)化生產(chǎn)丁二酸邁出了關(guān)鍵的步驟。本發(fā)明的另一個技術(shù)目的是提供一種產(chǎn)丁二酸微生物利用該化學(xué)合成培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。一、一種用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基，其常規(guī)組分包含分消的碳源10 90 g/L，富馬酸二鈉 1 3 g/L，KH2PO4 2 4 g/L,MgCl2*6H20 0. 2 0. 4 g/L, CaCl2 0. 2 0. 4 g/L, NaCl 1 2 g/L ；其特征在于還包含關(guān)鍵生長因子組分生物素10 20 mg/L或者 5-ALA 0. 1 1 mg/L,煙酸 25 40 mg/L,氨基酸 0. 87 1. 2 mg/L,蛋氨酸 0. 11 0. 22mg/L ；pH 7. 0，121°C 滅菌 15 min。進(jìn)一步地，所述的碳源包括但不限于葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖或秸稈經(jīng)過預(yù)處理后的混合糖。進(jìn)一步地，所述的化學(xué)合成培養(yǎng)基的常規(guī)組分還包含中和劑，所述的中和劑包括但不限于氫氧化鈉、碳酸氫鈉或氨水。二、利用本發(fā)明所述的用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基制備丁二酸的方法， 包括微生物菌種活化、種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)的步驟。進(jìn)一步地，所述的菌種活化步驟是菌種在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，在 37°C厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)對h。所述的種子培養(yǎng)步驟是活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)1(Γ12 h后作為種子液。所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟是將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為體積比5 10 %，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，CO2通氣量為0. 25 vvm。本發(fā)明所述的丁二酸產(chǎn)生菌包括現(xiàn)有技術(shù)中任何厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的微生物菌種，例如在本發(fā)明中選擇使用了產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，大腸桿菌，谷氨酸棒桿菌，或曼海姆氏產(chǎn)琥珀酸菌。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明確定并提供出了一種用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基的配方，該配方通過合理的技術(shù)手段確定了四種關(guān)鍵的丁二酸發(fā)酵的生長因子，培養(yǎng)基中無酵母粉、蛋白胨等復(fù)雜且昂貴的營養(yǎng)成分。該培養(yǎng)基配方還可以優(yōu)化其中最昂貴的維生素——生物素用量， 使其達(dá)到維持丁二酸正常發(fā)酵的最小值，減少不必要的浪費(fèi)；根據(jù)產(chǎn)丁二酸菌株的生長特性及代謝路徑特征，最終找到替代生物素的物質(zhì)——5-ALA進(jìn)行發(fā)酵，擺脫在合成培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)丁二酸對昂貴維生素的依賴，可極大地降低丁二酸的生產(chǎn)成本，簡化后期分離工藝， 為用化學(xué)合成培養(yǎng)基工業(yè)化生產(chǎn)丁二酸邁出了關(guān)鍵的步驟。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例對本發(fā)明做了詳細(xì)說明，但對本發(fā)明的應(yīng)用并無限制。實(shí)施例1
本發(fā)明所述的考察關(guān)鍵因子對丁二酸生產(chǎn)的影響可以使用現(xiàn)有技術(shù)中任何厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的微生物菌種。本實(shí)施例所采用的產(chǎn)丁二酸的微生物菌種為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌 NJ113 Uctinobacillus succinogenes NJ113)，該菌已申請專利并獲得授權(quán)，專利授權(quán)公告號為 CN100537744C。首先需在合成培養(yǎng)基上考察了各種氨基酸、維生素、金屬微量元素對菌體生長代謝影響的顯著性。具體操作和培養(yǎng)條件如下
①配制氨基酸混合液，在供試的18種氨基酸中，分別去除其中的一種氨基酸，配成適當(dāng)濃度(所述的適當(dāng)濃度是指其中溶解度最小的一種物質(zhì)完全溶解時的濃度)的不含這種氨基酸的其他17種氨基酸混合液，以及全部含有這18種氨基酸的混合液各100 mL,0. 22 Mffl無菌濾頭過濾除菌后備用，各種氨基酸在培養(yǎng)基中的含量見附表1。②配制維生素混合液，在供試的10種維生素中，按照①中的方法配成適當(dāng)濃度(所述的適當(dāng)濃度是指其中溶解度最小的一種物質(zhì)完全溶解時的濃度)的只含相應(yīng)9種維生素的混合液，及全部含有這10種維生素的混合液各100 mL,0. 22 Mm無菌濾頭過濾除菌后備用，各種維生素在培養(yǎng)基中的含量見附表1。③配制金屬微量元素混合液，在供試的12種金屬鹽中，按照①中的方法配成適當(dāng)濃度(所述的適當(dāng)濃度是指其中溶解度最小的一種物質(zhì)完全溶解時的濃度)的只含相應(yīng)11 種金屬鹽的混合液，及全部含有這12種金屬鹽的混合液各100 mL, 121°C滅菌15 min后備用，各種金屬鹽在培養(yǎng)基中的含量見附表1。各階段發(fā)酵條件如下
菌種活化菌種在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，在37°C厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)Mh。種子培養(yǎng)活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)1(T12 h后作為種子液。發(fā)酵罐培養(yǎng)將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為10 %，ν/ v(體積比)，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，CO2通氣量為0. 25 vvm。斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏 5，NaHC03 10，NaH2PO4CH2O 9.6, K2HPO4·3Η20 15. 5，瓊脂 20，ρΗ 7· 0，121 °C滅菌 15 min。種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏 5，NaHC03 10，NaH2PO4CH2O 9.6, K2HPO4·3Η20 15. 5, ρΗ 7· 0，121 °C滅菌 15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基常規(guī)組分部分(g/L)葡萄糖90 (分消)，富馬酸二鈉1，KH2P04 2， MgCl2·6Η20 0.2，CaCl2 0. 2，NaCl 1，ρΗ 7.0,121 °C滅菌 15 min。中和劑采用碳酸鈉。在100 mL血清瓶中，加入22 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)過無菌水洗滌的Acthwbacillus succinogenes NJ113(CGMCC 1716)種子液1 mL，121°C滅菌15 min后向其中添加不含某種氨基酸的相應(yīng)備用混合液4 mL，添加0.5 mL含有全部維生素和1 mL含有全部金屬鹽的相應(yīng)備用混合液，已滅菌的600 g/L葡萄糖溶液1.5 mL，使接種后總體積達(dá)到20 mL，葡萄糖濃度為30 g/L。用同樣的方法配制缺少某一種維生素或某一種金屬鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基。將上述培養(yǎng)基在下述條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
搖床轉(zhuǎn)速200 rpm,37 ！發(fā)酵培養(yǎng)30h后檢測發(fā)酵液中丁二酸含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中缺少谷氨酸、生物素、煙酸、蛋氨酸時，菌體生長情況較差，葡萄糖有大量剩余，丁二酸產(chǎn)量很低，結(jié)果如表1所示。
表1缺少生長因子的發(fā)酵效果
權(quán)利要求
1.一種用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基，其常規(guī)組分包含分消的碳源10 90 g/ L,富馬酸二鈉 1 3 g/L, KH2PO4 2 4 g/L，MgCl2·6Η20 0· 2 0· 4 g/L, CaCl2 0· 2 0· 4 g/L，NaCl 1 2 g/L ；其特征在于還包含關(guān)鍵生長因子組分生物素10 20 mg/L或者 5-ALA 0. 1 1 mg/L,煙酸 25 40 mg/L,氨基酸 0. 87 1. 2 mg/L,蛋氨酸 0. 11 0. 22 mg/L ；pH 7. 0，121°C 滅菌 15 min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基，其特征在于所述的碳源是葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖或秸稈經(jīng)過預(yù)處理后的混合糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基，其特征在于所述的化學(xué)合成培養(yǎng)基的常規(guī)組分還包含中和劑，所述的中和劑是氫氧化鈉、碳酸氫鈉或氨水。
4.利用權(quán)利要求1所述的用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基制備丁二酸的方法，包括微生物菌種活化、種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)的步驟。
5.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的菌種活化步驟是菌種在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，在37°C厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)M h。
6.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)步驟是活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)10 12 h后作為種子液。
7.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟是將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為體積比5 10 %，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm, 37°C發(fā)酵培養(yǎng)，CO2通氣量為0. 25 vvm0
8.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的微生物是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌， 大腸桿菌，谷氨酸棒桿菌，或曼海姆氏產(chǎn)琥珀酸菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基包含常規(guī)組分和關(guān)鍵生長因子組分，所述的關(guān)鍵生長因子組分包括生物素或者5-ALA，煙酸，氨基酸，蛋氨酸。該配方通過合理的技術(shù)手段確定了四種關(guān)鍵的丁二酸發(fā)酵的生長因子，培養(yǎng)基中無酵母粉、蛋白胨等復(fù)雜且昂貴的營養(yǎng)成分。還擺脫在合成培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)丁二酸對昂貴維生素的依賴，可極大地降低丁二酸的生產(chǎn)成本，簡化后期分離工藝，為用化學(xué)合成培養(yǎng)基工業(yè)化生產(chǎn)丁二酸邁出了關(guān)鍵的步驟。
文檔編號C12R1/01GK102352384SQ20111035617
公開日2012年2月15日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者奚永蘭, 姜岷, 張九花, 徐蓉, 戴文宇, 陳可泉, 韋萍 申請人:南京工業(yè)大學(xué)